畢旺來，楊 俊，杜文芳，李 睿

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

改良Vero細胞毒性試驗法檢測志賀毒素

畢旺來，楊 俊，杜文芳，李 睿

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

采用Vero細胞培養(yǎng)法檢測5株腸出血性大腸桿菌O157食品分離株的志賀毒素。在48孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)Vero細胞24 h,然后加入梯度稀釋的志賀毒素濾液。培養(yǎng)24 h及48 h后在倒置顯微鏡下觀察Vero細胞形態(tài)。培養(yǎng)48 h后結(jié)晶紫染色，測定Vero細胞半致死時，對應(yīng)的志賀毒素濾液稀釋倍數(shù)。證實形態(tài)觀察和結(jié)晶紫染色相結(jié)合可以準確測定腸出血性大腸桿菌O157食品分離株的志賀毒素。

細胞培養(yǎng);腸出血性大腸桿菌O157;志賀毒素;Vero細胞毒性

1 引言

腸出血性大腸桿菌O157可引起人類一系列疾病，如水樣性腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥綜合征等[1]。腸出血性大腸桿菌O157有多種傳播途徑，如受污染的牛肉、原料奶、禽類食物等[2]。目前也報道了許多因攝入受污染的蔬菜、水果和水而感染腸出血性大腸桿菌O157的案例[3-4]。由于腸出血性大腸桿菌O157有很強的致病性和致死性，同時其爆發(fā)又有著極強的流行性,所以腸出血性大腸桿菌O157對人類的生命健康構(gòu)成了巨大的威脅，受到了全球的關(guān)注[5]。

腸出血性大腸桿菌O157的主要毒力因子是志賀毒素(Stx)，它由位于大腸桿菌噬菌體上的stx基因編碼[6]。志賀毒素分為Stxl和Stx2兩類。Stxl和Stx2的氨基酸相似性僅為55%—57%，但兩者在免疫學上有交叉反應(yīng)[7]，兩種毒素毒力并不相同。有文獻表明Stx2毒素對腎臟微血管內(nèi)皮細胞的毒性比Stx1毒素大1 000倍[8]。

Vero細胞系是日本千葉大學的Yasumura 及 Kawakita于1962年3月27日從非洲綠猴的腎上皮細胞中分離擴增培養(yǎng)出來的。Vero細胞用途十分廣泛，常被用于大腸桿菌和痢疾志賀菌毒素的測定[9]。Vero細胞毒性檢測的方法主要有 MTT檢測法。MTT檢測法的原理是，活的哺乳動物細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將黃綠色的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。用二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞中的甲瓚，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm時測定其吸光度(OD值)，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量正比于活細胞數(shù)目，便可間接反映活細胞數(shù)量，從而推測出化學物對細胞抑制或殺傷的效率[10]。但此項方法中不僅MTT本身價格較昂貴， DMSO對實驗者健康也有損害。

本研究采用細胞形態(tài)觀察和結(jié)晶紫染色相結(jié)合的方法，測定腸出血性大腸桿菌O157食品分離株的志賀毒素，擬為志賀毒素的測定提供更為簡便的方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗菌株

腸出血性大腸桿菌O157高毒株EC150由日本九州大學贈送，腸出血性大腸桿菌O157 EC9.23、EC5.11、 EC6.8、 EC9.10、 EC9.102 、EC9.12均為食品分離株。EC9.23已由RPLA試劑盒檢測為不產(chǎn)志賀毒素的無毒株。

2.1.2 實驗細胞

Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)，CX0322，購買于武漢博士德生物工程有限公司。

2.1.3 主要試劑

RPMI1640液體培養(yǎng)基PYG0066(含青霉素、鏈霉素、 L-谷氨酰胺)，武漢博士德生物工程有限公司。胰蛋白酶溶液 PYG0067，武漢博士德生物工程有限公司。胎牛血清 131021型(無支原體，未滅活)，浙江天杭生物技術(shù)有限公司。多粘菌素B 武漢鼎國生物有限公司。

