梁敏，張文舉，張凡凡，陳寧，尹君亮

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000)

飼喂發(fā)酵棉粕肉牛牛糞中細(xì)菌數(shù)量及多樣性研究

梁敏1，張文舉1，張凡凡1，陳寧2，尹君亮2

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000)

【目的】研究飼喂發(fā)酵棉粕對(duì)安格斯肉牛牛糞中細(xì)菌數(shù)量及多樣性的影響?！痉椒ā坎捎闷桨逵?jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)菌的數(shù)量；采用PCR技術(shù)對(duì)提出的DNA進(jìn)行細(xì)菌16Sr DNA基因V6-V8區(qū)擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。得到指紋圖譜特異性條帶切膠回收并進(jìn)行克隆測(cè)序，通過(guò)BLAST鑒定細(xì)菌菌種?！窘Y(jié)果】(1)試驗(yàn)前期，C組和T組總細(xì)菌、大腸桿菌和乳酸菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組金黃色葡萄球菌差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)后期，C組和T組總細(xì)菌差異不顯著(P>0.05)；C和T組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和乳酸菌差異顯著(P<0.05)。(2)牛糞中存在的菌種有沙門氏菌(Salmonella)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、乳酸菌(Lactobacillus)、毛螺旋菌(Lachnospiraceae)、志賀菌(Shigella)、梭菌(Clostridium)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸桿菌(Enterobacter)和腸球菌(Enterococcus)，而其中乳酸菌、大腸桿菌可能是牛糞中的優(yōu)勢(shì)菌群?！窘Y(jié)論】試驗(yàn)前期和后期總細(xì)菌、大腸桿菌、金黃色葡萄菌的數(shù)量有明顯變化，牛糞中存在多種細(xì)菌表現(xiàn)了牛糞中微生物菌群的多樣性。

發(fā)酵棉粕；細(xì)菌；數(shù)量；DGGE；多樣性

0 引 言

【研究意義】蛋白質(zhì)是維持生命機(jī)體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。畜牧業(yè)中常采用谷物、餅粕、草類等原料配制動(dòng)物日糧來(lái)滿足動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需求[1-2]。目前隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，蛋白飼料緊缺問(wèn)題逐漸凸顯，原有常規(guī)飼料亦然不能滿足目前快速發(fā)展的需求，所以如何合理開發(fā)和利用其它非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。棉籽因其產(chǎn)量高、蛋白含量豐富、代謝能高等，因此開發(fā)其副產(chǎn)物不僅可減少資源浪費(fèi)，且為有效解決我國(guó)飼料緊缺問(wèn)題提供了可能[3-4]。【前人研究進(jìn)展】棉粕經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，其表面附著的微生物利用底物大量繁殖，不僅提高了自身菌體蛋白的含量，且有益于家畜的有效利用[5]。然而動(dòng)物腸道中寄生著種類繁多和數(shù)量巨大的微生物。在正常情況下，互相之間以穩(wěn)定的比例關(guān)系與宿主腸道相互依存又相互影響，形成動(dòng)態(tài)的微生態(tài)平衡。而飼料源是否發(fā)酵可能會(huì)影響家畜腸道菌群的穩(wěn)定性，從而影響家畜的吸收利用水平[6-8]。嗜酸乳酸桿菌能夠調(diào)整腸道菌群平衡，其分泌的抗生物素類物質(zhì)嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素，對(duì)腸道致病菌產(chǎn)生的拮抗作用，抑制腸道不良微生物的增殖?？莶菅挎邨U菌能促進(jìn)有益厭氧菌生長(zhǎng)，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致病菌生長(zhǎng)。提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能。其合成的α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用[9]。劉忠元[10]用熱帶假絲酵母發(fā)酵玉米秸稈粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米秸稈粉中的粗纖維含量下降，粗蛋白含量提高，可以提高秸稈的飼用價(jià)值?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母均可以作為發(fā)酵棉粕的微生物制劑，但是三種菌混合發(fā)酵的棉粕對(duì)于肉牛的作用還需要進(jìn)一步的研究。而且目前發(fā)酵棉粕在肉牛上的應(yīng)用還比較欠缺，有關(guān)發(fā)酵棉粕日糧對(duì)肉牛腸道微生物影響方面的報(bào)道也比較少[11-12]，應(yīng)該引起足夠重視。腸道正常菌群與腸道免疫系統(tǒng)的形成和功能、腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有密切關(guān)系，并可以阻擋病原微生物的入侵[13-14]。據(jù)研究報(bào)道，糞中微生物與結(jié)腸微生物間具有99%的相似性[15]，因此可利用糞樣來(lái)反映腸道微生物的菌群情況。傳統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)多采取分離鑒定的方法進(jìn)行研究，而對(duì)于復(fù)雜體系且不能分離培養(yǎng)的微生物很難進(jìn)行群落研究。采用PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分子指紋圖譜技術(shù)對(duì)于難以分離的菌種可以進(jìn)行快速有效的檢測(cè)[16-18]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)發(fā)酵棉粕飼喂肉牛糞樣中的主要細(xì)菌含量進(jìn)行研究，并采用PCR-DGGE技術(shù)探討其糞樣中細(xì)菌多樣性，以期揭示發(fā)酵棉粕飼喂對(duì)肉牛腸道微生物菌群數(shù)量和多樣性特征規(guī)律，為健康的肉牛養(yǎng)殖技術(shù)提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

