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利魯唑?qū)ξ焖牡掳d癇大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β、TNF-α的影響

2017-09-12 08:43馮基高莫業(yè)和劉達遠王東軍
海南醫(yī)學(xué) 2017年16期
關(guān)鍵詞:谷氨酸陽性細胞海馬

馮基高,莫業(yè)和,劉達遠,王東軍

(1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,海南???70311;2.廣東醫(yī)科大學(xué),廣東湛江524001)

利魯唑?qū)ξ焖牡掳d癇大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β、TNF-α的影響

馮基高1,莫業(yè)和1,劉達遠1,王東軍2

(1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,海南???70311;2.廣東醫(yī)科大學(xué),廣東湛江524001)

目的探討利魯唑?qū)ξ焖牡?PTZ)致癲癇大鼠海馬CA3區(qū)白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)的影響。方法將45只大鼠按完全隨機設(shè)計方法分為對照組、癲癇模型組(PTZ組)和利魯唑組(Riluzole組),每組15只;造模大鼠連續(xù)給予PTZ(35 mg·kg-1·d-1)腹腔注射30 d,3次Ⅳ級或以上發(fā)作大鼠為癲癇造模成功;免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β、TNF-α的表達和分布。結(jié)果對照組、PTZ組及Riluzole組大鼠的IL-1β陽性細胞平均光密度值(OD)分別為(0.210±0.002)、(0.241±0.002)和(0.220±0.002),不同組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);TNF-α陽性細胞OD值分別為(0.191±0.003)、(0.230±0.003)和(0.202±0.003),不同組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β與TNF-α表達水平呈顯著正相關(guān)(r=0.969,P<0.01)。結(jié)論利魯唑通過抑制癲癇大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細胞過度表達IL-1β、TNF-α,可能降低其對正常神經(jīng)細胞的損傷作用,可能減緩癲癇發(fā)病對正常神經(jīng)細胞的損傷,產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

大鼠;利魯唑;戊四氮;癲癇;白細胞介素1β;腫瘤壞死因子α

癲癇是臨床最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡與癲癇的發(fā)病密切相關(guān)[1]。細胞因子白細胞介素1β(interleukin-1 beta,IL-1β)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)均是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還發(fā)揮著神經(jīng)遞質(zhì)的重要作用,它們與其受體緊密相結(jié)合后,通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)并影響神經(jīng)元活性等重要相關(guān)途徑干擾癲癇的發(fā)生發(fā)展。利魯唑?qū)俦洁邕蝾惢衔?,是臨床上用于治療運動神經(jīng)元病的一種藥物。其通過抑制腦內(nèi)興奮性氨基酸的活性、抑制N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-Methyl-D-Aspartate Receptor,NMDAR)的功能、抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及穩(wěn)定電壓依賴性鈉通道的失活狀態(tài)等機制來產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[2]。有關(guān)載體狀況下利魯唑?qū)Πd癇模型海馬組織IL-1β、TNF-α的影響鮮見報道。鑒于此,本研究擬通過腹腔注射利魯唑觀察其對戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)致癲癇大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α表達的影響,以期為臨床上預(yù)防及治療癲癇疾病提供實驗支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性健康SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑利魯唑片購自賽諾菲(北京)制藥有限公司(國藥準字J20100164,規(guī)格:50 mg);PTZ購自美國Sigma公司;兔抗鼠IL-1β單抗、兔抗鼠TNF-α單抗購自武漢博士德生物公司;二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 動物分組實驗SD大鼠分籠飼養(yǎng)于動物房中,26℃恒溫,采用自由進食水、自然晝夜的方法飼養(yǎng),注意避免非特異性應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,將45只大鼠按完全隨機設(shè)計方法分為對照組、癲癇模型組(PTZ組)和利魯唑組(Riluzole組),每組15只。

1.4 造模方法造模大鼠按35 mg·kg-1·d-1給予PTZ腹腔注射,連續(xù)30 d。注藥操作在每天上午8:00~9:00進行。每次給藥后觀察大鼠30 min,并記錄癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時間及發(fā)作時的行為表現(xiàn)。大鼠每5~6 d稱體質(zhì)量一次,以便調(diào)整PTZ劑量。模型點燃成功后,每5 d腹腔注射PTZ溶液1次加以鞏固。

