徐秀英徐 欣高振南,2*

（1 山東大學(xué)口腔醫(yī)院，山東 濟南 250012；2 山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東 濟南 250012）

低糖基化E-鈣黏蛋白對Tca8113舌鱗癌細胞增殖的影響

徐秀英1徐 欣1高振南1,2*

（1 山東大學(xué)口腔醫(yī)院，山東 濟南 250012；2 山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點實驗室，山東 濟南 250012）

目的研究低糖基化的E-鈣黏蛋白（E-cadherin）對Tca8113舌鱗癌細胞增殖的影響。方法以Tca8113細胞系作為研究樣本，應(yīng)用含低糖基化的E-cadherin （V13）基因的質(zhì)粒和含野生型E-cadherin基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Tca8113細胞，用western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定表達。通過MTT法和流式細胞術(shù)判定V13基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113細胞對細胞增殖活性的影響；采用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果①Western blot結(jié)果顯示：空白對照組無標記蛋白表達，V13基因質(zhì)粒和野生型E-cadherin基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113細胞后均穩(wěn)定表達，V13的相對分子質(zhì)量為120 kD小于野生型E-cadherin的相對分子質(zhì)量150 kD。②MTT結(jié)果顯示：與空白對照組細胞相比，V13基因轉(zhuǎn)染組細胞的增殖活性有明顯降低，而野生型E-cadherin轉(zhuǎn)染組細胞的增殖活性無明顯改變。③流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：與空白對照組細胞相比，V13基因轉(zhuǎn)染組細胞的S期比率下調(diào)約18.42%，降低明顯，而野生型E-cadherin轉(zhuǎn)染組細胞的S期細胞比率改變不明顯。結(jié)論V13基因轉(zhuǎn)染比野生型E-cadherin基因轉(zhuǎn)染Tca8113細胞能更顯著地抑制該細胞的體外增殖。

E-cadherin；低糖基化；增殖

E-cadherin是構(gòu)成相鄰上皮細胞間黏附連接 （adherens junctions，AJs）的單次跨膜糖蛋白，細胞外域中有4個N-糖鏈。E-cadherin介導(dǎo)相鄰細胞間的AJs。E-cadherin的表達水平與腫瘤細胞的增殖有密切的關(guān)系，研究指出腫瘤細胞間E-cadherin的表達水平均顯著下降，而且E-cadherin的表達水平越低，腫瘤細胞增殖性越強，分化程度越低，患者預(yù)后也會越差[1-3]。在本課題中，我們將研究V13基因?qū)ι圜[癌細胞體外增殖的影響，為V13基因?qū)δ[瘤細胞體內(nèi)增殖的影響奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料。質(zhì)粒：①減少E-cadherin細胞外域兩個N-糖基化位點的低糖基化E-cadherin（V13）基因的質(zhì)粒；②攜帶野生型E-cadherin（wildtype E-cadherin）基因的質(zhì)粒。

細胞株：由上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院建株的人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞系。

1.2 Tca8113細胞的培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染：將Tca8113細胞置于含全營養(yǎng)RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞長至80%融合時傳代。將實驗細胞分為空白對照組、野生型E-cadherin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和V13質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染24 h后，G418篩選3周，建立穩(wěn)定表達細胞系。

1.3 Western blot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后是否穩(wěn)定表達及表達蛋白的大?。菏占疶ca8113細胞，提取總蛋白后測定濃度。取20 μg總蛋白SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉液中室溫搖動2 h，TBST洗5 s，然后進行抗體孵育。稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。TBST搖動洗膜數(shù)次。室溫置于雜交爐中孵育稀釋的二抗2 h。TBST搖動洗膜數(shù)次去除殘留二抗。ECL Plus發(fā)光試劑盒于暗室中曝光、顯影、定影。

1.4 MTT法檢測細胞增殖：對數(shù)生長期細胞接種貼壁后，每隔24 h設(shè)定檢測時間點，向每孔加入5 mg/mL的MTT工作液20 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min后比色，以光吸收值為縱軸，以檢測時間點為橫軸繪制出生長曲線。以上實驗重復(fù)3次。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期：取同步化后的待檢測細胞制成單細胞懸液，固定細胞后收集。PBS重懸細胞后輕輕吹打。加入2 μL RNaseA至終濃度50 μg/mL，避光37 ℃孵育30 min。加入50 μL PI至終濃度65 μg/mL，避光冰浴染色30 min。300目尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀測定分析細胞周期。以上實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：以“平均數(shù)±標準差”表示所有數(shù)據(jù)。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用t檢驗方法，P＜0.05認為有差異，P＜0.01認為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測蛋白表達水平差異：低糖基化E-cadherin的相對分子質(zhì)量為120 kD，野生型E-cadherin的相對分子質(zhì)量為150 kD，空白對照組無蛋白表達。即低糖基化的E-cadherin相對分子質(zhì)量小于野生型E-cadherin的相對分子質(zhì)量（圖1）。