2.2 方法

2.2.1 志賀毒素濾液的制備

將7株腸出血性大腸桿菌O157 菌株37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)16 h。取過夜培養(yǎng)物分別涂布接種于BHI平板上，37 ℃培養(yǎng)16―20 h。用接種環(huán)刮取培養(yǎng)基表面三分之一平板大小的菌泥(火柴頭3倍大小)，懸浮于1 mL多粘菌素B溶液中。37 ℃下保溫30 min，每5―10 min振蕩一次。取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，在室溫下900×g離心15 min。取上清用0.22 μm 濾膜過濾，即為志賀毒素濾液原液。將志賀毒素濾液原液用生理鹽水作10倍連續(xù)稀釋，共5個稀釋度，即1∶101，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105。然后保存于-20 ℃冰箱中備用。

2.2.2 結(jié)晶紫染色檢測志賀毒素滴度

將Vero細胞用RPMI 1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)4至5代，至細胞形態(tài)大小比較均勻。在顯微鏡下觀察貼壁單層細胞的生長狀態(tài)，若細胞處于對數(shù)生長期，則可用于檢測志賀毒素滴度。打開培養(yǎng)瓶蓋，棄去培養(yǎng)液，吸取PBS洗液5―10 mL清洗1―2次，加入胰蛋白酶3 mL，37 ℃條件下靜置約3 min。吸取RPMI 1640(含10%胎牛血清)8 mL，加入培養(yǎng)瓶終止消化，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min。吸去上清液，加入少量的RPMI1640培養(yǎng)基(約10 mL)，初步調(diào)整細胞懸液濃度。用血球計數(shù)板進行計數(shù)，然后再次調(diào)節(jié)細胞懸液濃度，使細胞濃度為105/mL。向48孔板中加入細胞懸液,每孔所加懸液為250 μL。將48孔板放置于CO2培養(yǎng)箱中，CO2濃度為5%，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。

24 h后取出48孔板，向每孔中加入250 μL梯度稀釋的待檢志賀毒素濾液樣品，并設(shè)置只加了生理鹽水的細胞孔做空白對照，設(shè)置加入EC9.23樣品濾液的細胞孔為陰性對照。同時設(shè)置加入EC150樣品濾液細胞孔為陽性對照。將48孔板放置于CO2培養(yǎng)箱中，CO2濃度為5%，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

培養(yǎng)24 h、48 h后在倒置顯微鏡下觀察各孔細胞生長狀況。孵育48 h后，取出48孔板，每孔加入2% PBS配制的福爾馬林溶液固定1 min。用PBS洗滌一次，用微量移液器小心貼著孔壁吸去液體。用0.25%結(jié)晶紫染色10 min，用PBS洗滌2次，自然風干，肉眼對比各孔染色狀況，觀察實驗結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 志賀毒素對Vero細胞形態(tài)的影響

將細胞懸液加入48孔板，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)(圖1A)。所有孔內(nèi)的細胞均生長均一，成扁平梭形，貼壁良好，細胞交織成網(wǎng)，細胞內(nèi)無明顯空泡，達到接入志賀毒素濾液的要求。在48孔板中各孔內(nèi)接入不同樣品的不同濃度梯度的志賀毒素濾液，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，再次觀察各孔的細胞形態(tài)?？瞻讓φ湛住㈥幮詫φ湛字屑毎麩o明顯形態(tài)變化，保持正常形態(tài)貼壁生長。菌株EC9.12孔中細胞形態(tài)已發(fā)生明顯改變，由緊密連接變?yōu)樗缮⑴帕?，扁平多角細胞變?yōu)闄E圓形，細胞間隙明顯增大，部分細胞已經(jīng)開始脫壁(圖1B)。陽性對照、EC9.10、EC6.8和EC5.11樣品孔中細胞形態(tài)與菌株EC9.12孔中相似，細胞形態(tài)明顯變化。菌株EC9.102孔中細胞形態(tài)與陰性孔中相似，細胞形態(tài)無明顯變化。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下重觀察各孔細胞形態(tài)。菌株EC9.102、空白和陰性對照孔中細胞形態(tài)無明顯變化，細胞生長正常。菌株EC9.12、EC9.10、EC6.8和EC5.11樣品孔和陽性對照孔中細胞融合，變圓，大量細胞破裂、崩解、死亡(圖1C)。

