鄭 靜 劉乃國(guó) 倪 娜 董洪亮 王 楠 成苗青

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,濱州256603)

1,25(OH)2VD3對(duì)大鼠肺纖維化中IL- 9及PU.1表達(dá)水平的影響①

鄭 靜 劉乃國(guó) 倪 娜 董洪亮 王 楠 成苗青

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,濱州256603)

目的：探討肺纖維化發(fā)生發(fā)展中IL- 9及PU.1的作用以及活性維生素D3[1,25(OH)2VD3]在纖維化過(guò)程中對(duì)兩種因子表達(dá)水平的影響。方法：90只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分成三個(gè)組：對(duì)照組、模型組和治療組(n=30)。模型組和治療組經(jīng)氣管注入博來(lái)霉素(5 mg/kg)建立肺纖維化模型，對(duì)照組注入等體積生理鹽水。治療組于手術(shù)后第2天腹腔注射活性維生素D3，模型組注射等量的活性維生素D3溶劑(丙二醇)，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。各種處理均為兩天一次。分別于手術(shù)后第14、21和28天處死大鼠取材，各小組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠。HE染色法觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠肺部病理變化，Masson染色法觀察膠原纖維的差異，堿水解法檢測(cè)羥脯氨酸含量的變化。應(yīng)用Real- time PCR和免疫組化技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)大鼠肺組織中IL- 9及PU.1的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清中IL- 9的表達(dá)水平。結(jié)果：博來(lái)霉素處理后，第14天大鼠肺部已經(jīng)出現(xiàn)纖維化，隨著時(shí)間推移，纖維化進(jìn)一步加重。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組和治療組的羥脯氨酸含量明顯高于對(duì)照組，而治療組明顯低于模型組。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，治療組和模型組中IL- 9及PU.1的表達(dá)量均逐漸增高，且都顯著高于對(duì)照組；第14、21天治療組兩種因子的表達(dá)量均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組,第28天時(shí)治療組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第21天模型組和治療組IL- 9和PU.1的表達(dá)水平明顯高于第14天，第28天與第21天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：IL- 9和PU.1在博來(lái)霉素引起的大鼠肺纖維化早期可能發(fā)揮促纖維化作用?；钚跃S生素D3可能通過(guò)降低PU.1的表達(dá)水平，進(jìn)而減少IL- 9的分泌，從而對(duì)大鼠肺纖維化的發(fā)生發(fā)展起一定的抑制作用。

肺纖維化；活性維生素D3；IL- 9；PU.1

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)，以彌漫性肺實(shí)質(zhì)、肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化為基本病理病變。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，也缺乏有效的治療措施。因此探討其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D3(VD3)具有抑制小鼠肺纖維化的作用[1,2]。IL- 9(Interleukin9，IL- 9)是一種T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其靶標(biāo)細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，在自身免疫疾病的發(fā)生中具有重要作用[3]。小鼠中的IL- 9過(guò)度表達(dá)與肺纖維化的發(fā)展和發(fā)病率有關(guān)[4,5]。Chang等[6]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PU.1可以特異性地增強(qiáng)Th9細(xì)胞表型，為Th9特異轉(zhuǎn)錄因子。最近研究證實(shí)Th9細(xì)胞通過(guò)PU.1與其他因子的相互作用參與了大鼠肺纖維化的過(guò)程[7,8]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討由博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，IL- 9和PU.1的作用以及活性VD3對(duì)IL- 9和PU.1的影響，為闡明發(fā)病機(jī)制，探索有效治療方法提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 90只6～8周齡SPF級(jí)雄性 SD大鼠購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK (滬)2008- 0016，體重為(200±20)g。博來(lái)霉素為日本化藥株式會(huì)社產(chǎn)品(15 mg/支，批號(hào)：030201),活性維生素D3[1,25(OH)2VD3，批號(hào)：#074M4028V]購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PU.1小鼠抗大鼠抗體 (C- 3)(sc- 390405)購(gòu)自Santa公司，IL- 9抗體(ab203386)購(gòu)自Abcam公司，小鼠超敏二步法檢測(cè)試劑盒，兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自北京中杉金橋公司，外周血RNA提取試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa 生物技術(shù)公司(No9112/9113)，肺組織RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)公司，實(shí)時(shí)Real- time- PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司，大鼠 IL- 9 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工(C506549)，羥脯氨酸(HYP)測(cè)定試劑盒(堿水解法)購(gòu)自南京建成生物工程研究所(A030- 2)。引物和大鼠GAPDH內(nèi)參引物(B661204- 0001,10 μmol/L,100 μl)由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組 90只大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組(生理鹽水+生理鹽水)、模型組(博來(lái)霉素+丙二醇)、治療組(博來(lái)霉素+活性VD3)。4%水合氯醛(10 μl/g)腹腔注射麻醉后，氣管滴注博來(lái)霉素5 mg/kg。對(duì)照組相同手術(shù)后氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水。造模后自第2天起,治療組每?jī)商旄骨蛔⑸溆帽枷♂尩幕钚訴D3(2 μg/kg)給予治療，模型組腹腔注射等體積的丙二醇，對(duì)照組腹腔注射等體積的生理鹽水。各組術(shù)后第 14、21、28天各處死10只大鼠。處死前心臟穿刺取血2 ml，1 ml置于EDTA- K2抗凝管中，以供提取RNA；另1 ml置于促凝管中，分離血清。取右肺下葉用4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)染色和病理染色；左肺下葉提取RNA，其余肺組織液氮速凍用于羥脯氨酸含量測(cè)定。

