李 鋒，李義嘉，李清仙，郭養(yǎng)浩，石賢愛(ài),*

（1.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350116；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350116）

枇杷葉科羅索酸抑制人低密度脂蛋白氧化修飾及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷作用

李 鋒1,2，李義嘉2，李清仙2，郭養(yǎng)浩2，石賢愛(ài)2,*

（1.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建 福州 350116；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350116）

從枇杷葉中提取分離制備科羅索酸，采用體外Cu2+誘導(dǎo)低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）氧化損傷的體外化學(xué)反應(yīng)模型及2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride，AAPH）誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAECs）氧化損傷的細(xì)胞模型，考察枇杷葉科羅索酸對(duì)LDL氧化過(guò)程的抑制作用及對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枇杷葉科羅索酸在體外10～100 μmol/L劑量范圍內(nèi)能有效延長(zhǎng)LDL氧化過(guò)程中的遲滯期，降低反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的曲線下面積以及降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成，表明科羅索酸在體外能有效抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在2～10 μmol/L劑量范圍內(nèi)能有效降低AAPH所致HAECs的乳酸鹽脫氫酶漏出量，維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性；提高受損細(xì)胞的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，從而提升內(nèi)皮細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力；降低細(xì)胞處于sub-G1/G0狀態(tài)的比例，減少AAPH所致細(xì)胞的壞死或凋亡。表明枇杷葉科羅索酸能在細(xì)胞水平有效保護(hù)HAECs免受AAPH氧化應(yīng)激損傷。

枇杷葉；科羅索酸；低密度脂蛋白；血管內(nèi)皮細(xì)胞；脂質(zhì)過(guò)氧化

枇杷葉（Folium Eriobotryae）作為一種傳統(tǒng)藥材，在我國(guó)民間使用歷史悠久，收載于典籍[1-2]。目前枇杷葉作為一種常見(jiàn)中藥，在臨床仍然廣泛使用，主要用于止咳平喘。研究表明枇杷葉中含有揮發(fā)油、三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、倍半萜類(lèi)、氨基酸、糖類(lèi)、酚苷類(lèi)及其他有機(jī)酸類(lèi)等化學(xué)成分[3-4]，其中三萜酸含量最高，是其最主要的生物活性貢獻(xiàn)成分[5]。枇杷中最為典型的幾種三萜酸為熊果酸（ursolic acid）、齊墩果酸（oleanic acid）、科羅索酸（corosolic acid）、山楂酸（maslinic acid）、薔薇酸（euscaphic acid）和委陵菜酸（tormentic acid）等[5-8]，其中熊果酸和科羅索酸的含量較高，其他幾種含量較少?？屏_索酸作為熊果酸衍生物，又名2α-羥基熊果酸，屬于熊果烷型五環(huán)三萜酸（圖1）。近年來(lái)，科羅索酸的生物活性得到了深入的研究，研究表明具有抗氧化[9-11]、抗腫瘤[12-14]、降血糖[15-18]、抑制肥胖[19-21]以及抗炎[10,19,22]等藥理活性，引起了人們的廣泛的重視。

圖1 科羅索酸結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structure of corosolic acid

低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）是主要的血膽固醇運(yùn)載工具，主要負(fù)責(zé)從肝向外周輸送膽固醇。LDL在體內(nèi)易經(jīng)活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基氧化損傷作用而轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷兔芏戎鞍祝╫xidative low density lipoprotein，ox-LDL），而ox-LDL是致動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）危險(xiǎn)因素，故LDL的氧化損傷在AS的形成和發(fā)展中扮演著重要角色[23-24]。目前對(duì)科羅索酸抑制LDL氧化及AS形成的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)擬采用體外Cu2+誘導(dǎo)人源LDL氧化損傷模型及2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH）誘導(dǎo)人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAECs）氧化損傷細(xì)胞模型，考察枇杷葉科羅索酸對(duì)LDL氧化過(guò)程的抑制作用及對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷葉藥材 福州市中藥飲片廠。

