閆會晶，劉劍剛，董瑞紅，張大武，王承龍

·基礎(chǔ)醫(yī)學論著/研究·

益氣活血中藥對急性心肌梗死后大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)蛋白的影響

閆會晶，劉劍剛，董瑞紅，張大武，王承龍

目的 觀察益氣活血中藥西洋參莖葉總皂苷(PQS)和精制血府膠囊配伍對急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌AMPK活化的線粒體生物合成相關(guān)蛋白的影響。方法 SD雄性大鼠60只，高脂飼料喂養(yǎng)28 d，4%水合氯醛麻醉后，結(jié)扎冠狀動脈前降支造成AMI模型，成活大鼠共26只，隨機分為模型組和益氣活血組，每組13只；并設(shè)假手術(shù)組(只穿刺，不結(jié)扎)13只。術(shù)后2 d開始灌胃藥物，益氣活血藥液中包含了PQS和精制血府浸漬膏，藥物灌胃劑量為PQS 162 mg/ (kg·d)，精制血府3.6 mg/ (kg·d)，模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃等量的蒸餾水。灌胃28 d后，將大鼠麻醉，行超聲心動圖檢測，測定大鼠左室收縮末內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末內(nèi)徑(LVDd)、射血分數(shù)(EF)。完成后，打開大鼠胸腔，取出心臟，進行心肌病理組織學檢測及心肌組織內(nèi)AMP激活蛋白激酶ɑ2(AMPKɑ2)、過氧化物酶體增生物激活的受體γ共激活因子1ɑ(PGC1ɑ)基因和蛋白的測定。結(jié)果 心臟超聲結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVDs、LVDd值顯著增大(P<0.05)，EF值顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，益氣活血組大鼠LVDs、LVDd值均降低(P<0.05)，EF值升高(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)相比，模型組大鼠心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ基因表達下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，益氣活血組心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ基因上調(diào)(P<0.05)。Western結(jié)果：與假手術(shù)相比，模型組大鼠心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，益氣活血藥物組心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 益氣活血中藥可改善AMI后左室功能，抑制AMI后左室重構(gòu)，該作用可能與促進線粒體生物合成蛋白(AMPKɑ2、PGC1ɑ)的表達有關(guān)。

急性心肌梗死；益氣活血；模型大鼠；AMP激活的蛋白激酶；過氧化物酶體增生物激活的受體γ共激活因子1ɑ

急性心肌梗死(AMI)后，梗死血管所供應(yīng)的心肌組織因缺血、缺氧而凋亡、壞死，心肌缺血壞死后，局部心肌組織變薄，功能降低甚至喪失，非壞死部位心肌代償性肥厚，稱為心室重構(gòu)，這與心力衰竭和死亡密切相關(guān)。減少心肌壞死，抑制梗死后心室重構(gòu)和改善梗死后左室功能已成為目前AMI后內(nèi)科藥物治療的目標。線粒體是能量代謝的重要場所，線粒體數(shù)量的增加可從長遠意義上促進有氧氧化產(chǎn)能。

心悅膠囊主要成分為西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolius Saponin，PQS)，是從西洋參莖葉中提取出的有效成分，前期實驗研究表明，PQS通過維持缺血再灌注期線粒體膜電位的穩(wěn)定性，抑制心肌線粒體凋亡通路，抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，降低缺血再灌注引起的心肌損傷[1-2]，抑制AMI后大鼠心室重構(gòu)，減輕原代心肌細胞培養(yǎng)過程中毒胡蘿卜素誘導的心肌細胞凋亡[3-4]。

精制血府膠囊又稱氣血并治方，其主要成分為柴胡、赤芍、川芎、枳殼，由經(jīng)典的中藥方劑血府逐瘀湯加減化裁而來。臨床研究顯示，精制血府膠囊具有輕度消減斑塊、調(diào)節(jié)脂代謝、抗血小板聚集及干預炎癥反應(yīng)的作用，并且研究過程中未見明顯安全性問題[5-8]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Spraque-Dawley(SD)大鼠60只，雄性，清潔級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2009-0007，體重140 g～160 g，清潔級動物室喂養(yǎng)，動物室內(nèi)濕度50%～70%，溫度(23～25)℃，大鼠食飲自由，光照、黑暗各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料一周后，給以高脂飼料喂養(yǎng)(4%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，10%豬油和維生素D31.25×10 U/kg，85.3%基礎(chǔ)飼料)，喂養(yǎng)高脂飼料28 d后開始造模。

