黃鳳華，姚依蘭，馮 閣，舒 暢,張西鋒

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

曲古霉素A(TSA)對人宮頸癌細胞的殺傷作用

黃鳳華，姚依蘭，馮 閣，舒 暢,張西鋒

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

研究探討了曲古霉素A(TSA)對人宮頸癌Hela細胞的殺傷作用。通過TSA處理Hela細胞，利用MTT法、乳酸脫氫酶(LDH)和活化氧(ROS)的檢測法，以及熒光定量PCR方法等進行研究。結果表明：TSA抑制了細胞的增殖，增加了細胞內LDH和ROS的產(chǎn)生，促進了凋亡相關基因的表達，誘導細胞凋亡。

曲古霉素A；宮頸癌細胞；凋亡

1 引言

腫瘤已經(jīng)成為了威脅人類健康的主要疾病之一，其治療難度大，致死率高，給人類生活帶來嚴重的負面影響。發(fā)展中國家所面臨的形勢更加嚴峻，是影響國內居民身體健康的主要疾病，我國的癌癥病例呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，同時死亡率也有所增加。宮頸癌對女性健康的影響不言而喻，癌癥的治療顯得尤為重要，同時治療方法的改善以及創(chuàng)新都有深遠的意義。宮頸癌的發(fā)生與基因和表觀遺傳的異常調控相關，包括組蛋白H3的磷酸化和乙?；?，全DNA的低甲基化和抑癌基因的高甲基化[1-2]。其中通過特異性組蛋白乙?；负腿ヒ阴；傅淖饔?，使組蛋白N末端的乙酰化和去乙?；?，從而影響基因的調控[3]。

近年來，對組蛋白去乙?；种苿┑难芯咳〉昧艘欢ǖ倪M展，為治療腫瘤提供了新的思路和潛在的治療方法。HDAC抑制劑是一類新的有效的HDAC特異性抑制劑，抑制多種癌癥[4-5]。曲古抑菌素A(TSA)是幾種抑制劑之一，當與放射治療或化療聯(lián)合使用時，對多種癌細胞都有潛在的治療效果[6-7]。TSA在多種癌細胞中通過抑制細胞活力，激活凋亡相關蛋白質引起細胞凋亡，包括人胃癌，卵巢癌和小細胞肺癌細胞[8-10]。本研究以人宮頸癌Hela細胞為細胞模型，探討TSA對Hela細胞的殺傷作用，及用于宮頸癌治療的可能機制。

2 材料與方法

2.1 材料

TSA和細胞培養(yǎng)相關試劑購自Sigma公司，其它所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；MTT、LDH和ROS檢測試劑盒購自Beyotime公司，RT-PCR試劑盒購自Takara公司。

2.2 儀器與設備

熒光倒置顯微鏡及顯微圖像分析系統(tǒng) Nikon TE2000U；CO2培養(yǎng)箱 Thermo。

2.3 方法

2.3.1 RT-PCR

RT-PCR的實驗操作參考試劑盒的說明書進行。所用的引物見表1。

表1 引物序列

基因方向引物序列(5’-3’)BaxFGAGAGGTCTTTTTCCGAGTGGRGGAGGAAGTCCAATGTCCAGP53FAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATRTCCGTCCCAGTAGATTACCACTBakFCTCAGAGTTCCAGACCATGTTGRCATGCTGGTAGACGTGTAGGGCaspase3FCATACTCCACAGCACCTGGTTARACTCAAATTCTGTTGCCACCTTCaspase9FACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTRGAAATTAAAGCAACCAGGCATCBcl2FCTGAGTACCTGAACCGGCARGAGAAATCAAACAGAGGCCG

2.3.2 細胞的培養(yǎng)、MTT檢測、LDH檢測和ROS檢測

參照文獻11和文獻12[11-12]進行細胞培養(yǎng)和各項檢測。

3 結果與分析

3.1 細胞活力的 MTT檢測

研究梯度濃度的TSA對宮頸癌細胞生長的抑制作用，如圖1所示，TSA的抗腫瘤細胞活性比較明顯，并且對于HeLa細胞50%抑制濃度為100 nM。由此表明TSA可以有效并且明顯地降低宮頸癌細胞的活性(*P<0.05)。

圖1 Hela細胞暴露TSA后細胞活力的檢測

3.2 TSA對細胞內LDH和ROS產(chǎn)生的檢測

檢測對照組和處理組細胞外的LDH含量，在實驗中加入N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)和H2O2作為對照(圖2)。NAC是一種常用的抗氧化劑，H2O2作為活性氧供體。圖2A所示，TSA處理組與對照組相比，LDH的泄漏量都有所提高(*P<0.05)。在添加NAC的處理組，LDH的泄漏量均有下降，而且只比對照組的泄漏量略有升高。H2O2處理組的LDH泄漏量是最高的，但是加入NAC后，泄漏量也顯著降低。

在實驗組中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平檢測時，同樣添加NAC和H2O2作為對照?；钚匝跏欠肿友踉趨⒓臃磻^程中的所產(chǎn)生的一系列的中間產(chǎn)物，其中活性氧包括了以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物，比如過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)和羥基自由基(hydroxyl radicals,·HO)。

圖2B，TSA處理組與對照組相比， DCF的熒光強度增強，ROS有所提高，H2O2處理組的ROS水平是最高的(*P<0.05)。處理組中NAC的有無對其結果有明顯的差異。很顯然的是，NAC會強烈抑制活性氧的生成，在TSA和H2O2這兩個處理組中都有明顯的效果。