新疆西部波爾多牧業(yè)有限責(zé)任公司選取10月齡左右，健康無(wú)疾病，初始體重差異不顯著(259.11±35.62) kg的黑安格斯肉牛18頭，隨機(jī)分成兩組(每組9頭)，即試驗(yàn)(Treatment, T)和對(duì)照(Control, C)處理。試驗(yàn)期從2016年10月8至11月18日，共42 d，預(yù)飼期10 d，正飼期32 d。T處理添加6 %的發(fā)酵棉粕，C處理添加6 %的未發(fā)酵棉粕。發(fā)酵棉粕和未發(fā)酵棉粕購(gòu)于新疆天康飼料添加劑公司生產(chǎn)的成品。發(fā)酵使用的菌種是嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)以及熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)。列出2個(gè)處理與精料混合再與基礎(chǔ)日糧制成TMR，混勻后飼喂，每天分別于06:00和18:00飼喂，任其自由采食，自由飲水。牛舍溫度控制與室外氣溫相同(10℃)，自然光照。表1，表2

表1 發(fā)酵棉粕營(yíng)養(yǎng)水平

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

注：1、精料成分為玉米51%、麩皮24%、豆粕18%、尿素1.5%、食鹽1%、碳酸氫鈣2.5%、添加劑2%；2、除代謝能為計(jì)算值外其余指標(biāo)為實(shí)測(cè)值

Note: 1. Feed ingredients corn 51%, wheat bran 24%, soybean meal 18%, urea 1.5%, salt 1%, calcium hydrogen carbonate 2.5%, additive 2%. In addition to the metabolic energy for the calculation of the remaining indicators for the measured value

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

正飼期的第16 d(試驗(yàn)前期)和第32 d(試驗(yàn)后期)，分別在肉牛的直腸取糞樣5 g左右，置于滅菌的螺口管中，每頭肉牛的糞樣采取3份，迅速放入液氮保存，用于細(xì)菌DNA的提取和平板計(jì)數(shù)使用。

1.2.2 細(xì)菌平板培養(yǎng)

采用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)[19]，其中總細(xì)菌采用NA培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃；大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃；金黃色葡萄球菌采用BP培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃；乳酸菌采用MER培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃。在恒溫箱培養(yǎng)2～3 d的時(shí)間，即可進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。其中梯度稀釋總細(xì)菌和大腸桿菌選擇10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋梯度；其中梯度稀釋金黃色葡萄球菌和乳酸菌選擇10-5、10-6、10-7和10-8四個(gè)稀釋梯度。計(jì)數(shù)結(jié)果10為底數(shù)的對(duì)數(shù)表示。

1.2.3 樣品總細(xì)菌DNA提取

從滅菌的螺口管中稱取0.5 mL的糞便樣本至2 mL離心管中，并置于冰上。糞樣中細(xì)菌總DNA的提取方法按照提取試劑盒(TIANamp Stool DNA Kit)說(shuō)明進(jìn)行提取。