1.2 實驗器材 H-600型電子纖維鏡，日本日立公司。OLYMPUS型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；SIEMENS ACUSON Sequoia型超聲診斷儀，15L8W型高頻線陣探頭，西門子公司；QL-902型斡旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；Centrifuge 5415D型離心機，Eppendorf公司；NANODROP 2000型分光光度計，Therno scientific公司；ABI7500型熒光定量PCR儀，Applied Biosystems公司；Fresco低溫冷凍離心機，Thermo公司；MultiSkan3酶標儀，Thermo公司；Mini P-4電泳槽，Cavoy公司；濕轉(zhuǎn)電泳槽，Cavoy公司；電泳儀，Bio-Rad公司；水平脫色搖床，其林貝爾公司；酸度計 pH211，Hanna公司；電動組織勻漿器，F(xiàn)luka。

1.3 藥物與試劑 心悅膠囊主要成分為西洋參莖葉總皂苷0.3 g(相當于西洋參莖葉總皂苷50 mg)，批號：100606，國藥準字：Z20030073，由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，按162 mg/(kg·d)灌胃。精制血府膠囊為柴胡、川芎、赤芍、枳殼全方水提取物，為浸膏制劑，4.94 g生藥/kg，提取率為52.78%，由中國科學院大連化學物理研究所提供，按3.6 mg/ (kg·d)灌胃。TRNzol總RNA提取試劑，貨號：DP405-02，天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，貨號：RR047B，TaKaRa(寶生物)；SYBRPremix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)，ROX plus，貨號：RR82LR，TaKaRa(寶生物)；DL2，000 DNA Marker，貨號：3427Q，TaKaRa(寶生物)；Rabbit AMPKɑ2，貨號：ab3760，abcam公司；Rabbit PGC1ɑ，貨號：ab54481，abcam公司。

1.4 大鼠急性心肌梗死模型建立 即將用于造模的大鼠禁食12 h，稱重，用4%的水合氯醛(注射量按0.9 mL/100 g體重計算)腹腔注射，用剪刀豎直剪開左側(cè)胸部皮膚，鈍性分離胸骨左側(cè)第3～4肋間肌肉組織，左手中指以巧力擠壓右胸，快速擠出心臟，找到左心耳，并將左心耳翻開，距肺動脈圓錐與左心耳分支起點處(1～2) mm用0號絲線結(jié)扎前降支，迅速將心臟放回胸腔，盡量擠出胸腔內(nèi)的氣體，縫合皮膚前，在縫合部位撒上適量的青霉素粉末，預防術(shù)后感染，若有出血者，撒入適量的云南白藥粉末止血，縫合皮膚。假手術(shù)組操作同上，但只穿刺不結(jié)扎。術(shù)后第二天開始，手術(shù)后的大鼠給予青霉素4×104U/d，腹腔注射，連續(xù)3 d，預防術(shù)后感染。

1.5 動物分組及用藥 共制作AMI模型大鼠26只，隨機分為兩組，模型組和益氣活血組，各13只。并設(shè)假手術(shù)組13只。用蒸餾水配制干預藥物，益氣活血藥液中包含了PQS和精制血府浸漬膏，從術(shù)后第2天開始給藥，灌胃劑量為PQS 162 mg/(kg·d)，精制血府3.6 mg/(kg·d)，模型組和假手術(shù)組分別給予等量的蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能 灌胃4周后，大鼠禁食12 h，稱重，將麻醉后的大鼠固定在手術(shù)臺上，用8%硫化鈉溶液脫去大鼠左側(cè)胸部毛發(fā)，將高頻線陣探頭置于左側(cè)胸前部心臟搏動區(qū)，在觀察到滿意的左心室二維圖像后，獲取左室收縮末內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末內(nèi)徑(LVDd)和射血分數(shù)(EF)。

