關(guān) 淼，趙曉彤，曹 東，顧貴波，楊本勇，李樹博，申貫?zāi)校?萍

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150000；2.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心 遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164)

遼寧地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分離株ORF5基因的遺傳變異分析

關(guān) 淼1,2，趙曉彤2，曹 東2，顧貴波2，楊本勇2，李樹博2，申貫?zāi)?，魏 萍1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150000；2.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心 遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110164)

為研究遼寧地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF5基因的生物學(xué)特性及遺傳變異情況，通過RT-PCR方法對PRRSV陽性樣品的ORF5基因進行擴增，應(yīng)用DNA Star軟件對檢測的序列進行比對和遺傳變異分析。結(jié)果顯示，分離的8株P(guān)RRSV的ORF5基因全長為603 bp，均屬北美型，不同分離株間的核苷酸、氨基酸同源性分別為91.5%～99.0%、88.1%～98.5%；遺傳變異分析表明，分離株處于不同的進化分支，但均屬于亞群3，為高致病性PRRSV。以上結(jié)果表明，遼寧地區(qū)主要流行毒株為高致病性PRRSV，在不同地區(qū)有不同的PRRSV毒株同時流行，但具有相同的進化來源。

遼寧地區(qū)； 豬繁殖與呼吸綜合征病毒； ORF5； 遺傳變異

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的高度接觸性傳染病，又稱藍耳病，其臨床表現(xiàn)為高熱、呼吸系統(tǒng)疾病、妊娠母豬的繁殖障礙、新生及斷奶仔豬死亡等[1]。該病自20世紀(jì)80年代在美國被首次報道以后，在世界其他各地區(qū)也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[2]；我國自1996年首次在流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV以后，也在國內(nèi)各省份迅速擴散開來。2006年，我國首次分離到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，其致病力大幅增強[3]，已成為目前我國各豬場的主要流行毒株[4]。PRRS被認為是在世界范圍內(nèi)最具有毀滅性的豬病之一[5]，給各國的養(yǎng)豬業(yè)都造成了不可估量的經(jīng)濟損失。

PRRSV有10個開放性閱讀框(ORFs)[6]，其中ORF5編碼的糖蛋白GP5是該病毒的最主要保護性抗原蛋白，具有較強的抗原性，且變異性最大。因此，通過針對ORF5基因的遺傳變異研究在一定程度上可以反映PRRSV的遺傳多樣性。

我國針對PRRS主要采取強制免疫的方法進行防控，在目前的環(huán)境條件下，該病毒更容易發(fā)生變異和重組，研究表明，現(xiàn)在國內(nèi)的PRRSV經(jīng)歷了快速的演變，可以規(guī)避疫苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答[7]。因此，研究ORF5的遺傳變異對于PRRSV疫苗的研發(fā)具有重要意義。為深入了解PRRSV ORF5的遺傳變異情況，對 2014—2015年遼寧地區(qū)分離的PRRSV毒株ORF5基因進行遺傳變異分析，以了解遼寧地區(qū)PRRSV的遺傳變異規(guī)律，旨在為PRRSV疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)，為遼寧地區(qū)PRRS免疫策略的制定提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試病毒樣品

根據(jù)遼寧省的生態(tài)區(qū)域特點，將供試病毒樣本采集區(qū)域劃分為4個區(qū)域(表1)，在不同區(qū)域范圍內(nèi)采集豬組織樣品，使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行初步檢測，將PRRSV核酸陽性的樣本于-80 ℃低溫保存。

表1 供試病毒樣本采集區(qū)域劃分

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、pMD18-T載體等均購自寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量RT-PCR檢測試劑盒購自達安基因股份有限公司。

1.3 主要儀器

熒光定量PCR儀(7500 Fast)購自美國ABI公司，PCR儀(C1000)購自美國BIO-RAD公司，電泳儀(DYY-6C)購自北京六一儀器廠，高速低溫離心機(Z323K)購自德國HERMLE公司,凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.4 PRRSV ORF5基因擴增及序列測定

參照GenBank中國內(nèi)外已注冊的PRRSV毒株的ORF5基因序列[8-9]，設(shè)計 1對引物，上游引物序列：5′-AGCCTGTCTTTTTGCCATTCT-3′；下游引物序列：5′-CTTTTGTGGAGCCGTGCTATC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。選取Ct值較小的PRRSV核酸陽性樣本，參考RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。參考One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書進行ORF5基因全序列PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體，陽性質(zhì)粒樣本送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.5 PRRSV ORF5基因序列分析

應(yīng)用生物學(xué)分析軟件DNA Star對測定的序列進行拼接和編輯，應(yīng)用MegAlign軟件對測定的核苷酸序列與從GenBank中選取的國內(nèi)外22個ORF5參考序列(其中國外參考序列6個，國內(nèi)參考序列16個)(表2)進行同源性比較，并繪制遺傳進化樹，進行系統(tǒng)多樣性及遺傳變異分析。