1.2.4 細(xì)菌16Sr DNA 基因V6-V8區(qū)PCR擴(kuò)增

選用細(xì)菌通用引物對(duì)細(xì)菌的16Sr DNA V6-V8區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL：2 μL模板DNA，2 μL上游引物(U968-GC)，2 μL下游引物(L1401)，PCR Mix預(yù)混液 25 μL，dd H2O 19 μL。引物序列為，U968-GC：5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3’；L1401：5’-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3’。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min，(95℃變性45 s，56℃褪火45 s，72℃延伸45 s)33個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后于-20℃保存。

1.2.5 變性梯度凝膠電泳

DGGE采用Dcode突變檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)及雙梯度法進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=37.5∶1質(zhì)量比)，變性梯度為40%～60%，其中40%濃度的膠(低濃度)為100%儲(chǔ)存液4.4 mL+0%儲(chǔ)存液6.6 mL，60%濃度的膠(高濃度)為100%儲(chǔ)存液6.6 mL+0%儲(chǔ)存液4.4 mL，最后將兩種濃度的膠加入專用注射器緩緩注入電泳玻璃板中間，然后快速注入濃縮膠(0%儲(chǔ)存液6 mL+20%過(guò)硫酸銨60 μL+四甲基乙二胺6 μL)，插入梳子，待膠半干時(shí)緩緩拔下梳子，點(diǎn)入PCR產(chǎn)物，放置與電泳槽中(50×TAE緩沖液，預(yù)熱至60℃)200 V電壓預(yù)10 min，然后85 V電壓跑14 h。最后用溴化乙錠(EB)進(jìn)行染色30 min、dd H2O脫色3次，脫色完畢后采用凝膠成像儀進(jìn)行成像拍照保存，用于后期分析。

1.2.6 回收條帶及測(cè)序

在紫外燈下用無(wú)菌刀片從膠上切下有差異和無(wú)差異的條帶，將切下的條帶放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的滅菌的1.5 mL離心管中，用去離子水漂洗兩次后加入20 μL TE溶液，4 ℃過(guò)夜。將回收的DNA用不帶GC夾子的U968/L1401擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后成像，切下明亮條帶進(jìn)行回收、純化(采用PCR回收純化試劑盒)。連接T載體(采用T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒)后送至北京六合華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的16S rDNA序列經(jīng)過(guò)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進(jìn)行整理，利用SPSS17.0軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵棉粕飼料對(duì)肉牛牛糞中細(xì)菌數(shù)量的影響

試驗(yàn)前期，C組和T組總細(xì)菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組大腸桿菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組金黃色葡萄球菌差異不顯著(P>0.05)；C組和T組乳酸菌差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)后期，C組和T組總細(xì)菌差異不顯著(P>0.05)；C和T組大腸桿菌差異顯著(P<0.05)；C和T組金黃色葡萄球菌差異顯著(P<0.05)；C組和T組乳酸菌差異顯著(P<0.05)。總細(xì)菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數(shù)量的變化體現(xiàn)了牛糞中微生物菌群數(shù)量上的多樣性。

表3 不同時(shí)期發(fā)酵棉粕飼料下肉牛牛糞中細(xì)菌數(shù)量變化

注：表中T為試驗(yàn)組和C為對(duì)照組

Note: T in the table is the treatment group and C as the control group

2.2 細(xì)菌16S rDNA 基因V6-V8區(qū)PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)提取的總DNA，經(jīng)過(guò)1%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，基因組DNA長(zhǎng)度在23 kp左右。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，各泳道均得到清晰明亮、長(zhǎng)度在500 bp且無(wú)非特異性擴(kuò)增的條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶，符合目的基因片段，可用于后續(xù)的DGGE電泳。圖1(a)