1.5 癲癇發(fā)作的分級大鼠癲癇的行為表現(xiàn)采用Racine六級評價標準[3]。0級:無任何反應(yīng);Ⅰ級:濕狗樣抖動表現(xiàn)為節(jié)律性咀嚼、動須及眨眼;Ⅱ級:頸部肌肉持續(xù)痙攣表現(xiàn)為甩尾和(或)點頭;Ⅲ級:一側(cè)前肢間斷性陣攣;Ⅳ級:雙側(cè)前肢間斷性陣攣伴站立;Ⅴ級:全身陣攣,跌倒。記錄癲癇發(fā)作持續(xù)時間及發(fā)作時的行為表現(xiàn)。凡已獲得連續(xù)3次Ⅳ級或以上發(fā)作者,被認為完全點燃。

1.6 利魯唑大鼠給藥劑量、給藥途徑及時間采用灌胃法給藥:造模成功后,利魯唑組按10 mg·kg-1·d-1給予利魯唑溶液灌胃,灌胃操作在每天上午8:00~9:00進行,連續(xù)給藥8周。對照組和PTZ組給予等體積蒸餾水灌胃。

1.7 標本的處理及切片的制備在最后一次灌胃給藥24 h后,10%的水合氯醛麻醉大鼠,斷頭處死,在冰盒上快速開顱取腦,分離腦組織取海馬組織,置于4%多聚甲醛溶液中,4℃存放24 h。梯度酒精脫水后石蠟包埋。石蠟標本常規(guī)5 μm連續(xù)切片,取含海馬組織最大、最完整切面的切片供免疫組織化學(xué)反應(yīng)。

1.8 免疫組織化學(xué)染色選取的石蠟切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后高壓修復(fù)抗原,加3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,滴加一抗?jié)窈袃?nèi)4℃孵育過夜后滴加二抗,DAB顯色、蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、氨水返藍、梯度酒精脫水最后封片。

1.9 染色結(jié)果的判斷IL-1β、TNF-α的表達均以胞漿有棕黃色著色為陽性。采用圖像分析系統(tǒng)(OLYMPUS BX500顯微鏡,電腦圖像采圖軟件Image-Pro Plus 6.0分析軟件)進行圖像分析。每只大鼠取5張切片,測海馬組織CA3區(qū),在200倍視野下獲取平均光密度(OD)值,最后數(shù)據(jù)由分析系統(tǒng)自動計算。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,計量資料兩兩比較采用t檢驗,檢驗水準α=0.05,相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察空白組無抽搐發(fā)作。45只腹腔注射PTZ溶液的SD大鼠,第1周后19只出現(xiàn)Ⅲ級以上發(fā)作,表現(xiàn)為點頭甩尾,四肢陣攣,之后癲癇發(fā)作逐漸加重。第2周后24只達到Ⅳ~Ⅴ級發(fā)作,表現(xiàn)為頭頸部僵硬,前肢陣攣,后肢直立,站立不穩(wěn),跌倒,1只有Ⅴ級發(fā)作并死亡。第3周后34只大鼠達到Ⅳ~Ⅴ級發(fā)作,2只有Ⅴ級發(fā)作并死亡。第4周后36只達到Ⅳ~Ⅴ級發(fā)作,達到Ⅴ級的有34只,占致癲癇大鼠的75.6%左右,表現(xiàn)為全身強直陣攣,站立不穩(wěn),跌倒,見表1。

表1 PTZ致癲癇大鼠模型行為學(xué)觀察(只)

2.2 IL-1β免疫組織化學(xué)結(jié)果光鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色后的大鼠海馬組織CA3區(qū),IL-1β呈胞漿表達,陽性細胞胞漿呈棕黃色。三組兩兩比較,PTZ組、Riluzole組IL-1β陽性細胞表達顯著高于對照組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PTZ組IL-1β陽性細胞表達高于Riluzole組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2、圖1~3。

表2 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)IL-1β的OD值()

表2 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)IL-1β的OD值()