圖2 TSA對Hela細胞內LDH和ROS生產(chǎn)的影響

3.3 TSA破壞線粒體膜電位(MMP)和增強Caspase-3活性

在細胞凋亡的過程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認為是細胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件之一。JC-1是線粒體膜電位的檢測方法之一。凋亡細胞，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內釋放，濃度降低，逆轉為發(fā)射綠色熒光的單體形式。故而可以通過檢測綠色和紅色熒光來定性(細胞群的偏移)定量(細胞群的熒光強度)的檢測線粒體膜電位的變化。加入依托泊苷(Etoposide, ET)作為陽性對照，ET是細胞周期特異性抗腫瘤藥。HeLa細胞經(jīng)過TSA和ET處理24 h后，加入JC-1來測定MMP。圖3A中可以看到與對照組相比，處理組的紅/綠熒光強度比都有所下降，也就是說明兩個處理組細胞MMP去極化嚴重。

線粒體釋放出的細胞色素c會激活caspase家族的級聯(lián)反應[13]，影響細胞中caspase-3的水平。在檢測細胞中caspase-3的水平時。加入caspase-3的抑制劑(Z-DEVD)和依托泊苷(Etoposide, ET)作為對照實驗。由圖3B可以看到不加caspase-3抑制劑的處理組，caspase-3活性都較對照組有明顯提高。加入caspase-3抑制劑的實驗組結果都大致相同，caspase-3活性都在一個較低的水平(*P<0.05)。

圖3 TSA對MMP和Caspase-3活性的影響

3.4 TSA上調促凋亡基因的表達

眾所周知，各種促凋亡和抗凋亡蛋白調控細胞死亡通路，通過檢測p53 ，Bax， Bak，caspase-3/9以及Bcl2的mRNA水平來研究細胞凋亡與TSA處理組之間的聯(lián)系。如圖4，與對照組相比，處理組中p53， Bax， Bak和， caspase-3/9的mRNA水平均有所上升；同時處理組中Bcl-2的mRNA水平均下降(P<0.05)。經(jīng)過處理的HeLa細胞中caspase3/9的表達量會上升，表明TSA誘導細胞凋亡的分子機制和Bcl-2蛋白家族有關系。

4 結論與討論

通過MTT來研究TSA對癌細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)TSA對細胞的毒性都有濃度依賴性。對于HeLa細胞，TSA50%抑制濃度為100 nM。Vigushin等人研究了TSA對8種不同乳腺癌細胞系的抑制活性，發(fā)現(xiàn)TSA的50%抑制濃度在26.4—308.1 nM[14]。Wu等人發(fā)現(xiàn)用低濃度的TSA(0.1—1.0μM)處理HeLa細胞，在12 h以內會出現(xiàn)輕微促進細胞增殖的情況，接著會略微抑制細胞增殖，但即使24 h以后也不會誘導細胞死亡。用更高濃度的TSA(1.0 μM和2.0 μM)來處理細胞24 h，會使細胞的生長完全受到抑制[15]。我們的實驗結果和上述結果是一致的，還有研究表明TSA抑制宮頸癌細胞增殖是不僅有劑量依賴性而且還有時間依賴性的[16]。

圖4 TSA對細胞凋亡相關基因mRNA表達量的影響

許多研究表明TSA與其他藥物組合使用會使抑制細胞活性的作用得到增強， Yan等人證明了姜黃素(curcumin)和TSA聯(lián)用處理細胞，有抑制細胞活性的作用從而加強抗癌效果[17]。還有實驗提到了將5μM的槲皮素和82.5 nM的TSA組合使用，會有效地提高對肺癌細胞A549的細胞毒性[18]。

有文獻提到原發(fā)性肝星狀細胞(primary hepatic stellate cell)經(jīng)過TSA(1,10,100 nM)處理后，LDH的泄漏量會提高[19]。文獻中提到在白血病、前列腺和宮頸癌細胞中，組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)抑制劑會通過提高細胞中ROS的水平，從而誘導細胞死亡[20]。

TSA的抗癌活性是由于激活了必要的信號通路導致了細胞的凋亡[21]，Bcl-2蛋白家族在破壞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)和釋放細胞色素c(cytochrome c)的過程中有著重要的角色。包括TSA在內的HDAC抑制劑通過增加Bcl2家族的BH3-only的表達來破壞細胞MMP。MMP去極化會影響細胞正常的呼吸，并且一般認為MMP的下降是細胞早期凋亡的一個標志，而DNA降解為片段是細胞凋亡的一個重要標志。

TSA會下調Bcl2的表達量并上調凋亡相關基因的表達量，從而誘導癌細胞凋亡，Bax/Bcl2比例的升高也會造成MMP下降，同時誘導細胞凋亡[22]。所以TSA是通過Bcl2蛋白家族來誘導細胞凋亡。

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Cytotoxicity of Trichostatin A on human cervical carcinoma cell

HUANGFeng-hua,YAOYi-lan,FENGGe,SHUChang,ZHANGXi-feng

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The aim of this study was to investigate the cytoxicity of Trichostatin A on human cervical carcinoma cell. Hela cells were treated with Trichostatin A, and the methods of MTT, check of Lactate dehydrogenase (LDH) and activated oxygen(ROS), RT-PCR were used for this experiment. The results show that TSA effectively inhibits cell viability, increases the LDH leakage and the fluorescence intensity of ROS, and promotes the expression of apoptosis-related genes, induce cell apoptosis.

trichostatin A; cervical carcinoma cell;apoptosis

2017-05-04.

黃鳳華(1990-)，女，碩士研究生，E.mail:867134498@qq.com.

張西鋒(1977-)，男，博士，副教授，E.mail:zhangxf9465@163.com.

國家自然科學基金(B020704).

2095-7386(2017)02-0036-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.02.007

R 737.11

A