劉 輝

（江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校護(hù)理系，江蘇 南通 226001）

靈芝孢子粉對(duì)癲癇大鼠腦組織線(xiàn)粒體鈣和c-Fos的影響

劉 輝

（江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校護(hù)理系，江蘇 南通 226001）

目的研究靈芝孢子粉對(duì)癲癇大鼠腦組織組織線(xiàn)粒體鈣和c-Fos的影響。方法對(duì)健康雄性Wistar大鼠45只進(jìn)行建模，隨機(jī)分成對(duì)照組（生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃），模型組（PTZ腹腔注射+生理鹽水灌胃），靈芝孢子粉組（PTZ腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃），每組各15只，采用火焰原子吸收法測(cè)定3組腦組織線(xiàn)粒體Ca2+的水平，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦組織c-Fos。結(jié)果c-Fos在大鼠皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)均可見(jiàn)表達(dá)。與對(duì)照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的c-Fos表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；靈芝孢子粉組的線(xiàn)粒體Ca2+水平明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論靈芝孢子粉通過(guò)增加線(xiàn)粒體Ca2+水平及抑制c-Fos的表達(dá)來(lái)減少癲癇發(fā)作對(duì)腦細(xì)胞線(xiàn)粒體所造成的損傷，進(jìn)而達(dá)到抗癲癇的效果。

靈芝孢子粉；癲癇；大鼠；腦組織；線(xiàn)粒體鈣；c-Fos

癲癇屬于一種比較常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，此病對(duì)患者的生存質(zhì)量危害比較大[1]。目前，治療癲癇的藥物比較多，但是效果不盡相同[2-3]。同時(shí)，一些新的抗癲癇藥物也隨著藥物學(xué)的發(fā)展而不斷出現(xiàn)，雖然在抗癲癇方面獲得了突破性進(jìn)展，但是對(duì)于難治性癲癇尚是一大頑疾，有待新的治療此類(lèi)難治性癲癇的藥物的出現(xiàn)。靈芝孢子粉是近年來(lái)人們比較關(guān)注的一類(lèi)藥物[4]，但是關(guān)于其在抗癲癇過(guò)程中的作用機(jī)制尚不是很明確。本研究著重探討靈芝孢子粉對(duì)癲癇大鼠腦組織組織線(xiàn)粒體鈣和c-Fos的影響，以揭示靈芝孢子粉在抗癲癇中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料。靈芝孢子粉：購(gòu)自山東云海靈芝專(zhuān)業(yè)合作社；戊四氮（PTZ）：購(gòu)自上海博頓生物化工有限公司；兔抗大鼠c-Fos多克隆抗體：購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒：購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：健康雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量152～234 g，普通級(jí)動(dòng)物，由某醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)體質(zhì)量把45只大鼠隨機(jī)分成3組：分成對(duì)照組（生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃），模型組（PTZ腹腔注射+生理鹽水灌胃），靈芝孢子粉組（PTZ腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃），每組各15只。

1.3 腦組織細(xì)胞線(xiàn)粒體鈣測(cè)定：將3組大鼠運(yùn)用斷頭低溫快速取出大腦，腦膜給予剔除干凈之后，運(yùn)用蔗糖-Tris緩沖液及玻璃勻漿器把腦組織制作成勻漿，實(shí)施差速離心，獲得線(xiàn)粒體沉淀物，收集線(xiàn)粒體懸液在陰暗處進(jìn)行硝化1周。使用原子火焰吸收分光計(jì)對(duì)線(xiàn)粒體鈣吸光度進(jìn)行測(cè)定。

1.4 腦組織c-Fos的測(cè)定：將3組大鼠麻醉后進(jìn)行斷頭處死操作，低溫下快速取腦，并分離出海馬組織，運(yùn)用中性甲醛溶液對(duì)其行24 h以上的固定操作，接著采用PBS水給予沖洗5次，使用酒精梯度實(shí)施脫水之后，運(yùn)用石蠟進(jìn)行包埋大腦皮質(zhì)和海馬組織，采用錫紙包裹好之后置入冰箱中用于腦組織c-Fos的檢測(cè)。

使用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定各組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中的c-Fos水平，操作步驟分別嚴(yán)格按照兔抗大鼠c-Fos試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。染色切片在BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)顯微鏡下觀(guān)察，呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。每張切片觀(guān)察10個(gè)有代表性的視野，并計(jì)數(shù)每一個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以檢測(cè)c-Fos的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2分析，均以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大腦組織織線(xiàn)粒體Ca2+比較：與對(duì)照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的織線(xiàn)粒體Ca2+含量明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大腦組織織線(xiàn)粒體Ca2+比較（μg/mL，

