蔣雋舒，葉盛開，孫曉紅，杜 楠，涂作玉，戴永國，陳海英，呂 莉

(1. 解放軍第210醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116021; 2. 大連市第三人民醫(yī)院 科教科，遼寧 大連 116033； 3. 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

論 著

DPP-4抑制劑沙格列汀對2型糖尿病大鼠腎損傷的保護作用

蔣雋舒1,2，葉盛開1，孫曉紅1，杜 楠3，涂作玉3，戴永國3，陳海英1，呂 莉3

(1. 解放軍第210醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116021; 2. 大連市第三人民醫(yī)院 科教科，遼寧 大連 116033； 3. 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

目的 研究二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑沙格列汀對2型糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用并探討其作用機制。 方法 將30只雄性SD大鼠，隨機分成3組(每組10只)：正常對照組(NC組)、2型糖尿病模型組(T2DM組)、模型+沙格列汀1.0 mg/kg治療組(Sax組)。NC組大鼠飼以普通飼料；T2DM組及Sax組大鼠以高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)造2型糖尿病大鼠模型；Sax組大鼠每日1次灌胃給予沙格列汀1.0 mg/kg，NC組和T2DM組灌胃給予等容量生理鹽水，連續(xù)給藥12周后實驗終止。記錄大鼠體重，測定24 h攝食量、飲水量和24 h尿量；檢測空腹血糖(GLU)，血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平；采用流式細胞術(shù)檢測外周血T淋巴細胞亞群水平；取腎臟組織行HE染色觀察腎組織病理學(xué)變化，免疫組化檢測腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β(TFG-β)的表達水平；Western blot檢測腎組織NF-κB p65、COX-2的蛋白表達水平，RT-PCR檢測TNF-α、IL-6、FoxO1的mRNA表達水平。 結(jié)果 Sax組與T2DM組大鼠相比，GLU、TG、TC和LDL水平明顯降低(P<0.05)，HDL水平明顯升高(P<0.05)；大鼠飲水量、體重明顯降低(P<0.05)； Sax組較T2DM模型組大鼠腎小球腫脹、炎性浸潤現(xiàn)象明顯緩解，TFG-β表達水平降低(P<0.05)；外周血T淋巴細胞亞群水平的失衡明顯改善(P<0.05)；下調(diào)炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、FoxO1的mRNA表達水平及NF-κB p65、COX-2的蛋白表達水平(P<0.05)。 結(jié)論 DPP-4抑制劑沙格列汀具有保護大鼠2型糖尿病腎損害作用，其作用機制可能為抑制炎癥的發(fā)生及參與免疫調(diào)節(jié)。

DPP-4抑制劑；沙格列??；2型糖尿病腎病；腎損傷；免疫調(diào)節(jié)

糖尿病的并發(fā)癥累及心、腦、眼、腎、皮膚、血管及神經(jīng)系統(tǒng)等多組織和器官，而糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)則是糖尿病患者最主要的死亡原因之一[1]。因此，積極尋找糖尿病腎病的發(fā)病機制，早期干預(yù)糖尿病腎病的進展意義重大。代謝異常、血流動力學(xué)紊亂、遺傳因素以及炎癥環(huán)境和氧化應(yīng)激相互作用，促進了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，其中，免疫介導(dǎo)的炎癥在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-3]。

二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑，是一種基于腸促胰素的新型口服降糖藥物，其通過抑制DPP-4的活性，減少腸促胰素的降解，使腸促胰素的水平及活性增高，進而促進胰島素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌以及抑制腸道分泌脂蛋白、延遲胃排空、促進胰島β細胞再生而治療糖尿病[4-5]。已有研究證實DPP-4抑制劑具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用[6]。本研究旨在探討DPP-4抑制劑沙格列汀對2型糖尿病大鼠腎臟的保護作用，并初步探討其保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物及試劑