圖1 Western blot檢測三種細胞的蛋白表達

2.2 MTT法檢測細胞增殖能力差異：V13顯著抑制Tca8113細胞的增殖，野生型E-cadherin同樣抑制Tca8113細胞的增殖，自48h起V13組細胞的OD值顯著低于對照細胞（圖2）。

圖2 三組細胞的增殖曲線

2.3 流式細胞術(shù)檢測三組細胞的細胞周期分布：相比空白對照組，V13組細胞S期比例下調(diào)了約18.42%，二者之間有顯著性差異；E-cadherin組細胞S期比例下調(diào)約13.91%，二者之間差異不明顯（圖3）。

圖3 流式細胞術(shù)分析細胞周期的不同

3 討 論

口腔癌是全球?qū)е滤劳龅牡诎舜蟀┌Y[4]。2012年，全球有145400例口腔癌致死亡病例，同時有300400例新發(fā)口腔癌病例[5]。在口腔癌病例中，口腔鱗狀細胞癌（OSCC）占90%以上[6]。雖然在過去的數(shù)十年中臨床診斷和治療有很大的提升，但OSCC生存率并沒有顯著改善，并且5年生存率仍處于50%[7]。因此，我們迫切的需要一種有效干預(yù)OSCC細胞增殖的治療方法。

E-cadherin是細胞表面的單次跨膜N-糖蛋白，它介導(dǎo)構(gòu)成了上皮細胞間的AJs。E-cadherin的細胞外域經(jīng)鈣離子作用形成二聚體，而后通過嗜同黏附效應(yīng)，相鄰細胞表面的二聚體形成了AJs[8]。蛋白質(zhì)翻譯后最主要的修飾方式是糖基化，被糖鏈共價修飾形成糖蛋白占50%以上[9]。糖基化能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)生物學(xué)功能起到重要調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已知由蛋白質(zhì)翻譯后糖基化的缺陷而引起的遺傳性疾病有至少30種[10]。所以我們推斷維持細胞間AJs穩(wěn)定性、細胞間的黏附識別會受到E-cadherin的翻譯后N-糖基化修飾改變的影響。

有研究將人、犬和小鼠共有的3個蛋白質(zhì)翻譯后的N-糖基化位點的氨基酸位點進行替換，從而阻止了E-cadherin這些位點的翻譯后修飾。而后研究了各種變異的減少N-糖基化位點的E-cadherin與其相關(guān)的AJs的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)減少N-糖基化位點的E-cadherin介導(dǎo)的AJs比野生型E-cadherin介導(dǎo)的AJs更加牢固[10]。

本實驗所采用的即為減少了兩個N-糖基化位點的低糖基化E-cadherin基因的質(zhì)粒（V13），對照質(zhì)粒為野生型E-cadherin基因質(zhì)粒，實驗細胞株為人舌鱗狀細胞癌細胞Tca8113。Western blot實驗證實，兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均有穩(wěn)定表達，并且低糖基化的E-cadherin相對分子質(zhì)量小于野生型E-cadherin的相對分子質(zhì)量。所以于Tca8113細胞內(nèi)研究低糖基化的E-cadherin對舌鱗癌細胞增殖的影響及原理是可行的。

本研究從減少E-cadherin的翻譯后N-糖基化修飾的新途徑，證實低糖基化修飾的E-cadherin（V13）比野生型E-cadherin對腫瘤細胞間AJs的穩(wěn)定性和抑制腫瘤增殖方面有著更顯著的影響，為接下來研究低糖基化E-cadherin抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移奠定理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，并為臨床中阻止腫瘤細胞增殖提供了新的研究途徑。在后續(xù)的實驗研究中，我們將進一步研究低糖基化E-cadherin對腫瘤細胞體外增殖能力減弱的原理，從新的角度展示腫瘤轉(zhuǎn)移的一種新機制，為臨床中防止腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的有效的治療方式。

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Effects of Low Glycosylated E-cadherin on Proliferation of Tca8113 Squamous Cell Carcinoma of Tongue

XU Xiu-ying1, XU Xin2, GAO Zhen-nan1,2*
(1 Stomatological Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China; 2 Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedical, Jinan 250012, China)

ObjectiveThe effects of hypoglycosylated E-cadherin gene on the tongue aquamous cell’s proliferation after transfected into Tca8113 cells.MethodTca8113 tongue squamous cell lines is our sample. V13 gene and wild-type E-cadherin protein gene were transfected into Tca8113 cell. We use western blot to detect the stable expression of the transfected gene. MTT assay and FACS analysis measured the proliferation of different groups of cells.Result①Western blotting: The V13 gene and wild-type E-cadherin gene were stably expressed after transfected. The result showed that molecular weight of V13 was smaller than wild-type E-cadherin. ②MTT assay: The V13 gene transfected group had a significantly proliferation decrease, while the wild-type E-cadherin gene transfected group had no obvious proliferation change. ③FACS results: The S-phase ratio of V13 gene transfected cells reduced 18.42%, while no significant change in the wild-type E-cadherin transfected group.ConclusionV13 gene inhibits cell proliferation of Tca8113 cell more obviously than the wild-type E-cadherin gene.

E-cadherin; Hypoglycosylate; Proliferation

R739.86

B

1671-8194（2017）22-0026-02

*通訊作者:E-mail: zngao@sdu.edu.cn