HAECs細(xì)胞株 鼎國(guó)生物技術(shù)公司；人LDL 上海經(jīng)科化學(xué)科技公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑（血清、培養(yǎng)基、抗生素及胰酶等） 美國(guó)HyClone公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorod ihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 阿拉丁試劑有限公司；四乙氧基丙烷（1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP）、硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT） 上海源葉生物科技公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

COULTER EPICS XL型流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡重慶光電儀器公司；50i型熒光顯微鏡 日本Nikon公司；SpectraMax i3x型熒光酶標(biāo)儀、U410型超低溫冰箱 美國(guó)NBS公司；Z 323K型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷葉科羅索酸的制備

枇杷葉烘干粉碎，按料液比1∶10（m/V）用90%乙醇于45 ℃提取3 次，每次2 h。過(guò)濾合并提取液，堿性條件下用活性碳吸附過(guò)濾去除葉綠素等非極性色素。脫色液減壓濃縮至浸膏，浸膏用少量乙酸乙酯溶解，上硅膠柱，采用乙酸乙酯/甲醇洗脫體系，收集富含科羅索酸組分。此組分再經(jīng)C18半制備高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)一步分離純化，得到較純的枇杷葉科羅索酸樣品，經(jīng)HPLC測(cè)定純度。

1.3.2 LDL的制備

為了避免商品LDL中的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成干擾，需通過(guò)透析法去除。采用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、pH 7.4）4 ℃透析24 h，每隔6 h更換一次透析液。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度，過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化

LDL氧化反應(yīng)體系為：LDL終質(zhì)量濃度100 μg pro/mL，CuSO4終濃度10 μmol/L，混合均勻，于37 ℃避光反應(yīng)，結(jié)束時(shí)加入等體積含1 mmol/L EDTA和1 mmol/L BHT的混合液終止氧化反應(yīng)[25]。本實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系中加入不同濃度（10、20、50、100 μmol/L）的枇杷葉科羅索酸考察對(duì)LDL氧化過(guò)程的抑制效果；體系中不加CuSO4和科羅索酸作為空白對(duì)照組，只加CuSO4作為模型誘導(dǎo)組。反應(yīng)進(jìn)行中實(shí)時(shí)測(cè)定共軛二烯鍵的形成情況。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定共軛二烯鍵的生產(chǎn)，取樣采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法分析LDL氧化物水平。

1.3.4 共軛二烯鍵的測(cè)定

共軛二烯鍵是LDL氧化的早期產(chǎn)物，采用Xu等[26]方法稍作改動(dòng)。1 mL LDL溶液（100 μg/mL）與不同濃度枇杷葉科羅索酸樣品混合，對(duì)照組同樣條件但不加科羅索酸。體系中加入CuSO4使終濃度為10 μmol/L的啟動(dòng)氧化反應(yīng)，分光光度計(jì)每10 min測(cè)定234 nm波長(zhǎng)處吸光度（A），持續(xù)4 h，記錄共軛二烯鍵的生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)曲線，并計(jì)算0～4 h的曲線下面積（area under the curve，AUC0～4h）。