1.6.2 心肌病理學觀察 從各組取3只心臟，置于10%甲醛溶液內(nèi)保存24 h，梯度濃度乙醇脫水，用二甲苯透明處理，隨后石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度5 μm，將切片置于多聚氯氨酸處理過的防脫載玻片上，根據(jù)試劑盒說明，脫蠟脫水后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，梯度乙醇脫水，透明處理，中性樹膠封固，用以光鏡觀察。

同時在每組大鼠左心室同一部位(心尖右側(cè))取大小1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，每組取1塊，于2.5% 戊二醛溶液內(nèi)固定，置于4℃冰箱保存24 h后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，餓酸固定2 h后，再次用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，隨后用5種濃度的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，經(jīng)干燥和離子噴涂后，置于電子顯微鏡下觀察。

1.6.3 RT-PCR分析 將大鼠心臟冠脈結(jié)扎部位以上組織去除，另剪去右心室，保留左心室，錫紙包裹，液氮快速冷存，將液氮冷凍后的心室組織置于-70 ℃冰箱中保存，每組分別取5只，用TRNzol總RNA提取試劑提取樣本RNA，用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度；采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉(zhuǎn)錄；用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，定量各心肌組織內(nèi)AMPKɑ2和PGC1ɑ的基因表達。引物設(shè)計見表1。

表1 引物設(shè)計

1.6.4 Westren blotting分析 提取心肌總蛋白，BCA法定量蛋白后，調(diào)整蛋白濃度，使蛋白終濃度為4 mg/mL，根據(jù)目的蛋白分子量配制分離膠和濃縮膠，上樣，電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，其中，一抗AMPKɑ2和PGC1ɑ稀釋比例均為1∶1 500，ECL加到膜上反應(yīng)3～5 min，膠片曝光：10 s至5 min(曝光時間隨不同光強度而調(diào)整)，顯影2 min，定影。

2 結(jié) 果

2.1 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心臟超聲的影響 心臟超聲結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVDs、LVDd值顯著增大(P<0.05)，EF值顯著下降(P<0.05)，說明AMI模型大鼠制作成功；與模型組相比，益氣活血組大鼠LVDs、LVDd值均降低(P<0.05)，EF值升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心臟超聲的影響(±s)

2.2 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心肌組織病理學的影響 光學顯微鏡觀察心肌病理組織：與假手術(shù)組相比，模型組心肌細胞排列紊亂，細胞間質(zhì)充血水腫；與模型組相比，益氣活血組心肌細胞排列整齊，細胞間質(zhì)未見明顯水腫。詳見圖1。

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為益氣活血組。

圖1 光學顯微鏡觀察心肌病理組織

電子顯微鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)，與假手術(shù)組相比，模型組心肌細胞內(nèi)肌原纖維排列紊亂，大量線粒體結(jié)構(gòu)被破壞。與模型組相比，益氣活血組心肌細胞內(nèi)膠原纖維排列整齊，線粒體數(shù)量多，結(jié)構(gòu)完整。詳見圖2。

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為益氣活血組。

圖2 電子顯微鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)結(jié)果

2.3 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)基因的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ基因表達下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，益氣活血組大鼠心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ基因上調(diào)(P<0.05)。詳見表3。

表3 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)基因的影響(±s)

2.4 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)蛋白的影響 Western結(jié)果：與假手術(shù)相比，模型組大鼠心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，益氣活血藥物組心肌組織內(nèi)AMPKɑ2、PGC1ɑ蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。詳見表4。

表4 益氣活血中藥配伍對AMI大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)蛋白的影響(±s)

