李英紅 劉珺珺 寧曉明 李 聰 李樂(lè)靜

AEG-1基因促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7轉(zhuǎn)移

李英紅1劉珺珺2寧曉明2李 聰3李樂(lè)靜1

目的 觀察AEG-1基因在細(xì)胞水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7轉(zhuǎn)移的影響。方法 通過(guò)將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)MCF-7細(xì)胞，沉默細(xì)胞中AEG-1表達(dá)量，以轉(zhuǎn)染陰性siRNA作為對(duì)照組。分別采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力、CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中VEGF的變化及HUVEC細(xì)胞體外管腔形成實(shí)驗(yàn)考察AEG-1對(duì)于血管新生的影響。結(jié)果 沉默AEG-1，MCF-7細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力和增殖能力明顯受到抑制。沉默AEG-1，MCF-7細(xì)胞的VEGF表達(dá)明顯降低。上清處理HUVEC細(xì)胞，沉默AEG-1組的血管新生能力明顯受到抑制。結(jié)論 沉默AEG-1基因能顯著抑制MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移的多個(gè)層面，包括細(xì)胞遷移、侵襲、增殖以及血管新生。表明AEG-1基因在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，也為將來(lái)乳腺癌治療開(kāi)拓了新思路。

AEG-1；乳腺癌；轉(zhuǎn)移

乳腺癌是全世界女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致女性癌癥死亡的重要原因之一[1-2]。目前臨床上主要采用手術(shù)、化療等治療手段。然而，乳腺癌的調(diào)控機(jī)制尚不明確。星型細(xì)胞上調(diào)基因1(Astrocyte elevated gene-1，AEG-1)是一種新型促癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等[3-5]。AEG-1可能是乳腺癌形成和發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，選擇性抑制AEG-1在乳腺癌中的表達(dá)可能成為一種新的基因治療方法。癌癥轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過(guò)程，主要包括腫瘤增殖、原位遷移和侵襲、穿透血管壁進(jìn)入血液循環(huán)、再次穿透血管壁達(dá)到遠(yuǎn)端組織、促進(jìn)血管新生等多個(gè)步驟[6-8]。本文重點(diǎn)研究AEG-1參與調(diào)控乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程，尤其是關(guān)于血管新生的作用，這項(xiàng)工作為我們對(duì)乳腺癌治療的研究提供了新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(北京全式金公司)，Trizol總RNA提取試劑(北京天根公司)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)，膠回收試劑盒和質(zhì)粒大提試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司，美國(guó))。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))，Transwell小室，孔徑8 μm(Costar公司，美國(guó))，基質(zhì)膠(BD公司，美國(guó))。siRNA合成(吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，DNA引物合成(蘇州金唯智生物科技有限公司)。MCF-7及HUVEC細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 siRNA合成

AEG-1的siRNA共合成3對(duì)，序列如下：1號(hào)(正義鏈：CCGAAGUACUCGUCAAAAATT，反義鏈：UUUUUGACGAGUACUUCGGCT)，2號(hào)(正義鏈：GAAUCUCCCAAACAAAUAATT，反義鏈：UUAUUUGUUUGGGAGAUUCCC)，3號(hào)(正義鏈：GGAUGUUAGCCGUAAUCAATT，反義鏈：UUGAUUACGGCUAACAUCCCA)，三條鏈等量混合在一起使用。RNAi陰性對(duì)照序列采用隨機(jī)序列：正義鏈：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7及HUVEC細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基，含有10%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液一次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將MCF-7細(xì)胞接種于24孔板(105/孔)，24 h后采用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染，將脂質(zhì)體和siRNA按照比例孵育后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，4～6 h后換液，待轉(zhuǎn)染24～48 h后取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA作為對(duì)照組NC，轉(zhuǎn)染AEG-1的siRNA作為實(shí)驗(yàn)組siAEG-1，后續(xù)的表達(dá)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和功能研究實(shí)驗(yàn)均按照如此分組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

細(xì)胞中去除培養(yǎng)液后加入Trizol溶液直至裂解完全，氯仿抽提總RNA?？俁NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qPCR檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參，qPCR條件為94℃變性2 min，94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均做3組重復(fù)。

1.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞離心后重懸，取5×105個(gè)/mL細(xì)胞100 μL(不含血清)加入Transwell小室上層，600 μL全培養(yǎng)基加入小室下層，24 h后將小室取出，使用4%多聚甲醛溶液固定，使用棉棒輕輕擦除上層殘留細(xì)胞，下層細(xì)胞使用DAPI染色后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)小室分別取上下左右中5個(gè)視野拍照記錄，統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)為先將Transwell小室預(yù)鋪基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱中預(yù)烘半個(gè)小時(shí)，然后將細(xì)胞離心后重懸，取5×105個(gè)/mL細(xì)胞100 μL(不含血清)加入Transwell小室上層，600 μL全培養(yǎng)基加入小室下層，48 h后將小室取出，使用4%多聚甲醛溶液固定，使用棉棒輕輕擦除上層殘留細(xì)胞，下層細(xì)胞使用DAPI染色后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)小室分別取上下左右中5個(gè)視野拍照記錄，統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，與緩沖液按比例混合后100℃煮5 min，8% SDS-PAGE上樣電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗anti-AEG-1(Abcam)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，后加入二抗37℃孵育45 min，TBST洗滌3次，在暗室中壓片，然后顯影、定影。