沙格列汀片(安立澤，saxagliptin，5 mg/片)，中美上海施寶貴制藥有限制藥公司產(chǎn)品。鏈脲佐菌素(STZ)，安徽Biosharp公司產(chǎn)品；破膜劑、固定劑、佛波酯[TPA、RBC Lysing buffer(10×)]，北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；CD4 PerCP-eFluor 710抗體、Foxp3 FITC 25 抗體、CD25 PE-cys 抗體，eBioscience公司產(chǎn)品；一抗NF-κB p65、COX-2、GAPDH，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RNAiso Plus、PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)，大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 動 物

SD大鼠，雄性，6周齡，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，SPF級，許可證號SCXK(遼)2013-0003。培養(yǎng)條件：濕度(55±10)%，室溫(22±1)℃，12 h光照，水和鼠糧充足。

1.1.3 儀 器

SCP7OH低溫超速離心機，日本HITACHI公司產(chǎn)品；Thermo-354酶標(biāo)儀，美國ThermoFisher scientific公司產(chǎn)品；組織分散機，德國IKA公司產(chǎn)品；蛋白轉(zhuǎn)印儀，美國Bio-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，UVP Multispectral Imaging System產(chǎn)品；AU640全自動生化分析儀，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；BD FACSCalibur Flow Cytometer，美國BD公司產(chǎn)品；血糖儀、血糖試紙，均為德國羅氏診斷有限公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 分組及給藥：30只SD大鼠適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)1周后隨機分成3組(每組10只)：正常對照組(NC組)、2型糖尿病模型組(T2DM組)、模型+沙格列汀1.0 mg/kg治療組(Sax組)。 NC組大鼠喂以普通飼料，T2DM組及Sax組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后，T2DM組及Sax組大鼠按采用高脂飲食聯(lián)合STZ復(fù)制2型糖尿病大鼠模型。Sax組大鼠每日1次灌胃給予沙格列汀1.0 mg/kg，NC組和T2DM組大鼠灌胃給予等容量生理鹽水，連續(xù)給藥12周后實驗終止。

1.2.2 2型糖尿病大鼠模型的建立:采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)復(fù)制2型糖尿病大鼠模型。大鼠以高脂飼料(高脂飼料配方：膽固醇2%，豬油10%，蛋黃粉8.3%，奶粉13.7%，基礎(chǔ)飼料66.0%)喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后禁食12 h，用新鮮配制的0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.5)配置1% STZ，以單次腹腔注射STZ 55.0 mg/kg誘導(dǎo)建立2型糖尿病大鼠模型，注射后自由攝食進水。72 h后尾靜脈采血測空腹血糖，空腹血糖≥16.4 mmol/L者確定為模型建立成功，納入實驗[7]。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 體重、食物攝取量、飲水量、尿量和血糖水平的測定：實驗開始后每隔1天測量大鼠體重1次，記錄體重數(shù)據(jù)；給藥12周實驗終止時，尾靜脈采血于羅氏血糖儀中測空腹血糖；用代謝籠收集大鼠24 h尿液及隨機尿液，記錄尿量并測定尿蛋白(UAE)含量；測定24 h攝食量、飲水量，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 樣本采集：連續(xù)給藥至12周后，大鼠禁食12 h，吸入乙醚麻醉，自腹主動脈取血，4 ℃過夜，3000 r/min離心10 min分離血清，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∧I臟組織，采用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片，切片厚度4～5 μm，室溫保存；用于勻漿及免疫印跡法的腎臟組織置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.3 生化指標(biāo)的測定：取血清樣本在全自動生化分析儀中測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平。

1.3.4 腎組織病理學(xué)觀察：將腎臟組織切片進行HE染色，于顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變情況。

1.3.5 腎組織TFG-β表達水平：采用SP法，按試劑盒操作方法將腎組織切片進行免疫組化檢測，光鏡下隨機選取5個高倍視野，觀察并評分。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細胞數(shù)≤25%、25%～50%、51%～75%及>75%分別記為1分、2分、3分及4分，細胞漿無色、淡黃色、棕黃色及棕褐色分別記為0分、1分、2分及3分，二者相乘為最終評分。

1.3.6 外周血T淋巴細胞亞群(Tregs)水平：大鼠禁食12 h后眼眥取血200 μL抗凝血于EP管中，按試劑盒操作方法分別標(biāo)記CD25及CD4，加入FoxP3，于流式細胞儀中檢測，圈定CD4陽性細胞群后，計算細胞中CD25和Foxp3雙陽性細胞表達率。

