冉 然 侯玉婷 黎 霞

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610101)

·中醫(yī)中藥與免疫·

復(fù)方黑骨藤對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠IL- 4、IFN- γ及TGF- β1表達(dá)的影響①

冉 然 侯玉婷 黎 霞

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610101)

目的：研究復(fù)方黑骨藤對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清中IL- 4、IFN- γ和TNF- α及關(guān)節(jié)滑膜組織中TGF- β1的表達(dá)水平的影響，以深入探討復(fù)方黑骨藤對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用及其相關(guān)機(jī)制。方法：構(gòu)建大鼠弗氏完全佐劑性(AA)關(guān)節(jié)炎模型，通過ELISA與免疫組化方法分別檢測大鼠血液中IL- 4、IFN- γ、TNF- α的含量和大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TGF- β1的含量。結(jié)果：模型組與正常組比較，血清的IFN- γ、TNF- α水平升高，IL- 4和滑膜組織中的TGF- β1水平降低(P<0.01)。復(fù)方黑骨藤組與模型組比較血清中IFN- γ、TNF- α水平顯著下降，IL- 4、TGF- β1水平上調(diào)，與模型組有顯著性差異。結(jié)論：本實驗研究表明復(fù)方黑骨藤能顯著抑制IFN- γ、TNF- α的表達(dá)，增強(qiáng)IL- 4、TGF- β1的表達(dá)，調(diào)整大鼠Th1/Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子失衡，從而減輕關(guān)節(jié)滑膜炎癥的持續(xù)發(fā)展和軟骨破壞，對實驗性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜組織中T細(xì)胞增生及浸潤具有顯著的抑制作用。

復(fù)方黑骨藤;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;Th1/Th2;IL- 4;IFN- γ;TGF- β1

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病，其病理學(xué)改變包括滑膜的慢性炎癥、淋巴細(xì)胞浸潤、血管翳的形成和軟骨組織的破壞，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形、功能喪失。RA的發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)RA是一種由多種細(xì)胞因子參與介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，參與其致病過程的關(guān)鍵細(xì)胞因子有IFN- α、IFN- β 及IL- 6、7、10、12、15、21、23、1、17、18，TGF- β和TNF等[1]。目前，臨床上仍缺乏有效治療RA的藥物，且長期使用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類等藥物，會產(chǎn)生較大的毒副作用和不良反應(yīng)，也不可逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)損傷、不能有效控制病情進(jìn)展和骨破壞。生物制劑則是新型的RA治療藥物，可特異性與相應(yīng)的靶點結(jié)合，起效迅速且作用明顯，但是仍有高達(dá)30%的患者對其藥物反應(yīng)不足[2]。因此，研究開發(fā)具有顯著療效的治療RA的藥物是非常有必要的。黑骨藤Periploca forrestil Schltr.為蘿藦科杠柳苷屬的植物，性熱、味苦，具有熱解毒、活血通經(jīng)及祛風(fēng)濕等功效[3]，藥理研究表明它可用于治療風(fēng)濕痹痛，提示可能與其對炎性細(xì)胞因子的干預(yù)有密切的關(guān)系[4，5]。復(fù)方黑骨藤是以黑骨藤為主藥，配以秦艽、元胡兩味中藥經(jīng)乙醇超聲提取后所得。本實驗以佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis，AA)大鼠為模型，研究復(fù)方黑骨藤對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠外周血Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的變化以及大鼠滑膜組織中的TGF- β1浸潤T淋巴細(xì)胞的影響，進(jìn)一步在分子及組織的水平上探討其治療RA的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量(180±10)g,由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖提供，動物合格證號為SCXK(川)2013- 24。

1.1.2 藥材與藥品 黑骨藤藥材購買于西昌藥材市場，秦艽(Gentiana macrophylla pall，批號：20130526)及元胡(Rhizoma corydalis，批號：20130605)均購買于北京同仁堂股份有限公司,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝教授鑒定。醋酸潑尼松片(批號：H33021207，規(guī)格5 mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司)；雷公藤多苷片(批號：Z31020415，規(guī)格10 mg/片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司。)；