1.2.2 病理檢測(cè) HE染色法觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠肺部病理變化，Masson染色法觀察膠原纖維的差異。

1.2.3 HYP測(cè)定 將肺組織在液氮中搗成粉末，按100 mg粉末加入1 ml生理鹽水的比例制備組織勻漿，按照 HYP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，堿水解法及分光光度計(jì)法檢測(cè)肺組織HYP含量。

1.2.4 血清中IL- 9水平的檢測(cè) 心臟穿刺取血1 ml 置于促凝管中，自然凝固后4 000 r/min離心5 min，取血清，-20℃貯存，待測(cè)。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.5 Real- time PCR檢測(cè)血液和肺組織PU.1 mRNA的表達(dá)水平 (1)按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取血液和肺組織總RNA。(2)反轉(zhuǎn)錄：按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，各組取1 μg總RNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?3) 熒光定量PCR：按照FastStart Essential DNA Green Master說(shuō)明配制反應(yīng)混合物，反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s，65℃ 10 s，72℃ 15 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；65℃至95℃，5 s增加0.5℃，制備熔解曲線。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。Spi1引物序列：上游5′- ACCTTCCAGTTCTCGTCCAA- 3′,下游5′- CCGTCTTGCCGTAGTTGC- 3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度124 bp。相對(duì)mRNA水平以2-ΔΔCT方法表示。

1.2.6 肺組織IL- 9、PU.1蛋白的檢測(cè) 石蠟切片脫蠟水化后，0.3%H2O2處理內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，抗原熱修復(fù)，封閉液封閉后，分別滴加IL- 9、PU.1抗體(均按1∶100倍稀釋)。37℃孵化30 min，4℃過(guò)夜。加入生物素二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色著色。在光鏡 10×40 放大倍數(shù)下每點(diǎn)隨機(jī)攝片3張，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng))做半定量分析，以每例所有圖片的平均吸光度值的算術(shù)平均值作為最終平均吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)各組肺組織病理觀察 肺組織切片HE染色結(jié)果：對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組肺泡炎由重至輕，而肺纖維化由輕至重，成纖維細(xì)胞逐漸增多；肺泡腔內(nèi)有巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞滲出，肺泡間隔充血增厚，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。治療組也出現(xiàn)從肺泡炎到纖維化的變化過(guò)程，但較模型組輕(見(jiàn)圖1A1～I(xiàn)1)。

