任麗莉+劉超+劉乙蒙+張苧兮+肖建英

[摘要] 目的 探討蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活劑雙丁酰環(huán)腺苷酸（dual dibutyryl cyclic AMP，dbcAMP）調(diào)控蛋白激酶Wee1B蛋白對小鼠1-細(xì)胞期受精卵發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究母源性因子Wee1B在早期胚胎發(fā)育過程中的作用提供理論基礎(chǔ)。 方法 將2 mmol/L dbcAMP作用于小鼠1-細(xì)胞期受精卵1 h，并顯微注射Wee1B-mRNAs，實(shí)驗(yàn)分為未注射組、TE緩沖液注射組、Wee1B-WT/KD注射組、Wee1B-S15A/D注射組，繼續(xù)在M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察小鼠受精卵的形態(tài)變化和卵裂情況，放射自顯影測定各期細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)因子（MPF）活性，Western blotting方法檢測Wee1B蛋白的表達(dá)、CDC2-pTyr15和Wee1B-pSer15的磷酸化水平。 結(jié)果 小鼠受精卵在有dbcAMP存在時(shí)，G1、S、G2和M各細(xì)胞周期均檢測到磷酸化的Wee1B表達(dá)，非磷酸化條帶在G2期和M期才能檢測到；各組受精卵卵裂出現(xiàn)時(shí)間延遲，卵裂率顯著降低；hCG注射后35 h內(nèi)，MPF活性一直處于低水平，CDC2-pTyr15磷酸化狀態(tài)和MPF活性變化趨勢相一致。 結(jié)論 dbcAMP激活PKA后，PKA磷酸化Wee1B蛋白的S15位點(diǎn)，Wee1B活性增加，阻滯受精卵分裂，本研究提示W(wǎng)ee1B蛋白的S15位點(diǎn)可能是PKA作用的生理靶點(diǎn)，可以更好地認(rèn)識(shí)早期胚胎發(fā)育的分子事件。

[關(guān)鍵詞] Wee1B；雙丁酰環(huán)腺苷酸；蛋白激酶A；有絲分裂促進(jìn)因子；小鼠受精卵

[中圖分類號] Q954.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）22-0034-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of dual dibutyryl cyclic AMP（dbcAMP）， a protein kinase A（PKA） activator， which regulates protein kinase Wee1B on the development of mouse 1-cell stage fertilized eggs， so as to provide theoretical basis for further study of the role of maternal factor Wee1B in the early embryonic development process. Methods 2 mmol/L dbcAMP was administered to mouse 1-cell stage fertilized eggs for 1 h， and Wee 1B-mRNAs were injected under microscope. The rats were divided into non-injection group， TE buffer injection group， Wee1B-WT/KD injection group， and Wee1B-S15A/D injection group. The eggs were further cultured in M16 medium. Morphological changes and cleavage conditions of mouse fertilized eggs were observed under phase contrast microscope. The autoradiography was used to measure the activity of mitogen-promoting factor（MPF） for each stage of cells； Western blotting was used to detect the expression of Wee1B protein， as well as the phosphorylation of CDC2-pTyr15 and Wee1B-pSer15. Results The expression of phosphorylated Wee1B was detected in all cell cycles of G1， S， G2 and M of mouse fertilized eggs in the presence of dbcAMP， and the unphosphorylated Wee1B expression was detected only in G2 and M phases. The time of the cleavage in each group of fertilized eggs was delayed and the cleavage rate was significantly decreased； the activity of MPF remained low within 35 h after hCG injection， and CDC2-pTyr15 phosphorylation status was consistent with the changing trend of MPF activity. Conclusion After PKA was activated by dbcAMP， Wee1B activity is increased， and division of fertilized eggs is blocked at the S15 locus of PKA phosphorylated Wee1B protein. This study suggests that the S15 locus of Wee1B protein may be a physiological target of PKA， which can help better understand the molecular events of early embryonic development.endprint

[Key words] Wee1B； Dibutyryl cyclic adenosine monophosphate； Protein kinase A； Mitogen-promoting factor （MPF）； Mouse fertilized eggs

在胚胎基因組激活之前，成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的母源因子（包括mRNA和蛋白質(zhì)）調(diào)控胚胎的發(fā)育[1，2]。卵子受精或核移植的胚胎激活后，積累并儲(chǔ)存的母源因子啟動(dòng)早期胚胎發(fā)育，胚胎基因組開始轉(zhuǎn)錄，并以級聯(lián)反應(yīng)的方式，激活更多的細(xì)胞因子的表達(dá)，保持早期胚胎發(fā)育進(jìn)行[3，4]。蛋白激酶Wee1B在細(xì)胞核中通過磷酸化CDC2激酶的S15位點(diǎn)來抑制其活性進(jìn)而負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[5，6]。cAMP類似物雙丁酰環(huán)腺苷酸（dibutyryl cAMP，dbcAMP）能激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A，抑制有絲分裂促進(jìn)因子（M-phase promoting factor，MPF）活性，調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖和分化，阻滯小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和受精卵有絲分裂的進(jìn)行[7，8]。Macro Conti課題組證明Wee1B蛋白可能是PKA的作用底物，PKA磷酸化Wee1B 蛋白的S15后，使Wee1B激活，進(jìn)而磷酸化CDC2的Y15并抑制MPF活性，卵母細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯[9]。卵母細(xì)胞和受精卵發(fā)育是兩個(gè)既相似但又有差異的過程，PKA通過改變CDC25B蛋白磷酸酶的關(guān)鍵位點(diǎn)S149和S321調(diào)控小鼠受精卵發(fā)育[10]，CDC25B和Wee1B蛋白在調(diào)控MPF活性時(shí)起相反作用，那么，PKA是否磷酸化Wee1B 的S15來調(diào)控MPF的活性進(jìn)而影響小鼠受精卵早期發(fā)育還需更進(jìn)一步證明。