注:與正常對照組比較,aP<0.05,bP<0.05;與PTZ組比較,cP<0.05。

對照組PTZ組Riluzole組0.210±0.002 0.241±0.002a0.220±0.002bc15 15 15

2.3 TNF-α免疫組織化學(xué)結(jié)果光鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色后的大鼠海馬組織CA3區(qū),TNF-α呈胞漿表達,陽性細胞胞漿呈棕黃色。三組兩兩比較,PTZ組、Riluzole組TNF-α陽性細胞表達顯著高于對照組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PTZ組TNF-α陽性細胞表達高于Riluzole組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3、圖4~6。

圖1 對照組海馬CA3區(qū)IL-1β免疫組化標記(×400);圖2PTZ組海馬CA3區(qū)IL-1β免疫組化標記(×400);圖3利魯唑組海馬CA3區(qū)IL-1β免疫組化標記(×400)

2.4 IL-1β與TNF-α表達的相關(guān)性實驗結(jié)果表明:大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β與TNF-α表達水平呈顯著正相關(guān)(n=45,r=0.969,P<0.01),見圖7。

表3 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)TNF-α的OD值()

表3 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)TNF-α的OD值()

注:與對照組比較,aP<0.05,bP<0.05;與PTZ組比較,cP<0.05。

組別對照組PTZ組Riluzole組TNF-α(OD) 0.191±0.003 0.230±0.003a0.202±0.003bc樣本數(shù)(只)15 15 15

圖4 對照組海馬CA3區(qū)TNF-α免疫組化標記(×400);圖5PTZ組海馬CA3區(qū)TNF-α免疫組化標記(×400);圖6Riluzole組海馬CA3區(qū)TNF-α免疫組化標記(×400)

圖7 各組SD大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β與TNF-α表達水平的關(guān)系(n=45)

3 討論

IL-1β是一種多功能調(diào)節(jié)細胞因子,參與機體的多種病理生理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)在癲癇大鼠模型腦組織中IL-1β的表達明顯增高,癲癇患血清及腦脊液中IL-1β的含量也顯著增高等[4-5]。Straussberg等[6]報道,IL-lβ可能通過介導(dǎo)細胞炎癥參與癲癇發(fā)生。在腦內(nèi)IL-β是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞產(chǎn)生,與受體緊密相結(jié)合后,通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)并影響神經(jīng)元活性等重要相關(guān)途徑干擾癲癇的發(fā)生發(fā)展。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子,有增強興奮性神經(jīng)介質(zhì)興奮毒性作用,參與多種疾病的病理生理過程,在癲癇中也有重要作用[7]。在癲癇患者腦組織和腦脊液中,TNF-α及TNF-α mRNA的表達明顯升高[8]。Plata-Salaman等[9]發(fā)現(xiàn),癲癇小鼠模型海馬組織TNF-α mRNA表達水平明顯升高。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)癲癇與免疫功能異常關(guān)系密切,并發(fā)現(xiàn)TNF-α參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。本實驗也發(fā)現(xiàn),癲癇大鼠模型海馬組織IL-1 β、TNF-α陽性細胞表達顯著增高[(0.241± 0.002)、(0.230±0.003)];且IL-1β與TNF-α表達水平呈顯著正相關(guān)(n=45,r=0.969,P<0.01)。實驗結(jié)果表明TNF-α與IL-1β關(guān)系密切,文獻也報道IL-1β可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)系統(tǒng),NF-κB又能誘導(dǎo)TNF-α等更多細胞因子的表達[11];而TNF-α可使星形膠質(zhì)細胞活化增殖,誘導(dǎo)其合成和分泌IL-1、IL-2等細胞因子[12],介導(dǎo)癲癇模型大鼠腦組織局部的炎癥反應(yīng),加重神經(jīng)損傷。

利魯唑(Riluzole)屬苯噻唑類化合物,能透過血腦屏障,臨床上用于治療神經(jīng)損傷及退行性疾病。利魯唑通過抑制NMDAR的功能及谷氨酸神經(jīng)興奮毒性作用機制,在麻醉、神經(jīng)保護、抗驚厥、抗抑郁、鎮(zhèn)痛和抗依賴等方面發(fā)揮作用[13]。研究表明,利魯唑重要從突觸前、突觸間隙及突觸后受體三個方面拮抗谷氨酸興奮毒性作用發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14],其作用機制可能與其影響多種離子通道和受體的功能相關(guān)。利魯唑抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前釋放谷氨酸[15];上調(diào)星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體數(shù)量及活性,增加谷氨酸清除[16]。利魯唑可抑制興奮性氨基酸活性,從而減少腦組織中乙酰膽堿的釋放,達到抗驚厥作用[17]。