1.3.7 腎組織NF-κB p65、COX-2的蛋白表達水平：取腎皮質(zhì)組織，提取蛋白，按試劑盒操作，采用Western blot法檢測NF-κB p65、COX-2的蛋白表達水平。

1.3.8 腎組織TNF-α、IL-6和FoxO1的mRNA表達水平：取各組腎臟皮質(zhì)部分提取總RNA后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按試劑盒操作，采用RT-PCR法檢測TNF-α、IL-6和FoxO1的mRNA 表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，檢驗方法為SNK法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 沙格列汀對糖尿病大鼠攝食量、飲水量、尿量的影響

如表1所示，與NC組相比，T2DM組大鼠的攝食量、飲水量及尿量均增多(P<0.01)；Sax組較T2DM組攝食量、飲水量及尿量顯著降低(P<0.05)，但仍較NC組增多(P<0.01)。

表1 沙格列汀對糖尿病大鼠攝食量、飲水量、尿量的影響

組別動物數(shù) 攝食量(g) 飲水量(mL) 尿量(mL)NC組108.34±1.9211.00±2.526.62±1.68T2DM組1026.81±11.151)55.55±6.111)61.15±10.231)Sax組1022.82±9.301)2)34.75±14.891)2)45.10±12.661)2)

1)與NC組比較，P<0.01；2)與T2DM組比較，P<0.05

2.2 沙格列汀對糖尿病大鼠血糖、血脂水平的影響

如表2所示，與NC組相比，T2DM組大鼠的GLU、TC、TG、LDL明顯升高，而HDL降低(P<0.01)。Sax組較T2DM組GLU、TC、TG顯著降低，而HDL增高(P<0.05)，且與NC組相比無明顯差異。

表2 沙格列汀對糖尿病大鼠血糖、血脂水平的影響

組別動物數(shù)GLU(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L) LDL(mmol/L) HDL(mmol/L)NC組104.27±0.312.02±0.410.96±0.120.47±0.122.39±0.08T2DM組1025.33±2.521)5.86±1.281)1.53±0.151)0.98±0.161)1.98±0.161)Sax組106.67±1.532)2.50±1.382)0.88±0.132)0.92±0.262.23±0.102)

1)與NC組比較，P<0.01；2)與T2DM組比較，P<0.05

2.3 沙格列汀對糖尿病大鼠腎功能的影響

如表3所示，與NC組相比，T2DM組大鼠的體重、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)的水平明顯增高(P<0.05)，Sax組較T2DM組Cr和BUN水平明顯降低(P<0.05)，且與NC組相比體重、Cr和BUN水平無統(tǒng)計學(xué)差異。

表3 沙格列汀對糖尿病大鼠血Cr、BUN水平的影響

組別動物數(shù) 體重 (g) Cr(μmol/L) BUN(mmol/L)NC組10365.00±44.3453.33±12.473.50±0.41T2DM組10459.44±97.381)99.87±8.161)6.07±0.731)Sax組10468.80±73.6956.67±12.472)3.48±0.422)

1)與NC組比較，P<0.05；2)與T2DM組比較，P<0.05

2.4 沙格列汀對糖尿病大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響

由圖1可見，NC組腎小管和腎小管間質(zhì)未見異常；T2DM組腎小球見明顯腫脹，系膜區(qū)增寬；Sax組較T2DM組腎小球體積略小，較NC組無明顯差異。

2.5 沙格列汀對糖尿病大鼠腎組織TFG-β表達水平的影響

由表4、圖2可見，腎組織免疫組化結(jié)果顯示，與NC組相比，T2DM組腎小管內(nèi)TFG-β陽性表達顯著增加(P<0.05)；Sax組較T2DM組TFG-β陽性表達減少(P<0.05)，且與NC組TFG-β陽性表達無統(tǒng)計學(xué)差異。

表4 沙格列汀對糖尿病大鼠腎組織TFG-β表達水平的影響

Tab 4 Effects of Saxagliptin on TFG-β expression in diabetic rats (±s)

