王俊娟，陰祖軍，王德龍，王帥，王曉歌，樊偉麗，郭麗雪，陳超，葉武威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河南安陽455000）

陸地棉脫水素蛋白GhDHN1的結(jié)構(gòu)特征和無序性分析

王俊娟，陰祖軍，王德龍，王帥，王曉歌，樊偉麗，郭麗雪，陳超，葉武威*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河南安陽455000）

利用生物信息學(xué)對陸地棉脫水素蛋白GhDHN1的氨基酸組成理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域K片段以及無序性進行分析。結(jié)果表明，GhDHN1蛋白無明顯跨膜結(jié)構(gòu)，不是分泌蛋白，其2個序列相近的K片段均具有高度親水性，屬于部分無序性蛋白。推測GhDHN1的這些結(jié)構(gòu)特性與其調(diào)控棉花響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)。

棉花；脫水素蛋白GhDHN1；結(jié)構(gòu)特征；K片段；無序性

脫水素屬胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白 （Lateembryogenesisabundant protein,LEA）第二家族成員[1]，是植物中廣泛存在的親水性蛋白，與植物抗逆密切相關(guān)[2]。脫水素蛋白具有很強的熱穩(wěn)定性，在非生物逆境下可以穩(wěn)定植物細胞膜結(jié)構(gòu)[3]。脫水素的結(jié)構(gòu)是其行使功能的前提條件，脫水素的K片段所形成的雙親性螺旋與部分變性蛋白的疏水位點相結(jié)合，起到類似于分子伴侶的作用[4]。筆者團隊在陸地棉（Gossypium hirsutumL.）3葉期的真葉中克隆了棉花脫水素基因GhDHN1，試驗結(jié)果顯示，GhDHN1響應(yīng)低溫脅迫，在抗冷材料和冷敏感材料中表達水平差異顯著，其表達量與棉花的抗冷性呈正相關(guān)[5]。研究還表明，GhDHN1編碼的蛋白含有211個氨基酸，預(yù)測相對分子質(zhì)量為23.79 kD，等電點為5.04；GhDHN1的二級結(jié)構(gòu)α螺旋包含116個氨基酸殘基，組成該蛋白的主體結(jié)構(gòu)。但GhDHN1蛋白在棉花抗冷中所行使的具體功能尚需進一步研究，其蛋白質(zhì)性質(zhì)與其功能的關(guān)系尚不清楚。本研究對GhDHN1蛋白的結(jié)構(gòu)特性和無序性進行分析，為探索脫水素蛋白GhDHN1的分子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試數(shù)據(jù)庫和脫水素蛋白GhDHN1序列的獲取

從已公布的陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫[6]（http://cgp.ge

nomics.org.cn/page/species/index.jsp）以及王俊娟等[5]研究結(jié)果獲得所需要的棉花脫水素蛋白GhDHN1序列（序列號：CotAD_58358）。

1.2 方法

1.2.1 脫水素蛋白GhDHN1跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析。利用在線工具TMHMM Server（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0）分析GhDHN1的跨膜結(jié)構(gòu)；利用在線工具SignalP Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）分析GhDHN1蛋白質(zhì)N端的信號肽。

1.2.2 脫水素蛋白GhDHN1核心結(jié)構(gòu)域分析。用在線 Needle軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html）將 Close[7]報道的脫水素結(jié)構(gòu)域序列與GhDHN1蛋白質(zhì)序列進行全局比對，分析GhDHN1保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.3GhDHN1蛋白功能結(jié)構(gòu)示意圖繪制。利用在線功能結(jié)構(gòu)域制圖軟件DOG1.0[8]（http://ibs.biocuckoo.org/online.php）繪制。

1.2.4 脫水素蛋白GhDHN1固有無序性研究。利用在線工具PONDR○RVL-XT[9]（Predictors of Natural Disordered Regions,http://www.pondr.com/）分析GhDHN1蛋白的固有無序性。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫水素蛋白GhDHN1跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析

由圖1可以看出，GhDHN1無明顯跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1A），不屬于跨膜蛋白，這與其具有高度親水性的特性相符合；其N端沒有信號肽段（圖1B），說明GhDHN1不屬于分泌蛋白。