2.3 DGGE多樣性

2.3.1 變性梯度凝膠電泳結(jié)果

通過(guò)DDGE技術(shù)從各個(gè)時(shí)期的樣品中分離出來(lái)了不同數(shù)目的條帶。4個(gè)泳道中不同條帶數(shù)目，可以直接說(shuō)明糞樣中微生物菌群的多樣性。DGGE圖譜中每一個(gè)泳道代表一個(gè)樣品，泳道中的每一個(gè)條帶都有其自身的遷移速度和對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)。不同的遷移速度代表不同的細(xì)菌種類，條帶的亮度代表著細(xì)菌種類的數(shù)量，亮度越高說(shuō)明此種細(xì)菌的數(shù)量眾多，可以鑒別出此樣品中微生物菌群的優(yōu)勢(shì)菌。除了存在不同的條帶還存在相同的條帶，表明其屬于同一種細(xì)菌，其明暗程度也表明了細(xì)菌的數(shù)量差異。圖1(b)

2.3.2 DGGE指紋圖譜

通過(guò)Quantity One軟件對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析。不同泳道的聚類分析顯示，不同泳道可分為3類，其中CB為一類，CA分為一類，TB和TA分為一類。不同泳道的相似性分析如圖1(d)所示。其中相似性最小(56.4)的為CB和CA。相似性最大(72.0)的TB和TA。CB和TB的相似性為58.7。TB和CA的相似性為62.3。CB和TA的相似性為59.8。CA和TA的相似性為60.5。圖1(c)

注：圖中CB(Control Before)為對(duì)照組前期；TB(Treatment Before)為試驗(yàn)組前期；CA(Control After)為對(duì)照組后期；TA(Treatment After)為試驗(yàn)組后期

Note: the figure in CB (Control Before) as the control group in early; TB (Treatment Before) as the experimental group early; CA (Control After) as the control group later; TA (Treatment After) as the experimental group later

圖1 16S rDNA 基因V6-V8區(qū)PCR擴(kuò)增、DGGE指紋圖譜、聚類分析及相似性矩陣

Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA gene in V6-V8 region, DGGE fingerprinting, cluster analysis and similarity matrix

2.3.3 回收條帶測(cè)序及序列

DGGE圖譜主要條帶的測(cè)序結(jié)果表明，從不同組別和時(shí)期的細(xì)菌DGGE圖譜上共標(biāo)記了11條特異性條帶，將檢測(cè)出的每一個(gè)條帶序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，得到同源性最高的菌株，分別是：1為Salmonellaentericasp.，2為Ruminococcussp.，3為L(zhǎng)actobacillussp.，4為L(zhǎng)actobacillussp.，5為L(zhǎng)achnospiraceaesp.，6為Shigellasp.，7為Clostirdiumsp.，8為Escherichiacolisp.，9為Escherichiacolisp.，10為Enterobactersp.，11為Enterococcussp.，且同源性均超過(guò)了96%。

試驗(yàn)DGGE圖譜主要條帶切膠測(cè)序，糞中細(xì)菌種類較為豐富。CB中條帶最亮的為4、9、11，表明乳酸菌、大腸桿菌、腸球菌可能是其優(yōu)勢(shì)菌群；TB中條帶最亮的為4、5、8、9，表明乳酸菌、大腸桿菌可能是其優(yōu)勢(shì)菌群；CA中條帶最亮的為3、8、9，表明乳酸菌、大腸桿菌可能是其優(yōu)勢(shì)菌群；TA中條帶最亮的為3、8、9，表明乳酸菌、大腸桿菌可能是其優(yōu)勢(shì)菌群。CB、TB、CA、TA四組中有兩個(gè)相同菌屬，包括2個(gè)乳酸菌和2個(gè)大腸桿菌。表4

表4 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列比對(duì)

3 討 論

3.1 牛糞中細(xì)菌數(shù)量差異性的影響

牛糞中菌群的數(shù)量采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法。此方法雖然利用不同類型的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)適時(shí)的培養(yǎng)即可得到相應(yīng)的菌落數(shù)量，實(shí)行起來(lái)簡(jiǎn)單，但是在后期進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)的時(shí)候，由于肉眼無(wú)法清除的識(shí)別每個(gè)菌落的數(shù)量，可能造成菌落計(jì)數(shù)結(jié)果偏低[20-22]。