肺組織切片Masson染色結(jié)果：膠原纖維、黏液、軟骨呈藍(lán)色，肌纖維、纖維素呈紅色，胞核黑藍(lán)色。對(duì)照組局部肺泡間隔稍增厚，少量膠原纖維存在于支氣管壁周圍。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組膠原纖維明顯逐漸增多，肺泡結(jié)構(gòu)破壞逐漸加重，肺泡間隔逐漸增厚，肺纖維化程度逐漸加重。治療組與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，肺泡結(jié)構(gòu)破壞稍輕，膠原纖維含量稍降低，纖維化程度稍輕，說(shuō)明活性維生素D3對(duì)肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展有一定的抑制作用(見(jiàn)圖1A2～I(xiàn)2)。

2.2 不同時(shí)間各組肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定 不同時(shí)間點(diǎn)，各組肺組織羥脯氨酸含量檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，且隨建模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高；治療組均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組(P<0.05)。組內(nèi)比較可見(jiàn)，模型組羥脯氨酸含量在第21天和28天均明顯高于第14天(P<0.01)，第28天高于第21天(P<0.05)；治療組在第21天和28天均高于第14天(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3 血清IL- 9的濃度測(cè)定 造模手術(shù)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組和治療組血清IL- 9的水平均逐漸增高，且均高于對(duì)照組，而對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有明顯變化；治療組在第14天、21天時(shí)血清IL- 9的水平均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組(P<0.05)，而第28天時(shí)治療組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組內(nèi)比較可見(jiàn)，模型組和治療組IL- 9含量第21天明顯高于第14天(P<0.05)，第28天高于第21天(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

圖1 肺組織切片HE和Masson染色結(jié)果(×200)Fig.1 HE and Masson staining results of lung tissues slices(×200)Note: A1，B1，C1/D1，E1，F(xiàn)1/G1，H1，I1.HE staining results in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day;A2，B2，C2/D2，E2，F(xiàn)2/G2，H2，I2.Masson staining results in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day.

Groups 14d21d28dControl481±102452±127475±129 Model832±1371)1025±741)5)1182±751)5)7)Treatment650±702)3) 820±1281)3)6)858±851)4)5)

Note：Compared with control,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model,3)P<0.01,4)P<0.05;compared with 14 d,5)P<0.01,6)P<0.05;compared with 21 d,7)P<0.05.

GroupsLungtissue14d21d28dBlood14d21d28dControl1.046±0.3511.073±0.0471.167±0.2121.068±0.0341.060±0.0421.053±0.028Model1.725±0.1531)2.744±0.1591)5)2.840±0.2561)1.614±0.0591)2.799±0.1022)6)2.827±0.1461)Treatment1.477±0.0622)4)2.142±0.4001)4)6)2.402±0.0661)3)1.410±0.0201)3)2.325±0.0891)4)5)2.372±0.3651)

Note：Compared with control,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model,3)P<0.01,4)P<0.05;compared with 14 d,5)P<0.01,6)P<0.05.

GroupsIL-914d21d28dPU.114d21d28dControl0.634±0.0450.614±0.0450.632±0.0680.649±0.0270.665±0.0460.640±0.108Model0.758±0.0371)0.879±0.0551)5)0.898±0.0591)0.840±0.0091)1.017±0.0941)5)1.200±0.1881)Treatmant0.703±0.0032)4)0.813±0.0411)4)5)0.851±0.0191)0.809±0.0211)4)0.853±0.0321)3)5)0.896±0.1261)

Note：Compared with control,1)P<0.01,2)P<0.05;compared with model,3)P<0.01,4)P<0.05;compared with 14 d,5)P<0.01.

圖2 各組血清中IL- 9的濃度Fig.2 Concentration of IL- 9 in serum in each group±s)Note: Compared with control,*.P<0.01,#.P<0.05;compared with model,△.P<0.01;compared with 14 d,▽.P<0.05;compared with 21 d,☆.P<0.05.