表2 PRRSV參考序列

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF5基因的擴增結(jié)果

由圖1可見，在約603 bp的位置出現(xiàn)了擴增條帶，與預(yù)期片段大小相符。并按照供試病毒樣本采集區(qū)域和年份，將供試病毒分別命名為LNeast2014、LNnorth2014、LNsouth2014、LNwest2014、LNeast2015、LNnorth2015、LNsouth2015、LNwest2015。

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1—8：樣品ORF5基因；9：陽性對照；10：陰性對照圖1 ORF5基因擴增結(jié)果

2.2 ORF5基因序列的同源性分析

基因序列測定結(jié)果顯示，測序的8個PRRSV ORF5基因全長為603 bp，編碼200個氨基酸。將測定的ORF5基因核酸序列與國內(nèi)外代表性毒株及近年分離的毒株的ORF5基因核酸序列進行比較分析發(fā)現(xiàn)，本研究測序鑒定的毒株均屬于PRRSV基因2型，即北美株，且屬于HP-PRRSV變異株。ORF5基因序列同源性分析結(jié)果見圖2，本研究分離的8株毒株ORF5基因間同源性為91.5%～99.0%，其中2014年分離株ORF5基因間同源性為91.5%～98.8%；2015年分離株ORF5基因間同源性為96.8%～98.7%。與北美型代表株VR2332和國內(nèi)代表株CH-1a ORF5基因間同源性分別為86.2%～89.1%、91.0%～95.2%；與變異株代表株JXA1、JXwn06和HUN4基因間同源性分別為93.7%～99.5%、94.0%～99.2%、93.9%～99.3%；與疫苗株JXA1 P80和TJM基因同源性分別為93.4%～99.2%、93.2%～98.8%；與2007年和2011年遼寧分離株基因同源性分別為93.4%～98.5%、92.2%～96.2%。同一年份在遼寧不同地區(qū)分離株之間的基因同源性存在差異，表明在同一時期不同地區(qū)有不同的PRRSV毒株同時流行。

2.3 ORF5基因序列的遺傳變異分析

從圖3可以看出，2014—2015年遼寧分離株屬于同一亞群，具有較近的親緣關(guān)系。LNnorth2014、LNeast2014、LNsouth2014、LNsouth2015、LNnorth2015、LNwest2015分離株與JXA1 P80處于同一分支，LNeast2015分離株與TJM處于同一分支，說明遼寧不同地區(qū)分離株雖然有相同的進化來源，但是在外界環(huán)境壓力、本身基因特性以及長期的遺傳演化過程中發(fā)生了不同程度的基因變異。2014年、2015年P(guān)RRSV遼寧分離株與2007年及2011年的遼寧分離株雖然屬于同一亞群，但是處于不同的分支，也說明了遼寧地區(qū)PRRSV已經(jīng)發(fā)生了基因變異。

圖2 ORF5基因全序列同源性分析

2.4 ORF5氨基酸序列分析

將ORF5基因測定序列推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中收錄的22株國內(nèi)外PRRSV ORF5基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列進行比較分析，本研究分離的8株毒株ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列間同源性為88.1%～98.5%，其中2014年分離株ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列間同源性為88.1%～97.5%；2015年分離株ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列間同源性為94.0%～97.5%。與北美型代表株VR2332和國內(nèi)代表株CH-1a ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列間同源性分別為84.1%～88.1%、89.1%～92.5%；與變異株代表株JXA1、JXwn06和HUN4基因推導(dǎo)的氨基酸序列間同源性分別為92.0%～99.0%、92.5%～98.5%、92.5%～98.5%；與疫苗株JXA1 P80和TJM基因推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為91.0%～99.0%、90.5%～97.0%；與2007年和2011年遼寧分離株基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為92.0%～98.0%、90.0%～93.5%(圖4)。