1.3.5 TBARS分析

采用分析TBARS方法測(cè)定LDL氧化物[27]。1 mL的LDL溶液（100 mg/mL）與終濃度為10 μmol/L的CuSO4混合均勻，在加入或不加入（對(duì)照組）20 μL的不同濃度（10、20、50、100 μmol/L）枇杷葉科羅索酸樣品的情況下進(jìn)行氧化，37 ℃避光反應(yīng)4 h。反應(yīng)體系加入EDTA（終濃度1 mmol/L）終止氧化，分別加入1 mL 20%乙酸和1 mL 0.67% TBA溶液，混合均勻，加熱至95 ℃反應(yīng)30 min，冷卻至室溫。1 500 r/min離心10 min去除沉淀，取上清液測(cè)定532 nm波長(zhǎng)處吸光度。10 μmol/L四乙氧基丙烷（1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP）作為標(biāo)準(zhǔn)品，與測(cè)定樣品同樣處理。按式（1）計(jì)算各組的TBARS值。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HAECs用DMEM培養(yǎng)基（含15% FBS、20 U/mL bFGF、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素），置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，每孔100 μL接種于12 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后轉(zhuǎn)換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。隨機(jī)將培養(yǎng)孔分成3 組：空白對(duì)照組：不加任何藥物；模型刺激組：用含2 mmol/L AAPH無(wú)血清培養(yǎng)基氧化刺激；藥物組：分別用含1、2、5、10 μmol/L科羅索酸和2 mmol/L AAPH無(wú)血清培養(yǎng)基處理。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，用0.25%胰酶消耗制備細(xì)胞懸液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 MTT法分析細(xì)胞存活率

培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，加入含5 mg/mL MTT的無(wú)血清無(wú)酚紅培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取MTT溶液，加入DMSO溶解所形成的甲簪晶體，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。按式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.8 細(xì)胞ROS水平、LDH漏出量及SOD、GPx活性的測(cè)定

細(xì)胞ROS含量測(cè)定：采用黑壁底透96 孔板培養(yǎng)細(xì)胞，藥物處理方法同1.3.6節(jié)。棄上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）清洗，每孔加入100 μL 10 μmol/L的DCFH-DA熒光染液，37 ℃避光染色30 min。PBS清洗2次，用SpectraMax i3x型熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，其激發(fā)光波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為520 nm；以最高組熒光強(qiáng)度為100%，計(jì)算其他各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。LDH漏出量測(cè)定：取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定LDH活性，表示為U/mL。SOD、GPx活性測(cè)定：收集6 孔培養(yǎng)板中細(xì)胞，冰浴超聲波破碎，收集蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，樣品采用SOD和GPx試劑盒測(cè)定酶活力。

1.3.9 PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，接種密度為每孔5×105個(gè)細(xì)胞，組別設(shè)置及藥物處理同1.3.6節(jié)，培養(yǎng)24 h。吸除培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌1 次，3 000 r/min離心2 min，棄上清液。按照PI單染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作制備染色懸浮細(xì)胞，用于FCM分析。200 目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，檢查收集104個(gè)細(xì)胞。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表明差異有顯著性，P＜0.01表明差異極顯著。結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷葉科羅索酸的制備

枇杷葉含有多種五環(huán)三萜酸，其中科羅索酸的含量?jī)H次于熊果酸，可達(dá)原料干質(zhì)量的0.8%，但由于和山楂酸互為同分異構(gòu)體，往往采用常規(guī)分離手段很難制備高純度樣品。本實(shí)驗(yàn)采用常壓柱層析結(jié)合半制備HPLC方法，得到了較高純度的枇杷葉科羅索酸樣品，經(jīng)HPLC分析其純度為93.4%（圖2）。

圖2 枇杷葉科羅索酸HPLC圖譜Fig. 2 HPLC prof i le of corosolic acid from Folium Eriobotryae

2.2 枇杷葉科羅索酸對(duì)Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化的體外抑制作用

圖3 枇杷葉科羅索酸對(duì)Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effect of corosolic acid on LDL oxidation induced by Cu2+ in vitro