1)與NC組比較，P<0.05；2)與T2DM組比較，P<0.05

圖2 各組腎組織TFG-β免疫組化染色(×200) Fig 2 TFG-β expression in renal tissue in three groups with immunohistochemistry(×200)

2.6 沙格列汀對糖尿病大鼠外周血T淋巴細胞亞群表達水平的影響

由表5、圖3可見，與NC組相比，T2DM組CD4+CD25+Foxp3+表達水平顯著降低(P<0.05)；Sax組較T2DM組CD4+CD25+Foxp3+表達水平顯著升高(P<0.05)，與NC組無明顯差異。

表5 沙格列汀對糖尿病大鼠外周血T淋巴細胞亞群表達水平的影響

Tab 5 Effects of Saxagliptin on regulatory T cells levels in diabetic rats (±s)

1)與NC組比較，P<0.05；2)與T2DM組比較，P<0.05

2.7 沙格列汀對糖尿病大鼠腎組織中NF-κB p65和COX-2表達水平的影響

由圖4可見，與NC組相比，T2DM組NF-κB p65和COX-2蛋白表達增高(P<0.05)；而Sax組較T2DM組NF-κB p65和COX-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，且與NC組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖3 各組外周血T淋巴細胞亞群(regulatory T cells，Tregs)水平Fig 3 Regulatory T cells levels in three groups

*與NC組比較，P<0.05；**與T2DM組比較，P<0.05圖4 各組腎臟組織中NF-κB p65和COX-2蛋白表達水平Fig 4 The protein expression level of NF-κB p65 and COX-2 in three groups

2.8 沙格列汀對糖尿病大鼠腎組織中TNF-α、IL-6和FoxO1 mRNA表達水平的影響

由圖5可見，與NC組相比，T2DM組TNF-α、IL-6和FoxO1 mRNA表達上調(diào)(P<0.05)；而Sax組較T2DM組mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，且與NC組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者腎臟組織損傷和腎功能性下降與腎臟炎癥細胞的浸潤有關(guān)[8]，表明免疫介導(dǎo)的炎癥在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，應(yīng)用免疫抑制劑或中和抗體可以減輕糖尿病腎臟淋巴細胞的浸潤和激活，延緩腎臟損傷[9]，因此早期干預(yù)炎癥反應(yīng)，可能會延緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。

2型糖尿病發(fā)病過程中伴有糖代謝、脂代謝及腎臟功能紊亂[10]。本研究結(jié)果顯示，沙格列汀可減輕多飲、多食、多尿癥狀；明顯降低GLU、TG、TC、LDL水平，而升高HDL水平；降低血Cr和BUN水平，減輕2型糖尿病腎病的病理性改變。表明DPP-4抑制劑沙格列汀可通過改善糖代謝、脂代謝水平和腎臟功能而減緩2型糖尿病腎病的病程發(fā)展。

*與NC組比較，P<0.05；**與T2DM組比較，P<0.05圖5 各組腎臟組織中TNF-α，IL-6和FoxO1 mRNA表達水平Fig 5 The mRNA expression level of TNF-α，IL-6 and FoxO1 in three groups

調(diào)節(jié)性T細胞為一類特殊的T淋巴細胞亞群，因能夠有效抑制自體免疫活性、預(yù)防人類的自體免疫性疾病，Treg細胞通過對其他免疫細胞的負調(diào)節(jié)發(fā)揮維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病初診時測得Treg細胞表達失衡，表現(xiàn)為CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例低于正常水平[12]。另有研究顯示Treg細胞的表達率與2型糖尿病腎病病程呈負相關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，2型糖尿病腎病組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比低于正常組，而沙格列汀治療組外周血具有潛在免疫調(diào)節(jié)活性的CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比水平高于模型組。提示DPP-4抑制劑沙格列汀可能通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，抑制2型糖尿病腎病自體免疫活性而發(fā)揮維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用。