表1 各組大腦組織織線(xiàn)粒體Ca2+比較（μg/mL，

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，aP＜0.05

組別n皮質(zhì)區(qū)海馬區(qū)對(duì)照組155.57±0.849.64±1.73模型組157.14±1.23*11.16±2.56*靈芝孢子粉組159.43±2.05*a18.82±3.41*a

2.2 各組大腦組織c-Fos表達(dá)水平比較：與對(duì)照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的c-Fos表達(dá)水平明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)表2。c-Fos表在大鼠皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)見(jiàn)圖1～2；c-Fos表在大鼠海馬區(qū)的表達(dá)見(jiàn)圖2。

表2 各組大腦組織c-Fos表達(dá)水平比較（個(gè)/視野，

表2 各組大腦組織c-Fos表達(dá)水平比較（個(gè)/視野，

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，aP＜0.05

組別n皮質(zhì)區(qū)海馬區(qū)對(duì)照組1525.34±2.1421.15±5.37模型組1563.57±4.27*43.56±9.64*靈芝孢子粉組15124.35±5.16*a86.24±10.35*a

3 討 論

一般情況下，Ca2+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞膜興奮性具有穩(wěn)定及維持的作用，如果血液中的Ca2+水平減少，則神經(jīng)細(xì)胞膜電位就會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定，進(jìn)而激發(fā)癲癇的發(fā)作，產(chǎn)生異常放電[5-7]。因此，Ca2+水平發(fā)生失衡為癲癇發(fā)病的一個(gè)可能機(jī)制。本研究顯示，與對(duì)照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的線(xiàn)粒體Ca2+水平明顯增加（P＜0.05）。說(shuō)明，靈芝孢子粉可以調(diào)節(jié)Ca2+含量而對(duì)神經(jīng)元起到一定的保護(hù)作用。

相關(guān)研究表明[8-9]，癲癇發(fā)作時(shí)c-Fos會(huì)發(fā)生改變。由此可見(jiàn)，c-Fos在一定程度上可以反映出神經(jīng)元之興奮狀態(tài)，通過(guò)c-Fos的影響因素進(jìn)行干預(yù)，能夠調(diào)節(jié)c-Fos的表達(dá)，使之上調(diào)或者下調(diào)[10]。本研究顯示，c-Fos在大鼠皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)均可見(jiàn)表達(dá)。與對(duì)照組和模型組比較，靈芝孢子粉組的c-Fos表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。說(shuō)明，靈芝孢子粉是通過(guò)減少腦內(nèi)c-fos基因表達(dá)的途徑來(lái)起到抗癲癇的效果。

圖1 c-Fos表在大鼠皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)（DAB，×200）

圖2 c-Fos表在大鼠海馬區(qū)的表達(dá)（DAB，x200）

綜上所述，靈芝孢子粉通過(guò)增加線(xiàn)粒體Ca2+水平及抑制c-Fos的表達(dá)來(lái)減少癲癇發(fā)作對(duì)腦細(xì)胞線(xiàn)粒體所造成的損傷，進(jìn)而發(fā)揮抗癲癇的作用。

[1] 趙璐,王淑秋,王喆.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織GDNF與NT-3表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26(4):812-815.

[2] Deshpande LS,Lou JK,Mian A,et al.Time course and mechanism of hippocampal neuronal death in an in vitro model of status epilepticus: Role of NMDA receptor acti- vation and NMDA dependent calcium entry[J] .Eur J Pharmacol,2008,583(1):73-83.

[3] Faught E,Richman J,Martin R,et al.Incidence and prevalence of epilepsy among older US Medicare beneficiaries[J]. Neurology,2012, 78(7):448-453.

[4] 趙春霞,郝冰.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠NGF的影響[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,34(2):28-29.

[5] 趙爽,張勝昌,王淑秋.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮慢性點(diǎn)燃大鼠學(xué)習(xí)記憶及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2013,33(1):354-356.

[6] 趙春霞,郝冰.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠 NGF 的影響[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,34(2):28-29.

[7] Goodkin HP,Yeh JL,Kapur J.Status epilepticus increases the intracellular accumulation of GABAA receptors[J].J Neurosci, 2005,25(23):5511-5520.

[8] van Drongelen W,Lee HC,Hereld M,et al.Emergent epileptiform activity in neural networks with weak excitatory synapses[J]. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng,2005,13(2):236-241.

[9] Sun C,Mtchedlishvili Z,Bertram EH,et al.Selective loss of dentate hilar interneurons contributes to reduced synaptic inhibition of granule cells in an electrical stimulation- based animal model of temporal lobe epilepsy[J].J Comp Neurol,2007,500(5):876-893.

[10] 趙璐,王淑秋,王喆.靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織GDNF與NT-3表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2010,26(4):812-815.

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1671-8194（2017）22-0051-02

江蘇省衛(wèi)生科研項(xiàng)目JZ201319