2.4 肺組織和血液中PU.1 mRNA水平檢測(cè) 不同時(shí)間點(diǎn)，肺組織和血液PU.1 mRNA水平檢測(cè)顯示，模型組和治療組均明顯高于對(duì)照組，且隨建模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高；治療組第14天和21天均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組；第28天時(shí)治療組PU.1 mRNA含量只有肺組織中明顯低于模型組(P<0.01)，血液中治療組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組內(nèi)比較可見(jiàn)，第21天時(shí)模型組和治療組肺組織及血液PU.1 mRNA水平均明顯高于第14天，而第28天與第21天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

圖3 免疫組織化學(xué)DAB染色顯示IL- 9和PU.1在肺組織中的表達(dá)(×400)Fig.3 IL- 9 and PU.1 expression by DAB immunoh- istochemical staining in lung tissues(×400)Note: A1，B1，C1/D1，E1，F(xiàn)1/G1，H1，I1.IL- 9 expression in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day;A2，B2，C2/D2，E2，F(xiàn)2/G2，H2，I2.PU.1 expression in control/model/treatment group on the 14th,21st and 28th day.

2.5 肺組織IL- 9和PU.1免疫組化檢測(cè)結(jié)果 肺組織IL- 9和PU.1蛋白主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核內(nèi)(見(jiàn)圖3)。經(jīng)圖像分析量化后，在第14、21和28天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組和治療組肺組織IL- 9和PU.1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高；在第14天和21天，治療組中兩種因子的蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組中的表達(dá)，而第28天時(shí)治療組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組內(nèi)比較可見(jiàn)，第21天時(shí)模型組和治療組肺組織IL- 9和PU.1的蛋白表達(dá)水平明顯高于第14天，而第28天與第21天比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。Spearman相關(guān)分析表明，肺組織中IL- 9蛋白質(zhì)表達(dá)與PU.1 蛋白表達(dá)量之間表現(xiàn)為正相關(guān)(r=0.846,P<0.01)。

3 討論

Moeller等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠氣管內(nèi)滴入博來(lái)霉素以后，首先發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，持續(xù)8 d左右，自第9天發(fā)生纖維化改變一直持續(xù)到第28～35天。與本研究動(dòng)物模型病變發(fā)生情況相一致。本研究通過(guò)HE染色病理結(jié)果和Masson染色結(jié)果表明，與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，治療組肺泡結(jié)構(gòu)破壞較輕，膠原纖維含量明顯降低，纖維化程度較低。羥脯氨酸含量檢測(cè)是判斷肺纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)。在各時(shí)間點(diǎn)，模型組肺組織羥脯氨酸含量均明顯高于對(duì)照組，且隨建模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高，說(shuō)明模型組羥脯氨酸含量呈逐漸上升趨勢(shì)，反映了大鼠肺纖維化的程度隨時(shí)間推移而加重。這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的肺纖維化模型相一致[10]。而且治療組羥脯氨酸含量均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組。以上研究結(jié)果同時(shí)提示活性VD3對(duì)大鼠肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展有一定抑制作用。

IL- 9是一種T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，研究證實(shí)Th2、Th9 和 Th17等T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等均可產(chǎn)生 IL- 9[11]。Jiang等[12]研究發(fā)現(xiàn)IL- 9在結(jié)締組織病伴間質(zhì)性肺疾病(CTD- ILD)中的異常表達(dá)與肺纖維化的嚴(yán)重程度有關(guān)，且血清中IL- 9的水平明顯高于健康對(duì)照組[12]。Evans[13]研究哮喘患者發(fā)現(xiàn)IL- 9過(guò)度表達(dá)損傷肺功能[13]。Steenwinckel等[14]研究發(fā)現(xiàn)肺部損傷的機(jī)制可能與高表達(dá)的IL- 9增加了氣道上皮細(xì)胞黏液的分泌有關(guān)，而氣道上皮細(xì)胞與氣道的高反應(yīng)性有關(guān)[14]。在鏈格孢屬慢性滴注模型中，IL- 9能夠加劇氣道纖維化，但對(duì)纖維化的發(fā)展可能是可有可無(wú)的[15,16]。van den Brle[4]利用慢性暴露在互隔交鏈孢霉提取物的方法制作了Tg5(IL- 9過(guò)表達(dá)小鼠)哮喘模型,發(fā)現(xiàn)IL- 9有促進(jìn)氣道纖維化的作用。綜合以上研究結(jié)果我們推測(cè)，在肺纖維化的過(guò)程中IL- 9很可能起了促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)中大鼠血清IL- 9的濃度測(cè)定結(jié)果和IL- 9肺組織免疫組化結(jié)果同時(shí)顯示，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組IL- 9蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，且隨建模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高。此測(cè)定結(jié)果支持IL- 9的促纖維化作用，與上述諸多研究結(jié)果相符。最近研究發(fā)現(xiàn)活性VD3對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化有抑制作用[1,2]。本研究結(jié)果顯示，治療組IL- 9的水平在第14、21天均明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組且呈逐漸增高趨勢(shì)，第28天雖然也低于第21天但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明活性VD3治療后IL- 9水平在肺纖維化發(fā)生的早期階段明顯降低了，提示活性VD3在纖維化發(fā)生的早期階段(即第14天和21天)可能通過(guò)抑制IL- 9的表達(dá)發(fā)揮一定的抗纖維化作用；但是在后期階段(即第28天)此抑制作用減弱或消失，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