1.1.3 試劑與儀器 弗氏完全佐劑(Freund′s complete adjuvant,FCA，Sigma公司)，IL- 4、IFN- γ定量ELISA試劑盒(上海邦奕公司，批號：DRE20093、DRE20041)，TGF- β1一抗(武漢博士德生物有限公司，批號：BA0290)，二抗及相應(yīng)試劑均購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀(成都軍能海爾思科技有限公司，Mass)，離心機(jī)(Anke TGL- 16G，上海安亭科學(xué)儀器廠)，奧林巴斯BH- 2光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)，數(shù)字?jǐn)z像儀TK- C1381(日本Vietor)，BioMias計算機(jī)圖像處理分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所研發(fā))。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)方黑骨藤制備 復(fù)方黑骨藤由秦艽、元胡和黑骨藤藥材粗粉按1∶1∶2.5混合后，提取條件：提取溫度為60℃，提取時間為30 min，提取次數(shù)為2次，用50%乙醇提取，料液比為1∶10，超聲波提取機(jī)的超聲間隙時間5 s/3 s，功率800 W。提取液中檢測到總黃酮、總萜、總生物堿、落干酸、6′- O- β- D- 葡萄糖基龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素含量分別為：0.949 5%、1.943 6%、0.089 1%、0.088 0%、0.150 4%、0.043 5%、1.251 8%、0.018 4%、0.115 6%、0.008 4%、0.031 5%、0.003 8%。提取液蒸干溶劑后所得浸膏用蒸餾水配制成給藥所需劑量。

1.2.2 動物分組及造模 取Wistar健康大鼠70只，體重(180±10) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用動物電子天平稱量大鼠體重，將動物隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組(醋酸潑尼松組和雷公藤多苷組)、復(fù)方黑骨藤提取物高、中、低劑量組共7組，每組10只。參照文獻(xiàn)[5]的佐劑性關(guān)節(jié)炎造模方法，空白組在右側(cè)后肢足墊皮下注射0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液。模型組，陽性對照組及復(fù)方黑骨藤實驗組于實驗第1天在每只大鼠右后足趾皮下注射0.1 ml弗氏完全佐劑致炎。

1.2.3 將致炎24 h后實驗大鼠分別灌胃相應(yīng)的藥物 空白組、模型組分別灌胃蒸餾水；陽性組分別灌胃醋酸潑尼松5.84 mg、雷公藤多苷7.5 mg；復(fù)方黑骨藤提取物高、中、低劑量組分別灌胃劑量67、44、22 mg。每天每只大鼠灌胃1次，連續(xù)灌胃21 d。1.2.4 大鼠足腫脹的測定 于致炎前及致炎后18 h 及第2、4、7、11、14、21天分別用PV- 200足腫脹測定儀測量各組大鼠左、右足足跖容積，計算足腫脹度。腫脹度=[(第n天足容積-致炎前足容積)/致炎前足容積]×100%。

1.2.6 血漿中IL- 4、IFN- γ的含量測定 持續(xù)給藥21 d后將大鼠處死，心臟取血，檢測血液中IL- 4、IFN- γ的含量。測定方法為：血液放入離心管中以3 000 r/min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的要求:待測樣品孔每孔加入40 μl樣品稀釋液及10 μl待測樣品，于37℃孵育30 min，浸泡法洗板，除空白孔每孔加入相對應(yīng)的50 μl HRP標(biāo)記酶標(biāo)試劑，孵育洗板后每孔先加入50 μl顯色劑A，再加入50 μl顯色劑B，混勻后37℃避光顯色15 min，最后每孔加入50 μl終止液終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，測得OD450值，測定IL- 4、IFN- γ含量。

1.2.7 病理切片及免疫組織化學(xué)染色切片制備 于實驗第22天治療后處死大鼠，無菌條件下取每組每只大鼠的右后膝關(guān)節(jié)，置于10%中性福爾馬林固定液中固定，稀硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片；制好的切片脫蠟、脫水，3%H2O2孵育,蒸餾水沖洗后PBS浸泡5 min，再用PBS稀釋過的山羊血清密封，室溫孵育，倒掉血清后滴加一抗或一抗工作液于PBS下沖洗3次，再滴加1%BAS- PBS稀釋的生物素標(biāo)記二抗，PBS沖洗3次；滴加用PBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，孵育后PBS沖洗3次，最后用AEC或DAB顯色劑顯色，蒸餾水沖洗，復(fù)染，中性塑膠固封。

