李佳藝 游雪葉 葉煌陽 張映紅

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院廈門市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建 廈門 361000)

三陰乳腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中ER-α36、EpCAM、Sox2的表達(dá)及臨床意義

李佳藝 游雪葉1葉煌陽 張映紅

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院廈門市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建 廈門 361000)

目的探討雌激素受體(ER)-α36、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、性別決定區(qū)Y框蛋白(Sox)2在三陰乳腺癌(TNBC)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及臨床意義。方法TNBC患者的石蠟標(biāo)本62例，其中48例有對(duì)應(yīng)的術(shù)后轉(zhuǎn)移灶石蠟標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ER-α36、EpCAM、Sox2在48例TNBC原發(fā)灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，分析ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表達(dá)與TNBC患者臨床病理特征的關(guān)系，并且分析TNBC組織中ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白之間的關(guān)系。結(jié)果在TNBC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中ER-α36、Sox2的高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EpCAM的高表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNBC組織中，ER-α36的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，EpCAM的高表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分期有關(guān)(P<0.05)，而Sox2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤TNM分期有關(guān)(P<0.05)，EpCAM與Sox2的表達(dá)存在正相關(guān)性(r=0.790，P<0.05)。結(jié)論ER-α36和Sox2的高表達(dá)提示著TNBC的高侵襲性，且EpCAM與Sox2在TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著協(xié)同作用，ER-α36、EpCAM、Sox2均可作為TNBC侵襲轉(zhuǎn)移的潛在分子治療靶標(biāo)。

三陰乳腺癌；雌激素受體-α36；上皮細(xì)胞黏附分子；性別決定性Y框蛋白；轉(zhuǎn)移

三陰乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)2均表達(dá)陰性的乳腺癌，其惡性程度高，易轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差。因其ER表達(dá)陰性，TNBC患者并不能受益于內(nèi)分泌治療，而針對(duì)HER2的靶向治療在TNBC患者的治療中也無法發(fā)揮作用〔1〕。ER-α36發(fā)揮著與ER-α截然不同的生理效應(yīng)，在TNBC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、內(nèi)分泌及化療耐藥中發(fā)揮著重要功能〔2〕。上皮細(xì)胞黏附分子(Sox)2是一種與性別決定區(qū)Y(SRY)蛋白相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，兩者在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔3〕。EpCAM及Sox2屬于腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，在正常乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)并不表達(dá)，在不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)也各有差異。以上三者在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮著重要功能，但目前關(guān)于ER-α36、EpCAM以及Sox2在TNBC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)差異的研究尚少，本研究旨在探討ER-α36、EpCAM、Sox2 在TNBC患者原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1對(duì)象 收集1996年3月至2015年9月入住廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院的TNBC患者的石蠟標(biāo)本62例，均經(jīng)病理組織學(xué)確診，其中48例有對(duì)應(yīng)的術(shù)后轉(zhuǎn)移灶石蠟標(biāo)本。患者均有完整的病歷資料，知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2試劑與方法 兔抗人ER-α36抗體(CY1109，北京四正柏生物科技有限公司)，鼠抗人EpCAM單克隆抗體(AUA1，ab20160，美國Abcam公司)；鼠抗人Sox2單克隆抗體(E4，sc365823，Santa Cruz公司)；SP試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。試驗(yàn)標(biāo)本均用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片。石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，微波修復(fù)抗原，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加ER-α36、EpCAM、Sox2一抗工作液，37℃孵育2 h，PBS洗滌后，滴加生物素二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌后，DAB顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。以PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定 ER-α36染色定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，EpCAM染色定位在細(xì)胞膜，Sox2染色定位在細(xì)胞核。采用Mathew〔4〕積分法進(jìn)行結(jié)果判斷。每例標(biāo)本均選擇10個(gè)含有陽性細(xì)胞的高倍視野(×400)分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其平均值計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。按陽性細(xì)胞百分率判定：無陽性細(xì)胞為0分；≤25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。按染色程度判定：無陽性著色為0分；淺黃色為1分；深黃色為2分；棕黃色為3分。染色指數(shù)為陽性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度之和：最小值0分，最大值6分。在統(tǒng)計(jì)分析中，將>3分判定為高表達(dá)；≤3分定為低表達(dá)或陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白在TNBC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá) ER-α36定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，EpCAM定位于細(xì)胞膜，Sox2定位于細(xì)胞核，均呈現(xiàn)棕黃色顆粒。ER-α36在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的高表達(dá)率分別為56.25%和77.08%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.688，P=0.030)；EpCAM分別為72.92%和75.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.740，P=0.053)；Sox2分別為52.08%和79.17%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.804，P=0.005)。在48例患者中，有16例ER-α36在原發(fā)灶中低表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移灶中為高表達(dá)；有12例EpCAM在原發(fā)灶中低表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移灶中為高表達(dá)；有18例Sox2在原發(fā)灶中低表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移灶中為高表達(dá)。見圖1。