二氧化硅誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，過(guò)表達(dá)的IL- 9有抗肺泡纖維化的作用，并且IL- 9減輕的肺纖維化與B淋巴細(xì)胞群落的擴(kuò)增有關(guān)[5,17]。在Tg5(IL- 9過(guò)表達(dá)小鼠)氣道重塑模型中IL- 9的促纖維化作用可能與嗜酸性粒細(xì)胞有關(guān)[4]?？梢?jiàn)，在不同的肺纖維化模型中IL- 9發(fā)揮完全不同的功能，可能是因?yàn)樵诜尾慷ㄎ坏牟煌蛐?yīng)細(xì)胞的變化。

最近研究發(fā)現(xiàn)ETS基因家族中的PU.1是促進(jìn)Th9細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分化的重要因素[6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PU.1有110多個(gè)直接靶基因[18]。PU.1的表達(dá)具有明顯的組織特異性，表達(dá)水平的不同決定著多種免疫細(xì)胞的分化[19]。二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)展主要位于炎性肺泡中的巨噬細(xì)胞[5]。顧兆偉等[20]研究過(guò)敏性鼻炎小鼠模型發(fā)現(xiàn)，小鼠鼻黏膜組織中IL- 9 mRNA表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。本研究免疫組化檢測(cè)顯示，PU.1蛋白主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核內(nèi)，與以上諸多研究結(jié)果相符，與IL- 9的表達(dá)細(xì)胞種類相一致。相關(guān)性分析表明兩者又呈正相關(guān)，提示在大鼠肺纖維化發(fā)生過(guò)程中，它們之間可能存在某種聯(lián)系，也為以上理論提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

PU.1 是Th9分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th9細(xì)胞中PU.1直接與IL- 9基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)IL- 9的分泌，如果上調(diào)PU.1的表達(dá)，IL- 9的分泌也明顯增加；PU.1缺陷的小鼠IL- 9的表達(dá)極少[11]。PU.1綁定在IL- 9 基因位點(diǎn)上，通過(guò)促進(jìn)IL- 9基因組蛋白乙酰化而促進(jìn)Th9細(xì)胞的表達(dá)[21]。同時(shí)PU.1也是抑制Th2細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，PU.1通過(guò)限制GATA- 3和IRF4的功能影響Th2分化，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促使Th2向Th9細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]。鮑文華等[7]研究發(fā)現(xiàn)隨著炎癥、纖維化進(jìn)程的發(fā)展，肺纖維化組各時(shí)間點(diǎn)肺泡灌洗液中PU.1 mRNA含量明顯高于對(duì)照組[8]。本研究結(jié)果顯示，在纖維發(fā)生過(guò)程中，模型組和治療組PU.1無(wú)論從轉(zhuǎn)錄水平還是從蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均逐漸增高且其明顯高于對(duì)照組，與以上研究結(jié)果一致，提示PU.1可能在肺纖維化發(fā)生過(guò)程中起了促纖維化作用。肺組織免疫組化結(jié)果顯示PU.1和IL- 9呈正相關(guān)且表達(dá)細(xì)胞類型一致，進(jìn)一步提示高表達(dá)的PU.1可能通過(guò)促進(jìn)IL- 9的分泌進(jìn)而起到促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。本研究發(fā)現(xiàn)第14天和21天時(shí)治療組PU.1水平明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而第28天時(shí)治療組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示經(jīng)活性維生素D3治療后，在肺纖維化發(fā)生的早期階段(即第14天和21天)PU.1的促纖維化作用被強(qiáng)烈抑制；而到后期(即第28天)此抑制作用減弱或消失，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，活性維生素D3在大鼠肺纖維化發(fā)生發(fā)展的早期階段具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)降低PU.1的表達(dá)水平，進(jìn)一步減少IL- 9的分泌，從而對(duì)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮抑制作用，因此活性維生素D3有望成為肺纖維化的一種輔助治療藥物。