1.2.8 觀察免疫組化切片指標(biāo)方法 免疫組化檢測TGF- β1在光鏡下對每只大鼠組織切片進(jìn)行觀察，選取陽性表達(dá)較為顯著的5個視野(×200)，經(jīng)計算機(jī)攝像系統(tǒng)采樣后，采用Biomias計算機(jī)圖像處理分析軟件對信號強(qiáng)度進(jìn)行分析，得出定量的各個指標(biāo)陽性染色面積和積分光密度值；取每只動物的5張切片得出數(shù)據(jù)的平均值代表該樣本的陽性結(jié)果。1.2.9 觀察HE切片的方法 光學(xué)顯微鏡下觀察AA大鼠膝關(guān)節(jié)的損傷情況，從滑膜組織細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生、巨噬細(xì)胞增生等方面，依病理損傷程度共分4級，正常1級(0分)，輕度損害2級(1分)，中度損害3級(2分)，重度損害4級(3分)。

2 結(jié)果

2.1 藥物對AA大鼠足腫脹度的影響 如表1所示，注射弗氏完全佐劑后，模型組從致炎第1天起持續(xù)腫脹至炎后第4天，而后開始逐漸消退，于致炎后第14天開始再次持續(xù)腫脹，第21天腫脹達(dá)到最大值，與空白組對照有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。高、中、低劑量復(fù)方黑骨藤組與模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明高、中、低劑量復(fù)方黑骨藤組均能明顯減輕AA大鼠膝關(guān)節(jié)炎癥，使腫脹度明顯下降(P<0.01)；復(fù)方黑骨藤與雷公藤多苷、醋酸潑尼松在降低大鼠腫脹度水平上無顯著性差異。

2.2 藥物對AA大鼠免疫器官的影響 注射弗氏完全佐劑后，模型組大鼠的胸腺出現(xiàn)了異常腫大以及脾臟出現(xiàn)了萎縮，與空白組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，說明佐劑性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與免疫器官失衡有關(guān)。經(jīng)藥物治療后，復(fù)方黑骨藤組及雷公藤多苷組的胸腺和脾臟指數(shù)與模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，與空白組比較無顯著差異，說明復(fù)方黑骨藤能降低胸腺指數(shù)及升高脾臟指數(shù)且與雷公藤多苷無差異但效果不及醋酸潑尼松。醋酸潑尼松組與雷公藤多苷組與空白組及模型組均有極顯著差異(P<0.01)，說明醋酸潑尼松對大鼠免疫器官具有極強(qiáng)抑制作用。

2.3 藥物對AA大鼠血漿中TNF- α、IL- 4、IFN- γ含量的影響 如表2所示，模型組大鼠血漿中TNF- α為167.703±14.888，明顯高于正常組74.275±13.799(P<0.01)，模型組IFN- γ為1 166.123±96.74，明顯高于正常組363.098±57.488(P<0.01)，模型組IL- 4為65.488±10.374，明顯低于正常組(P<0.01)，模型組中IFN- γ/IL- 4比值為16.379±5.865，明顯高于正常組3.366±0.574(P<0.01)，藥物醋酸潑尼松治療后，TNF- α為142.434±29.870較模型組低(P<0.05)，IFN- γ為843.748±159.88較模型組低(P<0.01)。IL- 4為92.685±10.858高于模型組(P<0.01)。IFN- γ/IL- 4比值為10.329±3.933較模型組低(P<0.01)。IFN- γ為698.315±144.346明顯低于模型組(P<0.01)。藥物雷公藤多苷治療后，TNF- α為125.047±12.69較模型組低 (P<0.05)。 IFN- γ 為 698.315±144.346較模型組低 (P<0.01)。IL- 4為81.190±5.784高于模型組(P<0.05)。IFN- γ/IL- 4的比值為8.644±2.052低于模型組(P<0.01)。復(fù)方黑骨藤高、中、低劑量治療后，TNF- α分別為138.879±33.66、104.651±36.23、89.423±29.239，中、低劑量組明顯低于模型組(P<0.01)。IFN- γ分別為709.309±120.678、517.621±168.069、455.825±124.230明顯低于模型組(P<0.01)。IL- 4分別為75.659±10.319、75.891±9.725、88.579±23.367，中、高劑量組高于模型組(P<0.05)，低劑量組明顯高于模型組(P<0.01)。IFN- γ/IL- 4比值分別為9.662±2.083、7.458±1.924、5.383±2.035，低于模型組(P<0.01)。