3 討 論

急性心肌梗死后，很有可能發(fā)生梗死部位的擴展和左室的重構(gòu)，主要表現(xiàn)為梗死部位的變薄和擴張，梗死區(qū)和非梗死區(qū)左室形態(tài)和功能的變化，這與心力衰竭和死亡密切相關(guān)。根據(jù)文獻報道，左室重構(gòu)的表現(xiàn)較正常LVDd增加10%以上者即為左室重構(gòu)[9]。在本實驗中，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVDd是假手術(shù)組的1.86倍(P<0.05)，顯示模型組大鼠表現(xiàn)出典型的左室重構(gòu)，益氣活血藥物干預后，大鼠LVDd值較模型組下降了39.8%(P<0.05)，益氣活血中藥可顯著抑制AMI后左室重構(gòu)。EF代表了左室收縮功能，是評估心功能的重要指標，本實驗顯示，益氣活血中藥可顯著改善AMI后心功能。

AMPK是一個含有ɑ、β和γ亞基的異三聚體復合物，是真核細胞內(nèi)重要的能量感知器。中重度的代謝壓力，一些藥物(如二甲雙胍[10]、苯乙雙胍[11]等)，以及細胞內(nèi)活性氧的增多(reactive oxygen species，ROS)都能激活AMPK[12]。激活后的AMPK可通過多種途徑提高細胞內(nèi)能量水平，如抑制蛋白、脂肪等的合成，促進碳氫化合物分解產(chǎn)生ATP[13-14]。有研究顯示，在心肌缺血時，AMPK可保護缺血心肌細胞，減少心肌細胞損傷[15]。但當細胞內(nèi)活性氧持續(xù)增多時，又可通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制AMPK活性[16]。

AMPK可通過提高細胞內(nèi)能量水平來緩解各種代謝壓力對機體的損害；短暫的活性氧濃度升高，以及一些藥物等可促進AMPK的激活從而促進細胞內(nèi)能量代謝；長期的活性氧積累可抑制AMPK活性。本實驗研究顯示，AMI后，當未給予任何藥物干預時，由于細胞內(nèi)過氧化物持續(xù)積累，使得細胞內(nèi)AMPK基因和蛋白表達顯著下調(diào)，益氣活血中藥干預后，心肌細胞內(nèi)AMPK基因和蛋白的表達量較模型組明顯上調(diào)，表明益氣活血中藥可促進AMI后心肌細胞內(nèi)AMPK的表達。

AMPK還有一個重要的作用，即促進線粒體生物合成，這與AMPK調(diào)節(jié)PGC1ɑ的表達有關(guān)[17]，AMPK的這一作用，可從長遠意義上促進葡萄糖和脂肪酸氧化分解產(chǎn)能。PGC1ɑ是線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在生理條件下，其對于各種環(huán)境變化非常敏感，溫度、能量狀態(tài)和各種生理活動均可引起其表達量的改變，它對于維持糖、脂代謝和能量平衡起著重要的作用，并且參與某些病變的發(fā)生和發(fā)展。心臟對能量的需求極高，正常心肌組織內(nèi)表達著大量的PGC1ɑ。有研究顯示，心臟病變，如心力衰竭時，心肌細胞內(nèi)能量代謝的降低主要表現(xiàn)為心肌細胞內(nèi)底物有氧氧化降低，而這種變化與心肌細胞內(nèi)PGC1ɑ表達明顯降低有關(guān)[18]。

在生理條件下，機體能量需求增多時，PGC1ɑ表達上調(diào)，促進線粒體生物合成、有氧氧化產(chǎn)生ATP；在病理條件下，細胞內(nèi)代謝底物如葡萄糖、脂肪酸的含量明顯不足時，細胞內(nèi)PGC1ɑ表達下調(diào)。本實驗結(jié)果顯示，AMI后，未給予藥物干預時，心肌處于缺血缺氧狀態(tài)，細胞內(nèi)代謝底物明顯不足，使得PGC1ɑ表達量下調(diào)，通過益氣活血藥物干預后，細胞內(nèi)PGC1ɑ表達上調(diào)。 本實驗結(jié)果中，AMI后AMPK、PGC1ɑ的表達均顯著下調(diào)，而益氣活血藥物干預后，心肌組織內(nèi)AMPK、PGC1ɑ的表達顯著上調(diào)。益氣活血中藥對AMI大鼠心臟的保護作用可能與促進AMPK活化的線粒體生物合成有關(guān)。