結(jié)合本實驗中利魯唑組IL-1β及TNF-α陽性細胞表達均明顯低于PTZ組(P<0.05)的結(jié)果推測,臨床上應(yīng)用利魯唑治療癲癇疾病,可能會通過抑制谷氨酸的活性及釋放,降低了谷氨酸調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的活化增殖作用,減少了神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成和膠質(zhì)膜的重建,維持正常的生理結(jié)構(gòu)及生理功能,從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用影響癲癇的發(fā)生發(fā)展。而且,利魯唑還可能會通過抑制腦內(nèi)谷氨酸的活性及釋放,間接抑制星形膠質(zhì)細胞過度分泌IL-1β、TNF-α等重要細胞因子,降低IL-1β、TNF-α對正常神經(jīng)細胞的損傷作用,從而減緩癲癇發(fā)病對正常神經(jīng)細胞的損傷,產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。再者,利魯唑可能會通過抑制了NMDAR的功能,間接抑制了IL-1β介導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)鈣離子升高,繼而影響神經(jīng)細胞膜上的電壓門控通道,進而抑制神經(jīng)元興奮性增高及過度異常放電,最終抑制癲癇的發(fā)作。這些均需要后續(xù)實驗去證實,這也提示了本實驗為利魯唑的研究提供新的方向。

綜上所述,可以確認在癲癇中利魯唑可抑制IL-1β、TNF-α的過度表達,可能發(fā)揮一定的神經(jīng)細胞保護作用。但其機制仍需繼續(xù)深入研究,在下一步研究中,我們將進行利魯唑影響免疫系統(tǒng)通路的研究,闡明利魯唑在癲癇發(fā)生發(fā)展中的具體機制,為癲癇的臨床診治及基礎(chǔ)研究提供新的依據(jù)。

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Effects of riluzole on the expressions of IL-1β and TNF-α in the hippocampus CA3 of rat with seizures induced by pentylenetrazole.

FENG Ji-gao1,MO Ye-he1,LIU Da-yuan1,WANG Dong-jun2.1.Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of riluzole on interleukin-1 beta(IL-1β)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)levels in the hippocampus CA3 of Rat,using pentylenetetrazole(PTZ)kindling epileptic model. MethodsA total of 45 rats were divided into 3 groups:the control group,the epilepsy model group(PTZ group)and the riluzole group according to the completely randomized design method,with 15 rats in each group.The model rats were continuously given PTZ(35 mg·kg-1·d-1)intraperitoneal injection for 30 days.Rats with 3 times ofⅣor more seizures were successfully modeled for epilepsy.The expressions and distributions of IL-1β and TNF-α of each group in hippocampus of CA3 were evaluated by immunohistochemical assay.ResultsThe mean optical density(OD)of IL-1β positive cells in the control group,PTZ group and riluzole group were(0.210±0.002),(0.241±0.002)and(0.220±0.002), respectively,and there were significant differences among them(P<0.05).The mean optical density(OD)of TNF-α in the control group,PTZ group and riluzole group were(0.191±0.003),(0.230±0.003)and(0.202±0.003),respectively, and there were significant differences among them(P<0.05).There was a significantly positive correlation between the expressions of IL-1β and TNF-α in hippocampus CA3(r=0.969,P<0.01).ConclusionRiluzole prevent the excessive expression of IL-1β,TNF-α from neurons in the brain of epileptic rats,reduce its damaging effects on normal nerve cells.Therefore,Riluzole act as a neuroprotector to alleviate damages of epilepsy.

Rat;Riluzole;Pentylenetetrazole;Epilepsy;Interleukin-1 beta(IL-1β);Tumor necrosis factor alpha(TNF-α)

R-332

A

1003—6350(2017)16—2586—04

2017-03-16)

海南省科學(xué)技術(shù)廳項目(編號:20168295)

王東軍。E-mail:395869860@qq.com

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