GroupsDosages(mg)SwellingdimensionofjointsInducedinflammatory18h2d4d11d14d21dBlank-0.058±0.0580.010±0.0480.052±0.0350.092±0.0450.134±0.0320.176±0.0380.206±0.045Model-0.946±0.0602)0.949±0.1012)0.938±0.0912)0.921±0.1462)0.988±0.0871)1.093±0.2512)1.106±0.1392)Prednisoneacetate5.840.962±0.1170.779±0.0591)0.696±0.0451)0.672±0.0671)0.619±0.0741)0.559±0.0871)0.559±0.0491)TWHF7.500.926±0.0610.806±0.0691)0.773±0.0611)0.720±0.0811)0.762±0.1331)0.778±0.1901)0.672±0.1271)Low-dose25.200.925±0.0430.814±0.0401)0.758±0.0541)0.725±0.0941)0.738±0.1761)0.764±0.1121)0.726±0.0511)Middle-dose50.400.931±0.0750.803±0.0471)0.736±0.0731)0.713±0.0631)0.662±0.1621)0.668±0.1301)0.662±0.0811)High-dose75.600.932±0.0590.794±0.0511)0.726±0.0581)0.678±0.0651)0.649±0.1431)0.628±0.0991)0.661±0.0891)

Note：Vs model group，1)P<0.01;vs blank group，2)P<0.01.

以上實驗數(shù)據(jù)可看出，模型組大鼠血漿中TNF- α、IFN- γ的含量均升高，而IL- 4的含量降低，與空白組比較差異顯著(P<0.01)。復(fù)方黑骨藤治療后，大鼠血漿中的細(xì)胞因子TNF- α、IFN- γ明顯降低，IL- 4水平升高(P<0.05或P<0.01)，表明復(fù)方黑骨藤能顯著降低大鼠血漿中TNF- α、IFN- γ的含量水平，升高血漿中IL- 4的含量水平，使IFN- γ/IL- 4比值趨向正常；復(fù)方黑骨藤組的AA大鼠的IFN- γ/IL- 4比值與模型組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。復(fù)方黑骨藤、雷公藤多苷及醋酸潑尼松均能不同程度地降低血漿中TNF- α、IFN- γ的含量水平及IFN- γ/IL- 4比值，升高IL- 4，且與空白組無顯著性差異。

2.4 藥物對AA大鼠滑膜組織中TGF- β1含量的影響 光鏡下觀察(×200)，各組AA大鼠切片可見TGF- β1陽性染色細(xì)胞，呈黃棕色或黃色顆粒狀，分散存在于滑膜組織中。與空白組比較，模型組TGF- β1積分光密度總和值和面積總和值明顯下降，平均光密度升高，差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，復(fù)方黑骨藤組TGF- β1積分光密度總和值和面積總和值明顯升高，平均光密度下降，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。復(fù)方黑骨藤組與醋酸潑尼松組、雷公藤多苷組在升高TGF- β1表達(dá)水平上比較無顯著性差異。結(jié)果可見表3及圖1。

2.5 各組AA大鼠HE染色結(jié)果的比較 空白組大鼠滑膜組織表面光滑透明，滑膜細(xì)胞呈單層，排列整齊，無血管增生，無纖維化，未見T淋巴細(xì)胞浸潤，軟骨表面光滑平整，軟骨未見破壞。模型組滑膜表面明顯腫脹，充血肥厚，滑膜組織呈灶性增生， 具有多層滑膜細(xì)胞，排列不整齊，呈指狀或絨毛狀?；そM織中毛細(xì)管增多充血，有大量的T淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組比較，復(fù)方黑骨藤組的炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生均得到改善，滑膜腫脹、充血、血管增生下降，差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且復(fù)方黑骨藤與雷公藤多苷組、醋酸潑尼松組比較無顯著性差異。結(jié)果可見圖2及表4。