圖1 志賀毒素對Vero細胞形態(tài)的影響

3.2 結(jié)晶紫染色測志賀毒素滴度

48孔板經(jīng)結(jié)晶紫染色(圖2)風干后觀察，發(fā)現(xiàn)空白對照、陰性對照所有孔均被染上紫色，說明不產(chǎn)志賀毒素的菌株EC9.23濾液對Vero細胞的生長無明顯影響。陽性對照中A—D孔，無色；E孔，有部分面積被染上紫色；F孔，全部面積被染上紫色。以此可以估算陽性對照EC150的毒素滴度為1∶104左右。菌株EC9.12、EC9.10樣品孔中染色狀況與陽性對照孔相似，所以EC9.12、EC9.10毒素滴度應(yīng)同EC150相同，約在1∶104左右。菌株EC9.102孔中染色狀況與空白對照、陰性對照相同，可以推測EC9.102不產(chǎn)志賀毒素。菌株EC6.8樣品孔中從A—C孔中無色，D孔部分面積染上紫色，E、F孔中均為紫色，可估算EC6. 8的毒素滴度在1∶103左右。菌株EC5.11樣品孔中A、B孔中無色，C、D孔中部分面積染上紫色，E、F孔全部被染上紫色，可估算EC5.11的毒素滴度為1∶102―03。21列加入了生理鹽水，作空白對照；2列加入菌株EC9.23的梯度濾液，作陰性對照；3列加入菌株EC150的梯度濾液，作陽性對照；4—8列分別加入菌株EC9.12、EC9.102、 EC9.10、EC6.8和EC5.11的梯度濾液。除1列外，2—8列的A—F行所加的濾液稀釋梯度為100到10-5。

圖2 48孔板結(jié)晶紫染色

4 結(jié)論

筆者采用改良Vero細胞毒性試驗法檢測5株腸出血性大腸桿菌O157菌株的志賀毒素。實驗同時采用了細胞形態(tài)學觀察和結(jié)晶紫染色測毒素滴度這兩種方法，對5株菌是否產(chǎn)生志賀毒素進行認定，并初步估算毒力大小。

在細胞形態(tài)學實驗中，檢測的5株菌中，菌株EC9.12、EC9.10、EC6.8和EC5.11 4株菌產(chǎn)志賀毒素，菌株EC9.102不產(chǎn)志賀毒素。接入了產(chǎn)志賀毒素的細菌細胞濾液后，重培養(yǎng)Vero細胞24 h，細胞形態(tài)會發(fā)生明顯改變，細胞由緊密連接變得松散，扁平多角的細胞變?yōu)闄E圓形，細胞間隙明顯增大，部分細胞開始脫壁。培養(yǎng)48 h后，細胞變圓、融合，大量細胞脫壁，細胞開始破裂、凋亡。而接入了不產(chǎn)志賀毒素的細菌細胞濾液后，Vero細胞重培養(yǎng)24 h和48 h，細胞形態(tài)均正常，沒有異常變化。

在結(jié)晶紫染色測定志賀毒素的實驗中，測出致50%細胞死亡的陽性對照菌的毒素滴度約為1∶104，5株菌中有4株菌可產(chǎn)志賀毒素，導(dǎo)致Vero細胞脫壁，部分孔無明顯染色。有一株菌不產(chǎn)志賀毒素，該菌對應(yīng)的所有樣品孔均被染上紫色。此結(jié)果與細胞形態(tài)學實驗結(jié)果相符合。筆者通過此次實驗研究證實形態(tài)觀察和結(jié)晶紫染色相結(jié)合，可以準確測定腸出血性大腸桿菌O157食品分離株的志賀毒素。

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The measurement of Shiga toxin by modified Vero cell cytotoxicity assay

BIWang-lai,YANGJun,DUWen-fang,LIRui

(School of biology and pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

In this study, titers of Shiga toxins of five Enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains isolated from food have been measured by modified Vero cell cytotoxicity assay. Vero cells were incubated for 24h in 48-well cell plate, and then mixed with serial diluted Shiga toxin filtrates. After 24h and 48h incubation, the cell morphology was observed under an inverted microscope. After 48h incubation, the Vero cells were stained by crystal violet, and the toxin titers were determined as the reciprocal of the highest dilution of filtrates that caused 50% Vero cell death. This study demonstrated that morphology observation in combination with crystal violet staining could measure the Shiga toxin produced by Enterhemorrhagic Escherichia coli O157 strains isolated from food.

cell culture; Enterohemorrhagic Escherichia coli O157;Shiga toxin; Vero cytotoxicity

2017-02-28.

畢旺來(1972-)，男，實驗師，E-mail:6052777@qq.com.

2095-7386(2017)02-0022-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.02.004

R 155.5

A