1.7 ELISA檢測(cè)MCF-7細(xì)胞上清液中VEGF含量

轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中VEGF含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞AEG-1基因表達(dá)水平的影響

通過(guò)qRT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后AEG-1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA的AEG-1基因mRNA表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組下降了75%(P<0.01)(圖1A)。Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，AEG-1的蛋白表達(dá)量也明顯減少(圖1B)，提示AEG-1基因被有效沉默。

圖1 AEG-1 siRNA在MCF-7細(xì)胞中沉默效率驗(yàn)證Figure 1 AEG-1 siRNAs decreased the expression of AEG at levels of mRNA and protein in MCF-7 cells

2.2 沉默AEG-1基因?qū)CF-7細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的影響

在MCF-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染AEG-1基因的siRNA和陰性對(duì)照siRNA(NC組)，利用Transwell方法檢測(cè)穿到下層的細(xì)胞數(shù)目，來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化，穿到下層的細(xì)胞數(shù)目越多，則代表細(xì)胞遷移或侵襲能力越強(qiáng)。轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA之后，細(xì)胞遷移能力下降到18%(P<0.01)，而細(xì)胞侵襲能力下降到28%(P<0.01)(圖2)。通過(guò)CCK8法檢測(cè)AEG-1基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA 72 h之后，細(xì)胞增殖能力下降了30%(P<0.05)(圖3)。

圖2 沉默AEG-1抑制MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲Figure 2 AEG-1 siRNAs inhibited the migration and invasion in MCF-7 cells

2.3 沉默AEG-1基因?qū)EGF基因在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)影響

通過(guò)qRT-PCR和Western blot法分別檢測(cè)AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后VEGF基因mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA的VEGF基因mRNA表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組下降了50%(P<0.01)(圖4A)。Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，VEGF的蛋白表達(dá)量也明顯減少(圖4B)。說(shuō)明AEG-1基因被沉默后，影響了VEGF的表達(dá)。ELISA檢測(cè)結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量與對(duì)照組相比降低了37%(P<0.05)(圖4C)。

2.4 沉默AEG-1基因?qū)UVEC細(xì)胞體外管腔形成的影響

使用MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)上清處理HUVEC細(xì)胞，分為AEG-1 siRNA組和對(duì)照組。HUVEC細(xì)胞在Matrigel基底包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。結(jié)果表明AEG-1 siRNA組與陰性對(duì)照組相比，雖然均可見(jiàn)管腔形成，但是管腔形成明顯減少(圖5)。

圖3 沉默AEG-1抑制MCF-7細(xì)胞增殖Figure 3 AEG-1 siRNAs inhibited the proliferation in MCF-7 cells

圖4 沉默AEG-1抑制 VEGF的表達(dá)Figure 4 AEG-1 siRNAs inhibited the expression of VEGF protein in MCF-7 cells

圖5 沉默AEG-1抑制 HUVEC的管腔形成Figure 5 AEG-1 siRNAs inhibited the tube formation of HUVEC cells

3 討論

全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開(kāi)始一直呈上升趨勢(shì)。我國(guó)腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位。癌癥轉(zhuǎn)移是腫瘤患者致死的最主要原因之一。癌癥轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有一個(gè)系統(tǒng)的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控整個(gè)過(guò)程[9]。一些文章報(bào)道了幾個(gè)關(guān)鍵基因，例如KISS1、MMP9、VEGF等，為正向或者負(fù)向的調(diào)控因子[10-12]。但是我們對(duì)分子機(jī)制的理解遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在臨床上，我們?nèi)匀蝗狈τ行У目刂瓢┌Y轉(zhuǎn)移的方法。

AEG-1基因是一個(gè)重要的原癌基因，它起初發(fā)現(xiàn)在艾滋病和腫瘤壞死因子感染的人類(lèi)腦星形膠質(zhì)瘤當(dāng)中[3]。人類(lèi)AEG-1蛋白含有582個(gè)氨基酸，分子量為64 kD[3]。在許多腫瘤組織當(dāng)中，其基因擴(kuò)增要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相鄰正常癌旁組織[3]。AEG-1基因的高表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤的進(jìn)展，也促進(jìn)了許多腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[13-16]。近年來(lái)，有研究表明，AEG-1與著名的原癌基因C-Myc協(xié)同作用，促進(jìn)癌癥的發(fā)生和腫瘤的生長(zhǎng)[17]。因此我們猜測(cè)AEG-1在乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7的AEG-1表達(dá)量，可以有效地抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。這些研究結(jié)果表明，AEG-1在乳腺癌的腫瘤生長(zhǎng)、局部擴(kuò)散、組織浸潤(rùn)等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。通過(guò)靶向沉默AEG-1，可以有效地抑制原發(fā)灶乳腺癌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。