共軛二烯鍵的形成是反映LDL早期氧化階段的標(biāo)志，而TBARS法分析的是晚期氧化階段的產(chǎn)物，因此本研究分別測(cè)定了這兩項(xiàng)指標(biāo)。如圖3A所示，Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化的動(dòng)力學(xué)曲線可明顯分為三階段：延滯期、快速反應(yīng)期和減速期。Cu2+氧化LDL模型誘導(dǎo)組的延滯期平均為89.3 min，經(jīng)枇杷葉科羅索酸處理可顯著延長(zhǎng)延滯期時(shí)間，呈劑量依賴性（表1），10 μmol/L處理延長(zhǎng)到117.5 min（P＜0.05），而100 μmol/L水平時(shí)遲滯期進(jìn)一步延長(zhǎng)（P＜0.01）；同時(shí)科羅索酸也能有效降低Cu2+氧化LDL動(dòng)力學(xué)曲線的AUC（表1），50 μmol/L和100 μmol/L水平時(shí)，從誘導(dǎo)模型組的81.0分別降低到42.38和33.89（P＜0.01），而在10 μmol/L和20 μmol/L水平時(shí)，AUC降低也具有顯著性（P＜0.05）。圖3B表明，科羅索酸能顯著降低Cu2+氧化LDL過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化物的水平，呈劑量依賴性。經(jīng)過(guò)Cu2+氧化誘導(dǎo)后，LDL反應(yīng)體系中TBARS值顯著增加到約10.3 μmol/L水平，而20 μmol/L科羅索酸能將TBARS值降低到約6.5 μmol/L（P＜0.05），100 μmol/L能更進(jìn)一步降低到3.1 μmol/L水平（P＜0.01）。

表1 Cu2+誘導(dǎo)氧化LDL動(dòng)力學(xué)曲線延滯期時(shí)間及AUC0-4h比較Table 1 Lag time and AUC0?4hof kinetic curve of LDL oxidation induced by Cu2+

2.3 枇杷葉科羅索酸對(duì)細(xì)胞活性的影響及對(duì)AAPH氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

圖4 枇杷葉科羅索酸對(duì)正常HAECs的影響（A）及對(duì)AAPH所致?lián)p傷細(xì)胞的保護(hù)作用（B）Fig. 4 Corosolic acid effects on normal HAECs (A) and its protective effects on AAPH-induced cell damage (B)

已有研究表明科羅索酸具有一定的抗腫瘤作用，有明顯的細(xì)胞毒性作用，本研究在藥物本身不對(duì)HAECs產(chǎn)生損傷的前提條件下，考察其對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，故需要先確定藥物的安全劑量。圖4A表明，隨著劑量的增加，科羅索酸會(huì)顯著抑制HAECs的活性。在50 μmol/L及以上濃度時(shí)，相對(duì)細(xì)胞存活率低于40%，抑制作用明顯；而在10 μmol/L及以下濃度時(shí)，相對(duì)細(xì)胞存活率接近100%，無(wú)明顯的抑制。故本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的科羅索酸的細(xì)胞安全劑量上限為10 μmol/L，確定了1、2、5、10 μmol/L 4 個(gè)濃度梯度，在此劑量下考察藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。圖4B表明，與模型刺激組相比，科羅索酸在1 μmol/L劑量下對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著提高，而在2、5和10 μmol/L劑量下能顯著提高細(xì)胞的活性（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明枇杷葉科羅索酸在一定的劑量范圍能有效保護(hù)HAECs內(nèi)皮細(xì)胞免受AAPH的氧化損傷作用。

2.4 枇杷葉科羅索酸對(duì)AAPH氧化細(xì)胞的LDH漏出量、ROS水平及SOD、GPx活性影響

表2 枇杷葉科羅索酸對(duì)細(xì)胞LDH漏出量、ROS、SOD和GPx水平的影響Table 2 Effects of CA on LDH, ROS, SOD and GPx level in cells suffering from AAPH-induced damage