試驗(yàn)前期和試驗(yàn)后期上，金黃色葡萄球菌含量均成降低的趨勢(shì)，金黃色葡萄球菌在健康動(dòng)物的機(jī)體內(nèi)正常繁殖具有其一定的作用，但如果失去平衡的話，將會(huì)引起動(dòng)物機(jī)體的紊亂嚴(yán)重的話會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生病，例如金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生腸毒素，腸毒素是一種耐熱的外毒素，也不受胰蛋白酶的影響，可引起急性胃腸炎。但是乳酸菌的含量在試驗(yàn)前期和試驗(yàn)后期是成上升趨勢(shì)的，乳酸菌在動(dòng)物體內(nèi)能發(fā)揮許多的生理功能。大量研究資料表明，乳酸菌能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，從而改善胃腸道功能；提高食物消化率和生物效價(jià)；降低血清膽固醇，控制內(nèi)毒素；抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)；提高機(jī)體免疫力等[23]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在安格斯肉牛上飼喂發(fā)酵棉粕，在一定程度上改變了其腸道微生物細(xì)菌數(shù)量的變化，可能減少某些致病細(xì)菌的數(shù)量，增加有益菌的數(shù)量。

反芻動(dòng)物的腸道中寄居著大量的微生物，微生物菌群的數(shù)量及整個(gè)微生物區(qū)系的組成受多種生理因素、飼料組成和環(huán)境因素等影響[24]。糞樣中的微生物與結(jié)腸中的微生物有99%的相似性，因此想了解反芻動(dòng)物腸道微生物的數(shù)量及多樣性可以通過(guò)糞中的微生物反推腸道微生物的數(shù)量及多樣性。飼喂同種飼料且相同品種的牛，其糞中微生物區(qū)系不完全相同，由于動(dòng)物自身生理上存在個(gè)體差異，故在試驗(yàn)結(jié)果中，不能排除個(gè)體差異對(duì)不同細(xì)菌數(shù)量造成的影響。

3.2 牛糞中細(xì)菌多樣性的影響

不同提取DNA的方法會(huì)直接影響細(xì)菌多樣性的結(jié)果，因此提取純度高，雜帶少的DNA是進(jìn)行變性凝膠電泳成功的首要條件。試驗(yàn)采用TIANamp Stool DNA Kit，該試劑盒操作方法簡(jiǎn)單、提取所需時(shí)間短且去除抑制物、雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物的效果很好，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物糞便DNA的提取。此方法可獲得純度高，質(zhì)量穩(wěn)定的DNA片段，可滿足后續(xù)變性凝膠電泳的試驗(yàn)。

微生物相似性及多樣性在DGGE指紋圖譜中體現(xiàn)為條帶的有無(wú)及條帶亮度的變化。由于DGGE技術(shù)只能分辨數(shù)量占超過(guò)總細(xì)菌1 %的細(xì)菌種類[25]，所以指紋圖譜中的條帶一定程度上應(yīng)理解為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，某一條帶的缺失并不一定是其不存在，而可能是數(shù)量上處于劣勢(shì)，在圖譜中不能得以體現(xiàn)。PCR-DGGE是一種快速可靠的比較細(xì)菌群落的方法，DGGE條帶再經(jīng)切膠和測(cè)序，有助于人們了解微生物多樣性。試驗(yàn)結(jié)果中沒(méi)有測(cè)序得出嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母菌等菌的序列，其原因可能是由于在切膠回收條帶的環(huán)節(jié)人為誤差造成的，故在試驗(yàn)結(jié)果中，不能排除個(gè)人操作技術(shù)的影響。

對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析，不同泳道的聚類分析劃分為3類，其中CB、CA各為一類，TB和TA歸為一類。說(shuō)明飼喂未發(fā)酵棉粕的消化道菌群中細(xì)菌的數(shù)量以及分布上存在較大差別。結(jié)合微生物技術(shù)的結(jié)果來(lái)看，試驗(yàn)前期和試驗(yàn)后期上C組總細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量都有減少的趨勢(shì)，大腸桿菌數(shù)量有增加的趨勢(shì)，金黃色葡萄球菌數(shù)量變化不大；試驗(yàn)前期和試驗(yàn)后期上T組總細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量變化不明顯，大腸桿菌數(shù)量有增加的趨勢(shì)，金黃色葡萄球菌數(shù)量有減少的趨勢(shì)。CB、CA各為一類，很可能是因?yàn)镃組總細(xì)菌數(shù)量和其中各種菌的數(shù)量在試驗(yàn)前期和后期有不同變化的原因造成的。