GroupsDosages(mg)TNF-α(ng/ml)IFN-γ(ng/ml)IL-4(ng/ml)IFN-γ/IL-4Blank-74.275±13.799363.098±57.488107.111±11.932 3.366±0.574Model-167.703±14.8883)1166.123±96.7403)65.488±10.3743)16.379±5.8653)Prednisoneacetate5.84142.434±29.8701)843.748±159.8802)92.685±10.8582)10.329±3.9332)TWHF7.50125.047±12.6921)698.315±144.3462)81.190±5.7841)8.644±2.0522)High-dose67.00138.879±33.661)709.309±120.6782)75.659±10.3191)9.662±2.0832)Middle-dose44.00104.651±36.232)517.621±168.0692)75.891±9.7251)7.458±1.9242)Low-dose22.0089.423±29.2392)455.825±124.2302)88.579±23.3672)5.383±2.0352)

Note：Vs model group，1)P<0.05，2)P<0.01;vs blank group，3)P<0.01.

GroupsDosages(mg)TGF-β1TotalIOD(μm)Totalarea(μm)AOD(μm)Blank-11700.32±1565.6435459.76±2933.860.19±0.01Model-3847.95±737.283)10998.45±2395.533)0.25±0.013)Prednisoneacetate5.84 7448.22±1325.102)21601.91±1649.492)0.22±0.012)TWHF7.50 9636.78±1136.122)27898.69±3980.292)0.20±0.022)High-dose67.0010758.17±632.992)30844.46±1073.292)0.21±0.022)Middle-dose44.009948.75±752.982)30039.08±1502.212)0.22±0.012)Low-dose22.007676.92±998.992)23924.08±2727.952)0.23±0.021)

Note：Vs model group，1)P<0.05，2)P<0.01;vs blank group，3)P<0.01.

圖1 大鼠滑膜組織TGF- β1染色(×200)Fig.1 TGF- β1 staining- in- synovial tissues of rats(×200)Note: A.Blank group;B.Model group;C.Prednisone acetate group;D.TWHF group;E.Low- dose group;F.Middle- dose group;G.High- dose group.

圖2 大鼠關(guān)節(jié)軟骨HE染色(×200)Fig.2 HE staining in cartilages of rats(×200)Note: A.Blank group;B.Model group;C.Prednisone acetate group;D.TWHF group;E.Low- dose group;F.Middle- dose group;G.High- dose group.

表4 各組大鼠HE染色結(jié)果比較

Tab.4 Comparison of HE staining in cartilages of rats

GroupsDosages(mg)InfiltrationofinflammatorycellHyperplasiaofsynoviumProliferationoffibroustissueGrowthofmacrophagecellBlank-0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000Model-2.167±0.4083)2.000±0.0003)2.167±0.4083)2.000±0.0003)Prednisoneacetate5.841.400±0.5481)1.400±0.8941.200±0.8371)1.000±0.7072)TWHF7.501.167±0.7532)1.167±0.7531)1.000±0.6321)0.833±0.4082)High-dose67.001.500±0.5481)1.167±0.9831)1.333±0.8171)0.667±0.5162)Middle-dose44.000.833±0.4082)0.667±0.8171)0.333±0.5162)0.667±0.5162)Low-dose22.001.167±0.4082)0.833±0.7531)0.667±0.8172)1.000±06322)

Note：Vs model group，1)P<0.05，2)P<0.01;Vs blank group，3)P<0.01.

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為病理特點，以全身多關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增生及大量淋巴細(xì)胞浸潤為特征的自身免疫疾病。胸腺、脾臟等指數(shù)的變化反映了動物機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本功能，可作為初步觀察藥物對免疫功能影響的指標(biāo)。本試驗研究結(jié)果表明，復(fù)方黑骨藤能顯著降低脾臟和胸腺指數(shù)，提示復(fù)方黑骨藤可能通過調(diào)節(jié)免疫器官功能來提高抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用的能力，與雷公藤多苷無顯著性差異，不及醋酸潑尼松。但醋酸潑尼松對AA大鼠的體重增長有較大的影響，并使其胸腺、脾臟出現(xiàn)了萎縮，表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫抑制作用。