本研究首先在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中過表達(dá)Wee1B蛋白S15位點(diǎn)的非磷酸化和模擬磷酸化的兩種突變體pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-S15A/D，并在突變體，在dbcAMP作用下，探討PKA磷酸化靶點(diǎn)Wee1B蛋白S15對小鼠受精卵早期發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究母源性因子Wee1B在早期胚胎發(fā)育過程中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑來源

質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT（wild-type，野生型）/KD（kinase-dead，激酶失活型）由Marco Conti教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-S15A/D本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ambion公司，美國）；Wee1B-S15磷酸化和非磷酸化抗體、Wee1B抗體（Signalway antibody公司）；M2和M16培養(yǎng)液（Sigma公司，美國）；內(nèi)切酶Xhol I（Takara公司，日本）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京）；孕馬血清促性腺激素（華孚高新技術(shù)生物公司，天津）；人絨毛膜促性腺激素購于中國上海生物勝華制藥；剩余試劑購自美國Sigma公司。

1.2小鼠受精卵的采集和培養(yǎng)

小鼠超排卵、受精卵的收集和培養(yǎng)依據(jù)Hogan的方法稍加修改進(jìn)行[11]。取昆明系SPF級4～5周齡成熟雌性小白鼠，每只雌鼠腹腔注射10 IU的PMSG；注射后46～48 h腹腔注射10 IU的hCG，當(dāng)晚即將每只雌鼠與一只性成熟的雄性小鼠合籠。第二天早上查看雌鼠的陰栓，如果有陰栓，此雌鼠則交配成功。脫頸法處死交配成功的雌鼠，暴露雙側(cè)輸卵管，將其取出置于M2培養(yǎng)液。于顯微鏡下扯開輸卵管的壺腹部，可見細(xì)胞團(tuán)流出，透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞后，將其放入M16培養(yǎng)液中清洗并培養(yǎng)至指定時(shí)間收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 體外轉(zhuǎn)錄和顯微注射

Xhol I酶切線性化質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT/KD和pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-S15A/D 1 μg，按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法轉(zhuǎn)錄成帶帽和加尾的mRNAs，溶解于TE緩沖液（5 mmol/L Tris和0.5 mmol/L EDTA，pH7.4）中。在含有受精卵M16培養(yǎng)液中預(yù)先加入2 mmol/L dbcAMP 1 h后，分別向受精卵胞漿中顯微注射10 pL Wee1B各種mRNAs。注射后的受精卵繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置未注射組和TE緩沖液注射組作為對照。

1.4 相差顯微鏡觀察受精卵形態(tài)變化

顯微注射各組和對照組受精卵在含有dbcAMP 的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，一定時(shí)間后相差顯微鏡下觀察受精卵形態(tài)變化和分裂情況，并在hCG注射后35 h時(shí)計(jì)算卵裂率。

1.5放射自顯影方法檢測受精卵MPF活性

參照相關(guān)文獻(xiàn)[8，12]建立的經(jīng)典方法檢測MPF活性。顯微注射后各組受精卵于hCG注射29 h后每間隔30 min取5個(gè)受精卵轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，加入適量MPF反應(yīng)液，30℃水浴反應(yīng)7 min。取反應(yīng)液點(diǎn)在Whatman P81濾紙上，終止反應(yīng)后將濾紙置于液閃瓶內(nèi)，液閃計(jì)數(shù)儀測定每分鐘放射活性（cpm值）。

1.6 Western blotting方法檢測Wee1B蛋白表達(dá)及Wee1B-Ser15和CDC2-pTyr15磷酸化狀態(tài)

將各組收集的160個(gè)受精卵（hCG注射后29 h、30 h、31 h、32 h、33 h、34 h、35 h）轉(zhuǎn)移至滅菌過的EP管中，3000 r/min離心10 min，蛋白提取緩存液裂解沉淀，加入5×SDS樣品緩沖液煮沸使蛋白變性，冷凍離心后上樣。10% SDS-PAGE電泳分離、蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含3%BSA的TBST（pH7.4）室溫封閉2 h，PVDF膜與Wee1B抗體（稀釋比為1∶1000）、Wee1B-Ser15非磷酸化抗體（1∶200）、Wee1B-Ser15磷酸化抗體（1∶200）、CDC2-pTyr15磷酸化抗體（1∶500）及β-Actin抗體（1∶1000）溫育過夜。TBST洗膜3次后，HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶5000）室溫繼續(xù)孵育2 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像。endprint