通過(guò)分析培養(yǎng)基中LDH活性來(lái)測(cè)定細(xì)胞LDH的漏出量，從而間接反映出細(xì)胞膜所受氧化損傷程度，結(jié)果如表2所示。與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，模型刺激組的LDH活性顯著增加，漏出量劇增到85.37 U/L，說(shuō)明細(xì)胞膜受損傷嚴(yán)重，而枇杷葉科羅索酸能有效保護(hù)細(xì)胞膜而降低細(xì)胞LDH的漏出量，呈劑量依賴性。細(xì)胞ROS水平反映了細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度，科羅索酸也能顯著抑制AAPH所致細(xì)胞的ROS水平的增加，在2 μmol/L劑量時(shí)ROS水平降至87.6%，隨著劑量增加，能進(jìn)一步降低至62.3%，表明科羅索酸能有效減輕損傷細(xì)胞的胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。SOD和GPx是機(jī)體重要的抗氧化酶，反映了細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)果表明枇杷葉科羅索酸同樣能提高AAPH所致?lián)p傷細(xì)胞的SOD、GPx活性，提升細(xì)胞的抵抗氧化應(yīng)激能力。

2.5 枇杷葉科羅索酸對(duì)AAPH所致?lián)p傷細(xì)胞周期分布的影響

表3 枇杷葉科羅索酸對(duì)AAPH所致?lián)p傷細(xì)胞周期的影響（n=3）Table 3 Effect of corosolic acid on cell cycle (n=3)

PI為著色于核酸的熒光染料，無(wú)法通過(guò)完整的細(xì)胞膜，可以用來(lái)反映細(xì)胞的受損傷的程度。當(dāng)細(xì)胞壞死或者處于凋亡晚期時(shí)，膜通透性變大，PI染料就可以進(jìn)入膜內(nèi)與DNA結(jié)合將核染成紅色。細(xì)胞各個(gè)時(shí)期DNA含量不同結(jié)合熒光染料的量也不同，對(duì)于正常細(xì)胞，具有完整細(xì)胞膜會(huì)阻擋PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞核不著色。

從表3可以看出，AAPH氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞，sub-G0/G1所占比例平均為85.4%，遠(yuǎn)高于空白對(duì)照細(xì)胞的平均值0.9%（P＜0.01），說(shuō)明細(xì)胞受損嚴(yán)重，幾乎都處于凋亡或壞死狀態(tài)；而經(jīng)過(guò)枇杷葉科羅索酸的處理，能明顯降低sub-G0/G1細(xì)胞的比例，1 μmol/L的科羅索酸平均可降低至67.2%，而10 μmol/L時(shí)能平均降低至16.8%，說(shuō)明科羅索酸抑制AAPH所致細(xì)胞損傷作用明顯，有效地保護(hù)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

3 討 論

機(jī)體ROS所致的LDL氧化損傷過(guò)程是致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素之一[28]，其產(chǎn)物ox-LDL能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌黏附分子，易于形成泡沫細(xì)胞[29]。LDL在體外易受過(guò)渡態(tài)金屬離子的誘導(dǎo)作用而被氧化，故本實(shí)驗(yàn)采用體外Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化來(lái)模擬體內(nèi)的氧化過(guò)程。AAPH是常見(jiàn)的水溶性自由基誘導(dǎo)劑，能在生理?xiàng)l件下分解產(chǎn)生的自由基，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，且產(chǎn)生自由基的速度可控，因而被認(rèn)為是研究體內(nèi)抗氧化的理想模型[30]。故本實(shí)驗(yàn)采用體外Cu2+誘導(dǎo)人源LDL氧化損傷模型及AAPH誘導(dǎo)人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HAECs氧化損傷細(xì)胞模型，考察枇杷葉科羅索酸對(duì)LDL氧化過(guò)程的抑制作用及對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用?？屏_索酸作為一種熊果烷型三萜酸，具有抗氧化及清除自由基的作用[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，枇杷葉科羅索酸在體外較低的劑量條件下（10～100 μmol/L）即能有效延長(zhǎng)LDL氧化過(guò)程中的遲滯期時(shí)間，降低反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的AUC以及TBARS值，表明枇杷葉科羅索酸在體外能有效抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化。