2.2ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系 TNBC患者的ER-α36蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、組織學(xué)分期、TNM分期無關(guān)(P>0.05)；TNBC患者的EpCAM蛋白表達(dá)與組織學(xué)分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無關(guān)(P>0.05)；TNBC患者的Sox2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、組織學(xué)分期無關(guān)(P>0.05)。見表1。

圖1 TNBC組織中ER-α36、EpCAM、Sox2的免疫組化染色結(jié)果(×400)

表1 ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3TNBC組織中ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白的關(guān)系 在TNBC組織中，ER-α36與EpCAM、Sox2的表達(dá)均不具有相關(guān)性(r=0.352，0.455；P=0.324，0.273)。但EpCAM與Sox2的表達(dá)在TNBC組織中存在正相關(guān)性(r=0.790，P=0.000)，兩者在TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著協(xié)同作用。Sox2低表達(dá)，EpCAM低表達(dá)11例，高表達(dá)12例；Sox2高表達(dá)，EpCAM低表達(dá)2例，高表達(dá)23例。

3 討 論

TNBC占乳腺癌患者的30%左右，這部分患者并不能受益于內(nèi)分泌治療(如三苯氧胺，他莫昔芬等)和HER2靶向治療(如曲妥珠單抗等)，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是TNBC患者預(yù)后差的主要原因〔5〕。

ER屬于配體依賴的核受體，能夠介導(dǎo)大部分的雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前發(fā)現(xiàn)的人類ER主要分為兩個(gè)亞型：ER-α與ER-β，其中ER-α主要表達(dá)于乳腺和子宮組織中，針對(duì)ER-α設(shè)計(jì)的內(nèi)分泌治療藥物，在乳腺癌患者的臨床治療中起到了非常好的治療效果，ER-α的表達(dá)水平是預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療療效和預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)。ER-α36是ER-α的一個(gè)分子量為36 kD的亞型，研究發(fā)現(xiàn)，ER-α36在乳腺癌的腫瘤形成、侵襲轉(zhuǎn)移以及內(nèi)分泌耐藥中均發(fā)揮著重要的功能〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，在MCF-7乳腺癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)ER-α36能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)，在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞內(nèi)敲除ER-α36的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力〔8〕。本研究結(jié)果說明ER-α36的高表達(dá)促進(jìn)了TNBC的轉(zhuǎn)移。

EpCAM是一種腫瘤相關(guān)抗原，在多種上皮腫瘤中過量表達(dá)，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌等，在德國EpCAM單克隆抗體(17-1A，edrecolomab)已被批準(zhǔn)許可用于直腸癌的術(shù)后輔助化療〔9〕，目前已研制出含有edrecolomab的癌癥疫苗IGN-101〔10〕。EpCAM除了具有黏附分子的功能外，還參與了細(xì)胞增殖分化、遷移和免疫逃逸等多種生理活動(dòng)。Soysal等〔11〕檢測(cè)了1 365例乳腺癌樣本中EpCAM的表達(dá)水平，其過表達(dá)率為48%，其中TNBC樣本中的過表達(dá)率為63.8%。本研究中，EpCAM的高表達(dá)率與組織分型有關(guān)，且TNBC患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中EpCAM的高表達(dá)率分別為72.92%和75.00%，兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了正常乳腺癌組織，仍然能夠受益于EpCAM單克隆抗體17-1A〔9〕。

轉(zhuǎn)錄因子Sox2屬于Sox基因家族，是維持干細(xì)胞特性的關(guān)鍵因子，與多種腫瘤的形成密切相關(guān)。在卵巢癌〔12〕、侵襲性神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔13〕中，Sox2促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，屬于原癌基因，但在胃癌中，Sox2的表達(dá)下調(diào)，又扮演了抑癌基因的角色〔14〕。Sox2并不在人正常乳腺組織中表達(dá)，在各種乳腺癌亞型中的表達(dá)也存在差異，Zheng等〔15〕的Meta分析結(jié)果顯示，Sox2在乳腺癌的表達(dá)率為38.18%。本研究中，Sox2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期關(guān)系密切，Sox2在TNBC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的高表達(dá)率分別為52.08%和79.17%，說明Sox2的高表達(dá)促進(jìn)了TNBC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可以作為預(yù)測(cè)TNBC侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的參考指標(biāo)。

此外，本研究中發(fā)現(xiàn)EpCAM與Sox2在TNBC組織中的表達(dá)存在相關(guān)性。Lin等〔16〕發(fā)現(xiàn)中EpCAM可以上調(diào)Sox2的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的形成。Abd-El-Magsoud等〔17〕檢測(cè)145例乳腺癌組織中EpCAM與Sox2的表達(dá)水平，證實(shí)EpCAM與Sox2之間存在著正相關(guān)性，與本研究的結(jié)果相符，EpCAM與Sox2可能在TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著協(xié)同作用。

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〔2017-04-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(No.2012-2-77)

張映紅(1958-)，女，主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤規(guī)范化診療研究。

李佳藝(1977-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤規(guī)范化診治、乳腺癌復(fù)發(fā)、耐藥機(jī)制研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4190-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.009

1 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科