NF-κB是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是由p50及p65兩個亞單位構(gòu)成的異源二聚體，通常以非活性形式存在于幾乎所有類型的細胞中，可通過調(diào)節(jié)促炎因子的表達調(diào)控免疫及炎癥反應(yīng)，包括TNF-α、IL-6、趨化因子及細胞黏附分子等。COX-2是環(huán)氧化酶(COX)的同功異構(gòu)酶，參與多種應(yīng)激和病理過程，其啟動子序列可與NF-κB序列特異性結(jié)合，促進COX-2基因轉(zhuǎn)錄[14]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組腎組織NF-κB p65表達升高，同時炎性因子COX-2、TNF-α、IL-6和FoxO1的mRNA表達也呈升高趨勢；與模型組相比，沙格列汀可明顯下調(diào)上述表達增高的因子的表達水平。提示DPP-4抑制劑沙格列汀可能通過免疫調(diào)節(jié)機制中相關(guān)因子的表達而改善2型糖尿病大鼠腎臟炎癥的損傷。

綜上，DPP-4抑制劑沙格列汀能改善2型糖尿病引起的代謝紊亂和腎臟組織病理學(xué)改變，調(diào)節(jié)外周血T細胞亞群水平，下調(diào)炎癥因子的表達。DPP-4抑制劑沙格列汀對糖尿病腎臟損害具有保護作用的原因可能是抑制炎癥的發(fā)生及參與免疫調(diào)節(jié)，但其具體機制還有待深入研究。

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Effects of the DPP-4 inhibitor Saxagliptin against kidney injury in type 2 diabetes mellitus rats

JIANG Junshu1,2，YE Shengkai1，SUN Xiaohong1，DU Nan3，TU Zuoyu3，DAI Yongguo3， CHEN Haiying1，LYU Li3

(1. Department of Endocrinology, the 210th Hospital of PLA, Dalian 116021, China; 2. Department of Medical Affairs, the Third People's Hospital of Dalian, Dalian 116033, China;3. College of Pharmacy, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

Objective To investigate the effects of Saxagliptin, a DPP-4 inhibitor, against kidney injury in type 2 diabetes mellitus rats. Methods Thirty male Sprague-Dawley rats were divided into 3 groups randomly (n=10): control group, type 2 diabetes mellitus (T2DM) group, T2DM+Saxagliptin 1.0 mg/kg (Sax) group. The rats of T2DM group and Sax group were fed with a high-fat diet and given STZ to establish experimental type 2 diabetes model, while the rats of control group were fed with a normal diet. The rats of Sax group were administered Saxagliptin 1.0 mg/kg once a day for 12 weeks and the rats of control group and T2DM group were given equal volume of saline. Blood glucose was measured in a blood glucose meter. TC, TG, LDL, HDL, Cr, BUN were measured in a blood automatic analyzer. The level of Tregs were measured by flow cytometry. Kidney tissues were examined with HE staining. TFG-β expression was detected by immunohistochemistry. The expression level of TNF-α, IL-6, FoxO1, NF-κB p65, COX-2 were determined by western blotting and Real-time PCR. Results Saxagliptin decreased blood glucose, reduced food/water intakes and body weight, decreased serum lipid parameters (TC, TG, LDL), ameliorated Cr, BUN, INF-γ/IL-10, Tregs levels. Saxagliptin significantly down-regulated the expressions of TFG-β, TNF-α, IL-6, FoxO1, NF-κB p65, COX-2. Conclusion DPP-4 inhibitor Saxagliptin could lessen kidney injury in type 2 diabetes mellitus rats by inhibiting inflammation and regulating immune function.

DPP-4 inhibitor; Saxagliptin; type 2 diabetes mellitus; kidney injury; immune function

大連市醫(yī)學(xué)衛(wèi)生科學(xué)研究計劃項目(大衛(wèi)科發(fā)[2014]142號)；中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)教育分會中國高等教育學(xué)會醫(yī)學(xué)教育專業(yè)委員會醫(yī)學(xué)教育研究項目(2016B-YX013)

蔣雋舒(1990-)，女，碩士研究生。E-mail：592346293@qq.com

陳海英，副主任醫(yī)師。E-mail：jjhchy@163.com

10.11724/jdmu.2017.04.03

R977.1+5

A

1671-7295(2017)04-0323-06

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