血管生成是癌癥轉(zhuǎn)移和二級(jí)腫瘤組織形成的重要因素，因此很多治療癌癥的策略是基于抑制血管生成。VEGF是新血管形成的關(guān)鍵因子，已被證實(shí)是迄今最有效、特異性最高的血管生成因子，它可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員、遷移和分化并參與新血管形成[18-19]。在乳腺癌組織中，AEG-1顯著高表達(dá)[20]，并且與VEGF表達(dá)量呈相關(guān)性[21]。因此我們猜測(cè)AEG-1在乳腺癌中可能調(diào)控VEGF，并且在血管生成過(guò)程中起到重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默AEG-1可以有效地降低乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞VEGF的表達(dá)和分泌，并且可以抑制HUVEC的管腔形成。這些研究結(jié)果表明，在乳腺癌中AEG-1正向調(diào)控VEGF，通過(guò)靶向沉默AEG-1可以有效地抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的血管新生。

綜上所述，AEG-1基因在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，通過(guò)靶向抑制AEG-1的表達(dá)可以有效地抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。這一研究結(jié)果為將來(lái)乳腺癌治療開(kāi)拓了新思路。

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(收稿：2017-02-24)

堅(jiān)決貫徹執(zhí)行《發(fā)表學(xué)術(shù)論文“五不準(zhǔn)”》通知

為弘揚(yáng)科學(xué)精神，加強(qiáng)科學(xué)道德和學(xué)風(fēng)建設(shè)，抵制學(xué)術(shù)不端行為，端正學(xué)風(fēng)，維護(hù)風(fēng)清氣正的良好學(xué)術(shù)生態(tài)環(huán)境，重申和明確科技工作者在發(fā)表學(xué)術(shù)論文過(guò)程中的科學(xué)道德行為規(guī)范，中國(guó)科協(xié)、教育部、科技部、衛(wèi)生計(jì)生委、中科院、工程院、自然科學(xué)基金會(huì)共同研究制定了《發(fā)表學(xué)術(shù)論文“五不準(zhǔn)”》。

1．不準(zhǔn)由“第三方”代寫(xiě)論文?？萍脊ぷ髡邞?yīng)自己完成論文撰寫(xiě)，堅(jiān)決抵制“第三方”提供論文代寫(xiě)服務(wù)。

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5．不準(zhǔn)違反論文署名規(guī)范。所有論文署名作者應(yīng)事先審閱并同意署名發(fā)表論文，并對(duì)論文內(nèi)容負(fù)有知情同意的責(zé)任；論文起草人必須事先征求署名作者對(duì)論文全文的意見(jiàn)并征得其署名同意。論文署名的每一位作者都必須對(duì)論文有實(shí)質(zhì)性學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)，堅(jiān)決抵制無(wú)實(shí)質(zhì)性學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)者在論文上署名。

本“五不準(zhǔn)”中所述“第三方”指除作者和期刊以外的任何機(jī)構(gòu)和個(gè)人；“論文代寫(xiě)”指論文署名作者未親自完成論文撰寫(xiě)而由他人代理的行為；“論文代投”指論文署名作者未親自完成提交論文、回應(yīng)評(píng)審意見(jiàn)等全過(guò)程而由他人代理的行為。

本刊編輯部

AEG-1 promotes metastasis of breast cancer MCF-7 cells

LIYinghong1，LIUJunjun2，NINGXiaoming2，LICong3，LILejing1

1.Department of Internal Medicine，Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China；2.Department of Pathology，Harbin Medical University Cancer Hospital；3.Department of Hepatobiliary Surgery，China PLA General Hospital

Objective The objective of this study was to observe the effect of AEG-1 gene on the metastasis in breast cancer MCF-7 cells.Methods AEG-1 siRNAs were transfected into MCF-7 cells to silence AEG-1 expression，and negative siRNA was used as a control.Transwell chamber was used to detect the ability of cell migration and invasion of MCF-7 cells.CCK8 assay was used to detect the cell proliferation of MCF-7 cells.At the same time，the effect of VEGF on the angiogenesis was investigated by detecting the changes of lumen formation in HUVEC cells.Results The migration，invasive and proliferative abilities were significantly inhibited in MCF-7 cells transfected with AEG-1 siRNA.Knockdown AEG-1 was significantly decreased the level of VEGF in the supernatant of MCF-7 cells.Knockdown AEG-1 was also significantly inhibited the angiogenesis activity in HUVEC cells.Conclusion Knockdown AEG-1 can significantly inhibit the migration of MCF-7 cells，including cell migration，invasion，proliferation and angiogenesis.These results suggest that AEG-1 plays an important role in the metastasis process of breast cancer and opens up new ideas for future treatment breast cancer.

AEG-1；Breast cancer；Metastasis

黑龍江省教育廳課題面上項(xiàng)目(12521295)

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)五科(哈爾濱 150081)；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科；3.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科

李英紅，女，(1975-)，博士，副主任醫(yī)師，從事實(shí)體腫瘤基礎(chǔ)與臨床的研究。

李樂(lè)靜，E-mail：xcl_1974@163.com

R735.3+5

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.04.003