細(xì)胞正常條件下處于一種氧化/抗氧化平衡狀態(tài)，當(dāng)受外界氧化因子過(guò)度刺激時(shí)，會(huì)打破這種均衡狀態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重受損。SOD、GPx是機(jī)體重要的抗氧化酶，對(duì)維持細(xì)胞氧化還原平衡具有重要作用。LDH是較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于絕大多數(shù)正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，不能分泌到胞外，而一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外；通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性（即LDH的漏出量），可判斷細(xì)胞受損的程度[32]。本研究結(jié)果表明，在一定的劑量范圍內(nèi)（2～10 μmol/L），枇杷葉科羅索酸能有效降低AAPH所致HAECs細(xì)胞的LDH漏出量，維護(hù)細(xì)胞膜的完整性；增加受損細(xì)胞的SOD、GPx活性，從而提升內(nèi)皮細(xì)胞的抵抗氧化應(yīng)激的能力；降低處于sub-G0/G1狀態(tài)的比例，減少AAPH所致細(xì)胞的壞死或凋亡。

綜上所述，枇杷葉科羅索酸在體外能有效抑制Cu2+誘導(dǎo)的人LDL氧化；保護(hù)HAECs免受AAPH所致的自由基氧化損傷，維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。其機(jī)制有可能是通過(guò)增加細(xì)胞中諸如SOD、GPx等抗氧化酶而實(shí)現(xiàn)，具體的分子機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。本研究表明，枇杷葉科羅索酸有望應(yīng)用于抗動(dòng)脈粥樣硬化領(lǐng)域，為枇杷葉的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

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Corosolic Acid from Folium Eriobotryae Inhibits LDL Oxidation and Protects HAECs against Oxidative Damage

LI Feng1,2, LI Yijia2, LI Qingxian2, GUO Yanghao2, SHI Xian’ai2,*
(1. College of Chemistry, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China; 2. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China)

In the present study, corosolic acid (CA) was extracted and separated from Folium Eriobotryae. A Cu2+-induced low density lipoprotein (LDL) oxidation model was employed to evaluate the inhibitory effect of CA on LDL oxidation in vitro, and a human aortic endothelial cell (HAEC) model of oxidative damage induced by (2,2’-azobis-2-methylpropanimidamide dihydrochloride, AAPH) was employed to evaluate the protective effect of CA on oxidative damage. In the dose range of 10-100 μmol/L, CA effectively extended the lag time of the Cu2+-induced LDL oxidation process, reduced the area under the oxidation kinetic curve (AUC) and inhibited the generation of lipid peroxide indicating that CA could effectively inhibit LDL oxidation induced by Cu2+. In the cellular experiment at the dose range of 2-10 μmol/L, CA effectively reduced LDH leakage induced by AAPH, maintained the integrity of cell structure, enhanced the activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) and therefore oxidative stress resistance, reduced the proportion of sub-G1/G0 cells and necrosis or apoptosis induced by AAPH. These results demonstrated that CA could elevate cellular antioxidant capacity, maintain the integrity of cellular structure, and ultimately protect HAECs against oxidative stress damage induced by AAPH.

Folium Eriobotryae; corosolic acid; low density lipoprotein(LDL); vascular endothelial cells; lipid peroxidation

10.7506/spkx1002-6630-201715035

TS201.4

A

1002-6630（2017）15-0215-06

李鋒, 李義嘉, 李清仙, 等. 枇杷葉科羅索酸抑制人低密度脂蛋白氧化修飾及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 215-220. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715035. http://www.spkx.net.cn

LI Feng, LI Yijia, LI Qingxian, et al. Corosolic acid from Folium Eriobotryae inhibits LDL oxidation and protects HAECs against oxidative damage[J]. Food Science, 2017, 38(15): 215-220. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201715035. http://www.spkx.net.cn

2016-06-14

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201205022）

李鋒（1976—），男，助理研究員，碩士，主要從事天然成分生物活性研究。E-mail：lifeng9676@aliyun.com

*通信作者：石賢愛(ài)（1971—），男，教授，博士，主要從事海洋生物工程研究。E-mail：shixa@fzu.edu.cn