RA的病理機(jī)制目前尚不十分清楚，但許多研究表明淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的異常細(xì)胞免疫在RA的病理中起著重要的作用，其中T細(xì)胞的活化及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子是引起免疫損傷的主要因素[7，8]。RA滑膜組織病理學(xué)表現(xiàn)為大量的T淋巴細(xì)胞浸潤，以輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th1和Th2)兩個亞群占主導(dǎo)地位，這為RA是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病提供了證據(jù)[9]。正常人的Th1、Th2型兩種細(xì)胞亞群之間及Th1/Th2及其細(xì)胞因子間存在動態(tài)平衡，而RA患者的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)則明顯向Th1方向發(fā)生偏移[10]。Th1細(xì)胞主要分泌IFN- γ、IL- 1β、TNF- α等，以IFN- γ為代表，IFN- γ可促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，抑制Th2細(xì)胞增殖，促進(jìn)免疫細(xì)胞和滑膜細(xì)胞增生及活化，參與RA關(guān)節(jié)慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展[11]；Th2細(xì)胞主要分泌IL- 4、IL- 10、TGF- β1等，以IL- 4為代表，IL- 4可通過促進(jìn)Th2細(xì)胞的擴(kuò)增及抗炎性細(xì)胞因子的釋放，抑制MMPs產(chǎn)生及IL- 1、IL- 6、IL- 8和TNF- α釋放，進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨和改善慢性關(guān)節(jié)炎癥的作用[12- 15]；實驗結(jié)果可見，模型組AA大鼠血液中Th1細(xì)胞分泌的IFN- γ和TNF- α含量均顯著升高，明顯高于空白組大鼠，而Th2型細(xì)胞因子IL- 4低于空白組大鼠，體內(nèi)IFN- γ的高度表達(dá)量和IL- 4低表達(dá)量導(dǎo)致IFN- γ/IL- 4比值升高，IFN- γ占優(yōu)勢，促使淋巴細(xì)胞Th1/Th2及其細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)明顯向Th1方向發(fā)生偏移，AA大鼠淋巴細(xì)胞Th1/Th2及其細(xì)胞因子間失去動態(tài)平衡，導(dǎo)致免疫細(xì)胞和滑膜細(xì)胞增生及活化。經(jīng)藥物治療，Th1細(xì)胞因子IFN- γ和TNF- α含量均較模型組降低，Th2細(xì)胞因子IL- 4表達(dá)較模型組升高，提示復(fù)方黑骨藤促進(jìn)AA大鼠血液中Th2細(xì)胞的分化及其分泌，提高IL- 4的含量，抑制AA大鼠血液中Th1細(xì)胞IFN- γ和TNF- α因子分泌，使IFN- γ/IL- 4的比值降低，提示藥物治療促進(jìn)Th1/Th2向Th2方向偏移，進(jìn)而使Th1/Th2恢復(fù)平衡狀態(tài)。從而改善關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥的發(fā)展。

TGF- β1是一組蛋白超家族，已證實TGF- β1可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化[7]，TGF- β1可調(diào)控和增加單核細(xì)胞的作用，阻礙T淋巴細(xì)胞繁殖，限制吞噬細(xì)胞的發(fā)育與活性，阻礙炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織表達(dá)的TGF- β1水平遠(yuǎn)不足空白組，提示模型組大鼠體內(nèi)抑制免疫活性細(xì)胞的增殖和淋巴細(xì)胞的分化作用減弱，TGF- β1表達(dá)減少也使得細(xì)胞修復(fù)能力下降。同時，TGF- β1表達(dá)減少使其促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組織胺減少，這似乎與現(xiàn)象相矛盾，但導(dǎo)致關(guān)節(jié)發(fā)炎紅腫的途經(jīng)不僅僅是TGF- β1的促進(jìn)，還有IL- 1、IL- 6、IL- 8等致炎因子的作用。實驗顯示模型組膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)大面積的炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞浸潤面積也是最大的，進(jìn)一步說明了RA的炎性細(xì)胞浸潤與TGF- β1的表達(dá)有關(guān)；經(jīng)藥物治療，滑膜組織中TGF- β1表達(dá)均較模型組高，尤其是復(fù)方黑骨藤高劑量差異更加明顯，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明復(fù)方黑骨藤可以促進(jìn)TGF- β1的表達(dá)而抑制T淋巴細(xì)胞繁殖，改善滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤，阻礙炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而阻止RA的進(jìn)一步發(fā)展。