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[收稿2016- 11- 29 修回2017- 01- 19]

(編輯 倪 鵬)

Impact of 1,25(OH)2VD3on expression levels of IL- 9 and PU.1 in rats with pulmonary fibrosis

ZHENG Jing,LIU Nai- Guo,NI Na,DONG Hong- Liang,WANG Nan,CHENG Miao- Qing.

Department of Clinical Medicine Laboratory,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603,China

Objective:To explore the function of IL- 9 and PU.1 on genesis and development of pulmonary fibrosis,and the effect of active vitamin D3[1,25(OH)2VD3] on the expression levels of this two factors during the pathogenesis of fibrosis.Methods: 90 male SD rats were randomly divided into model group,treatment group,control group (n=30).Bleomycin(5 mg/kg) was injected into the trachea of rats to establish the model of pulmonary fibrosis in the model group and treatment group,while the control group was injected with isopyknic sterile saline.The treatment group,the model group and the control group were injected intraperitoneally with active vitamin D3,solvent of vitamin D3(propylene glycol) and sterile saline on the 2nd day after surgery respectively.All injections were carried out once every other day.10 rats were euthanized at 14th,21st and 28th day in each group in turn.After obtaining lung tissues from experimental rats,the pathological change of lung was compared by hematoxylin- eosin staining.The difference of collagen fiber and hydroxyproline content were compared by the Masson staining and basic- hydrolysis method respectively.The mRNA and protein expression of IL- 9 and PU.1 in lung tissue were detected by Real- time PCR and immunohistochemical technology respectively.The expression of IL- 9 in serum was detected by ELISA.Results: Fibrosis appeared in lungs of experimental rats treated with bleomycin after 14 days,and more and more aggravated with time.At three time points,the hydroxyproline content in model group and treatment group were significantly higher than that of control group,and the treatment group was significantly lower than the model group.At three time points,the expression of IL- 9 and PU.1 in model group and treatment group were risen gradually,and obviously higher than that in control group.On the 14th and 21st day,the expression of two factors in treatment group was significantly lower than model group;on the 28th day,there was no statistically significant difference between treatment group and model group(P>0.05).In model group and treatment group,the expression of two factors on 21st day was significantly higher than that on 14th day;there was no statistically significant difference between the 28th day and the 21st day.Conclusion: IL- 9 and PU.1 may play a profibrotic role at early stage of pulmonary fibrosis induced by bleomycin.The active vitamin D3may lower the expression level of PU.1,and then reduce the secretion of IL- 9，thus may play an inhibiting effect on genesis and development of pulmonary fibrosis in rats.

Pulmonary fibrosis;Active vitamin D3;IL- 9;PU.1

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.003

①本文受山東省自然科學(xué)基金(ZR2011HM062)和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015WS0490)資助。

鄭 靜(1981年-)，女，碩士，主管技師，主要從事分子免疫學(xué)方面的研究，E- mail：zhengjing2003@126.com。

及指導(dǎo)教師：劉乃國(guó)(1966年-)，男，博士，教授，主要從事分子免疫和細(xì)胞免疫學(xué)方面的研究，E- mail：liunaiguo1966@163.com。

R392.11

A

1000- 484X(2017)08- 1135- 06