2.2 脫水素蛋白GhDHN1核心結(jié)構(gòu)域特性分析

K片段是1段由15個氨基酸殘基組成的富含賴氨酸的結(jié)構(gòu)域（EKKGIMDKIKEKLPG），是脫水素DHN的特征結(jié)構(gòu)，每個脫水素蛋白中至少含1個K片段[10]。通過對GhDHN1與NCBI上報道的脫水素蛋白序列進行多重比較發(fā)現(xiàn)，依據(jù)Close[7]報道的脫水素結(jié)構(gòu)域序列與GhDHN1蛋白質(zhì)序列進行全局序列比對，發(fā)現(xiàn)GhDHN1的N端第81～88個氨基酸殘基之間含有1個保守的S片段 （由8個連續(xù)的絲氨酸組成：SSSSSSSS），C端含有2個K片段，分別為位于144～158位的EKKGFLEKIKEKLPG和位于185～199的EKKGILEKIKEKLPG，分別記為K1和K2，不含Y片段（圖1），符合SKn類型脫水素結(jié)構(gòu)特點[7]。進一步分析表明，GhDHN1的K1的氨基酸殘基組成，與大多數(shù)物種脫水素的共有結(jié)構(gòu)K片段（EKKGIMDKIKEKLPG）的相似性為93.3.0%，一致性為80.0%，有3個氨基酸殘基的差異，而K2的氨基酸殘基組成與后者的相似性為100%，一致性為86.7%，有2個氨基酸殘基不同。GhDHN1的2個K片段之間只有1個氨基酸殘基不同。進一步對其理化性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，GhDHN1的2個K片段均富含帶電和極性氨基酸，其中賴氨酸含量為33.3%，谷氨酸含量為20.0%，甘氨酸含量為13.3%，說明GhDHN1蛋白的K片段具有高度親水性，與高粱（Sorghum bicolor）的脫水素蛋白SbDHN1的K片段特性很相似[11]。

圖1 GhDHN1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析示意圖

圖2 GhDHN1蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖

2.3 脫水素蛋白GhDHN1的無序性分析

通過無序性分析軟件PONDR[9]對GhDHN1蛋白結(jié)構(gòu)進行無序性分析，輸出結(jié)果（圖3）顯示GhDHN1是1個固有無序性蛋白（Intrinsically disordered protein，IDP）。圖3中縱坐標(biāo)預(yù)測值大于0.5的認為趨于無序分布，小于0.5趨于有序分布[9]。圖3顯示，GhDHN1的211個氨基酸殘基中，有109個是無序的，占總氨基酸殘基數(shù)的51.66%，含有5個無序區(qū)域，分別位于氨基酸殘基1～27，72～113，128～138，164～180和200～211之間，最長的無序區(qū)域位于氨基酸殘基72～113之間（圖3中畫黑粗線的區(qū)域），包含有42個氨基酸殘基。這些結(jié)果說明GhDHN1是1個部分無序蛋白。

圖3 脫水素蛋白GhDHN1的PONDR預(yù)測結(jié)果

3 討論

脫水素蛋白是高度親水性蛋白，在植物中響應(yīng)干旱、低溫、鹽等造成的滲透脅迫[12]，其序列富含帶電和極性氨基酸殘基，缺少不帶電荷和非極性氨基酸殘基如色氨酸和半胱氨酸[13]，特別是其保守結(jié)構(gòu)域K片段富含賴氨酸，可形成α-雙螺旋兩親的二級結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有親水性和疏水性的雙重特征[7]，可與膜和蛋白相互作用，在植物遭遇滲透脅迫時起穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)的作用[14]，而Y片段一般不與膜結(jié)合，與植物的抗冷性關(guān)系不密切[15]。冷脅迫對植物造成的最大傷害主要是對細胞膜的損傷[16-17]，K片段富含帶正電荷的賴氨酸，與帶負電荷的細胞膜脂質(zhì)頭部基團相互作用，起穩(wěn)定細胞膜作用[18]，可使細胞膜在低溫下保持流動性，使其在低溫條件下也能正常發(fā)揮作用[19]。本研究表明GhDHN1含有2個K片段，不含Y片段，這與筆者團隊前期的研究結(jié)果相一致，即GhDHN1表達的蛋白可能在細胞膜附近行使功能，調(diào)控棉花響應(yīng)低溫脅迫[5]，據(jù)推測，這些功能與其含有2個K片段的結(jié)構(gòu)具有一定相關(guān)性。

脫水素缺少有序的三級結(jié)構(gòu)，屬于IDP，可以在水分脅迫過程中或在低溫條件下阻止蛋白質(zhì)或酶的變性[20-21]，具有IDP性質(zhì)的脫水素會在清除自由基和結(jié)合金屬離子方面發(fā)揮雙重作用[12,22]。本研究中 PONDR的輸出結(jié)果顯示棉花脫水素GhDHN1屬于部分無序性蛋白，推測是由于GhDHN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的無序性，使其在低溫脅迫下具有更高的結(jié)構(gòu)彈性和適應(yīng)性，容易與細胞膜中的酸性磷酸脂特異結(jié)合，對細胞膜起保護作用[23]，從而使GhDHN1的積累與棉花的抗冷性呈正相關(guān)[5]，減輕低溫脅迫對棉花的傷害。

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The Structure and Disordered Characteristics of GhDHN1 from Upland Cotton

Wang Junjuan,Yin Zujun,Wang Delong,Wang Shuai,Wang Xiaoge,Fan Weili,Guo Lixue,Chen Chao,Ye Wuwei*

Q754：S562.01

A

1000-632X（2017）08-0017-04

10.11963/1000-632X.wjjyww.20170821

2017-04-27 *通信作者：yew158@163.com

國家重點研發(fā)計劃 “七大農(nóng)作物育種”（2016YFD0100203）