復(fù)方黑骨藤能增加TGF- β1的表達(dá)，通過抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖、抑制抗體的產(chǎn)生，減少自然殺傷細(xì)胞的產(chǎn)生從而減弱免疫反應(yīng)。近來研究還表明，TGF- β1有可控的抑制作用且其還具有促進(jìn)軟骨特異性基質(zhì)的合成的功能，其通過促使間充質(zhì)細(xì)胞成熟分化為軟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)形成，抑制多種蛋白酶對軟骨基質(zhì)的破壞，從而實現(xiàn)軟骨的自我再生功能，增強(qiáng)了軟骨本身的抗損傷能力，可以使損傷實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)修復(fù)。而抑制T細(xì)胞增殖的同時，提高IL- 4，降低IFN- γ和TNF- α的表達(dá)，使Th1/Th2細(xì)胞向Th2方向偏移，使得關(guān)節(jié)滑膜組織中Th1/Th2恢復(fù)平衡狀態(tài)。從而改善關(guān)節(jié)T淋巴細(xì)胞浸潤，阻止滑膜炎癥的持續(xù)發(fā)展，阻止關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的崩解，減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷面積。

各組AA大鼠病理學(xué)組織切片結(jié)果顯示：模型組滑膜表面明顯腫脹，滑膜組織增生，排列不整齊，毛細(xì)管增多充血，有大量的T淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組相比，復(fù)方黑骨藤組的炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生均得到改善，滑膜腫脹、充血度降低，差異極顯著(P<0.01)。

綜上所述，復(fù)方黑骨藤能顯著降低AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織的損傷，修復(fù)被破壞的組織，并較好的減緩、阻止了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。復(fù)方黑骨藤的實驗研究為應(yīng)用于RA的臨床治療提供了理論依據(jù)。

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[收稿2016- 10- 27 修回2017- 01- 17]

(編輯 倪 鵬)

Effects of Periploca forrestil Schltr Compound extracts on IL- 4，IFN- γ and TGF- β1 of rats with adjuvant arthritis

RAN Ran，HOU Yu- Ting，LI Xia.

College of Life Sciences,Sichuan Normal University,Chengdu 610101,China

Objective:To observe the effects of Periploca forrestil Schltr Compound extract in serum interleukin- 4(IL- 4),interferon- γ(IFN- γ),tumor necrosis factor- α (TNF- α) and transforming growth factor- β1 (TGF- β1) in joint synovial tissue of rats,and further to investigate it′s therapeutic effects and related mechanism.Methods: To built the complete adjuvant arthritis (AA) model in rats,and then to detect the contents of IL- 4,IFN- γ,TNF- α in serum by ELISA,TGF- β1 in synovial tissues of rats knee was detected by immunohistochemistry.Results: The contents of IFN- γ,TNF- α were higher and IL- 4 and TGF- β1 were lower in adjuvant arthritis rats (model group) than those in blank control (P<0.01).By comparing with the model group the contents of IFN- γ and TNF- α were significantly lower in Periploca forrestil Schltr Compound treated rat group,whereas the expressions of IL- 4 and TGF- β1 were increased(P<0.05).Conclusion: The Periploca forrestil Schltr Compound can significantly inhibit the expression of IFN- γ and TNF- α,and enhance the expression of IL- 4 and TGF- β1,adjusted the Th1/Th2 cell and cytokines imbalance,to alleviate arthritis and cartilage destruction,therefore the Periploca forrestil Schltr Compound can significantly inhibit the proliferation of T lymphocyte and infiltration in synovial tissues of experimental rheumatoid arthritis.

Periploca forrestil Schltr Compound；Rheumatoid arthritis;Th1/Th2；Interleukin- 4；Interferon- γ；Transforming growth factor- β1

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.009

①本文受國家自然科學(xué)基金(31240087)資助。

冉 然(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事藥理學(xué)方面研究，E- mail：869840625@qq.com。

及指導(dǎo)教師：黎 霞(1960年-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥理學(xué)方面的研究，E- mail：676037091@qq.com。

R96

A

1000- 484X(2017)08- 1164- 07