益氣活血中藥可改善AMI后左室功能，抑制AMI后左室重構(gòu)，該作用可能與促進線粒體生物合成蛋白(AMPKɑ2、PGC1ɑ)的表達有關(guān)。

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(本文編輯王雅潔)

Effect of Strengthing Qi and Activating Blood Chinese Medicine on Myocardial Mitochondrial Biogenesis Related Protein in Rats after Acute Myocardial Infarction

Yan Huijing， Liu Jiangang， Dong Ruihong， Zhang Dawu， Wang Chenglong

Cardiovascular Disease Center， Xiyuan Hospital Affiliated to China Accademy of Chinese Medical Sciences;Heart Institute of China Accademy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China

Corresdonding Author:Wang Chenlong

Objective To observe the effect of strengthing qi and activating blood Chinese medicine Panax quinquefolius saponin (PQS) and refined Xuefu Capsules on AMPK activated- mitochondrial biogenesis protein in rats myocardium after acute myocardial infarction (AMI).Methods Sixty male Sprague-Dawley (SD) rats， fed with high-fat diet for 28 d， after anesthetized with 4% chloral hydrate， 26 of them were made as AMI model successfully by descending artery ligation.And all of AMI model rats were randomly divided into model group， strengthing qi and activating blood Chinese medicine group， for 13 rats in each group.And set 13 rats as sham group (only puncture，without ligation) .The rats of strengthing qi and activating blood Chinese medicine group were gavaged with the strengthing qi and activating blood Chinese medicine， with PQS was given 162 mg/(kg·d)，refined Xuefu capsules was given 3.6 mg/(kg·d) since the next day of surgery.At the same time， the rats of model group and sham group are gavaged with equal amount of distilled water.After 28 d， the rats were anesthetizedto measure left ventricular end-systolic inner diameter(LVDs)， left ventricular end-diastolic diameter(LVDd)， ejection fraction(EF)by Ultrasonic echocardiography.When finished， the chest was opened， and the hearts was removed for histopathology testing and the gene and protein of AMP-activated protein kinase ɑ2 (AMPKɑ2)， Peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator1ɑ (PGC1ɑ) in rats myocardium testing.Results Echocardiography showed that compared with sham group， LVDs and LVDd value in model group significantly increased (P<0.05) and EF values decreased significantly(P<0.05).Compared with the model group， the LVDs and LVDd value in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group reduced obviously (P<0.05) and EF value in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group increased obviously (P<0.05).RT-PCR showed that compared with sham group， AMPKα2 and PGC1α genes of myocardial tissues in model group down-regulated (P<0.05).Compared with the model group， AMPKα2 and PGC1α genes of myocardial tissues in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group up-regulated (P<0.05).Western Blot showed that compared with sham group， protein expression of AMPKα2 and PGC1α of myocardial tissues in model group down-regulated (P<0.05).Compared with the model group， protein expression of AMPKα2 and PGC1α of myocardial tissues in strengthing qi and activating blood Chinese medicine group up-regulated (P<0.05).Conclusion Strengthing qi and activating blood Chinese medicine can inhibit left ventricular remodeling， and improve left ventricular function after AMI.The role of protection may related to the promotion of mitochondrial biogenesis protein (AMPKα2 and PGC1α) expression in myocardium after AMI.

acute myocardial infarction；supplementing qi and activating blood；model rats；AMP-activated protein kinase；peroxisome proliferator-activated receptor-γ co-activator 1α

國家自然科學基金面上項目(No.81273934)

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院心血管病中心/中國中醫(yī)科學院心血管病研究所(北京 100091)

王承龍，E-mail：wcl796@163.com

信息：閆會晶，劉劍剛，董瑞紅，等.益氣活血中藥對急性心肌梗死后大鼠心肌線粒體生物合成相關(guān)蛋白的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(15)：1829-1833.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.005

1672-1349(2017)15-1829-05

2016-06-27)