微生物菌群非常依賴日糧分解產(chǎn)物作為最終代謝底物，不同種類細(xì)菌所需底物和生長(zhǎng)條件不同[26]。聶存喜等[27]研究用不同微生物發(fā)酵的多種小分子代謝產(chǎn)物含量會(huì)因菌種而異。棉粕使用嗜酸乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌以及熱帶假絲酵母菌三種復(fù)合菌種發(fā)酵，可能改變其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的含量，而且不同細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也不同，因此改變了腸道細(xì)菌多樣性，具體的影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

4.1 飼喂發(fā)酵棉粕，牛糞中細(xì)菌的數(shù)量有所改變。試驗(yàn)前期，添加發(fā)酵棉粕顯著降低總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸菌數(shù)量。試驗(yàn)后期，添加發(fā)酵棉粕顯著降低大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數(shù)量，顯著提高乳酸菌數(shù)量。

4.2 飼喂發(fā)酵棉粕，通過(guò)測(cè)序檢測(cè)到牛糞含有大量的微生物，測(cè)序得到11種細(xì)菌，分別所屬瘤胃球菌、乳酸菌、大腸桿菌、梭菌等8個(gè)菌屬。

4.3 飼喂未發(fā)酵棉粕組初期與末期(CB與CA)前后DGGE指紋圖譜聚類分析劃分為2類，而飼喂發(fā)酵棉粕初期與末期(TB與TA)前后DGGE指紋圖譜聚類分析劃分為1類。

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Study of Bacterial Number and Diversity in Manure of Beef Cattle Fed by Fermented Cottonseed Meal

LIANG Min1, ZHANG Wen-ju1, ZHANG Fan-fan1, CHEN Ning1, YIN Jun-liang2

(1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China; 2. Research Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences, Shihezi Xinjiang 832000, China)

【Objective】 To study the effect of feeding fermented cottonseed meal on the number of bacteria and diversity in Angus beef cattle manure.【Method】The number of bacteria was calculated by plate counting method, V6-V8 DNA gene amplification of bacterial 16S rDNA was performed by PCR technique. The PCR products were subjected to denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The specific bands of fingerprint were obtained and sequenced, and bacterial strains were identified by BLAST.【Result】(1) In early experiment, there were significant differences in total bacteria,EscherichiacoliandLactobacillusbetween group C and group T (P< 0.05), but no significant difference inStaphylococcusaureusbetween them (P> 0.05). In late experiment, there was no significant difference in total bacteria between group C and group T (P> 0.05), butEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandLactobacilluswere significantly different (P< 0.05). (2) Bacteria found in cow dung were:Salmonella,Ruminococcus,Lactobacillus,Lachnospiraceae,Shigella,Clostridium,Escherichiacoli,EnterobacterandEnterococcus, and among them,LactobacillusandEscherichiacolimight be the dominant bacteria in cow manure. 【Conclusion】Total bacteria,EscherichiacoliandStaphylococcusaureushave obvious change in the number of early and late experiment period. There are many kinds of bacteria in cow dung, which reflect the diversity of microbial flora in cow manure.

fermented cottonseed meal; bacteria; number; DGGE; diversity

ZHANG Wen-ju (1966- ), male, native place: Shanxi. Professor, research field: The development and utilization of feed resources. (E-mail) zhangwj1022@sina.com

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2017-04-12

新疆兵團(tuán)重大科技項(xiàng)目(2014AA001)

梁敏(1992- )，女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向?yàn)轱暳腺Y源的開發(fā)與利用，(E-mail)10214969502@qq.com

張文舉(1966- )，男，陜西臨潼人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)轱暳腺Y源的開發(fā)與利用，(E-mail)zhangwj1022@sina.com

S816

A

1001-4330(2017)07-1323-09

Supported by: Major Science and Technology R&D Program of XPCC (2014AA001)