圖3 基于ORF5基因全序列的遺傳進化樹

圖4 ORF5基因全序列推導(dǎo)的氨基酸同源性分析

3 結(jié)論與討論

根據(jù)病毒抗原性的差異，PRRSV可以分為2個血清型，基因1型和基因2型，即歐洲型和北美型，基因2型主要在北美和亞洲流行[10-11]，在我國的主要流行毒株為北美型。近些年，我國也有歐洲型流行的報道，Zhou等[12]在2011年進行的PRRSV患病率調(diào)查中分離到歐洲型PRRSV，Li等[13]于2012年在我國北部地區(qū)分離到歐洲型PRRSV。在韓國、泰國等其他亞洲國家也有北美型、歐洲型2種毒株同時流行的報道[14-16]。PRRSV有10個開放性閱讀框(ORFs)，包括ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF7，其中ORF5基因編碼的病毒糖基化囊膜蛋白GP5是該病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有較強的免疫原性，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[17-18]。同時PRRSV的基因在合成的時候容易出現(xiàn)內(nèi)在性錯誤，在不同的病毒分離株中，可能出現(xiàn)點突變、插入、缺失以及重組等，在其全基因組中以O(shè)RF5和NSP2基因變異性最大[4,19]。有研究發(fā)現(xiàn)，在ORF5編碼的GP5蛋白序列上，特別是在中和表位和N-糖基化位點[13,20-22]，有廣泛的氨基酸位點替換，所以常基于ORF5基因序列構(gòu)建PRRSV的遺傳進化樹，并進行遺傳演化規(guī)律分析[23-29]。

Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，目前中國的PRRSV基因2型毒株可以分為3個不同亞群，基因分析結(jié)果顯示，亞群1以VR2332為代表株，亞群2以MN184A為代表株；大部分中國流行毒株屬于亞群3并有多個分支，這個分支全部由中國流行株組成，其代表毒株為JXwn06和HB-1(sh)2002。

通過遺傳進化樹分析可以看出，本研究測序鑒定的毒株均屬于PRRSV基因2型的亞群3，但位于不同的分支。2014年及2015年遼寧地區(qū)分離株之間沒有明顯的年度特征，也沒有明顯的地域特征，這說明遼寧地區(qū)流行毒株的遺傳進化過程存在交叉關(guān)系，這可能與不同地區(qū)之間的生豬調(diào)運有關(guān)。目前，我國針對PRRSV的主要防控方法為強制免疫，不同時間、不同地區(qū)之間使用的疫苗也有區(qū)別，不同分離株與疫苗株親緣關(guān)系較近可能與疫苗種類多、免疫強度大的情況有關(guān)。通過遺傳演化多樣性分析發(fā)現(xiàn)，LNnorth2014、LNsouth2014分離株ORF5基因與疫苗株JXA1 P80處于同一分支，LNeast2015與TJM處于同一分支，提示可能存在弱毒疫苗株返強或者弱毒株與野毒株之間發(fā)生了基因重組現(xiàn)象。目前，在生豬防控PRRSV過程中，疫苗使用量大、次數(shù)多、種類多，造成了在豬群中弱毒株和野毒株同時存在的現(xiàn)象，增加了弱毒株返強以及病毒之間發(fā)生基因重組的風(fēng)險[30]。

目前，PRRSV仍然廣泛存在于世界各地的豬群中，影響著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成的經(jīng)濟損失不可估量。本研究通過對2014—2015年遼寧地區(qū)PRRSV ORF5基因進行序列比對及遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，在遼寧地區(qū)PRRSV分離株主要為北美型，遼寧地區(qū)PRRSV的遺傳變異具有多樣性和復(fù)雜性。對PRRSV遺傳變異分析有助于了解該病毒在遼寧地區(qū)的流行演化規(guī)律，為PRRS的科學(xué)防控提供了重要的參考依據(jù)。

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Genetic Variation Analysis of ORF5 Gene of PRRSV Isolates in Liaoning Area

GUAN Miao1,2,ZHAO Xiaotong2,CAO Dong2,GU Guibo2,YANG Benyong2,LI Shubo2, SHEN Guannan2,WEI Ping1*

(1.Northeast Agricultural University,Harbin 150000,China; 2.Liaoning Province Veterinary Medicine Institute,Liaoning Center for Provincial Animal Epidemic Disease Control and Prevention,Shenyang 110164,China)

In order to study the biological characteristics and the genetic variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) ORF5 gene in Liaoning area between 2014 and 2015,the full sequence of PRRSV ORF5 gene was amplified by RT-PCR from the PRRSV positive swine,and the sequence alignment and genetic variation analysis were conducted by DNA Star.The results showed that the ORF5 gene of 8 PRRSV strains was 603 bp,which belonged to the American mutant strain.Compared with representative strains,the nucleotide and amino acid homology were 91.5% to 99.0% and 88.1% to 98.5%,respectively.The genetic variation analysis suggested that the isolated strains were in different branches of evolution,but they were located in the subgroup 3.These results indicated that the main epidemic strain in Liaoning area between 2014 and 2015 was the highly pathogenic PRRSV,and various PRRSV strains existed in different regions of Liaoning at the same time,which had the same evolutionary origin.

Liaoning area; PRRSV; ORF5; genetic variation

2017-01-16

遼寧省自然科學(xué)基金指導(dǎo)計劃項目(20170540477)；遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2015202013)

關(guān) 淼(1982-)，男，遼寧鞍山人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病研究與防控工作。 E-mail:yuerjianggm@163.com

*通訊作者：魏 萍(1962-)，男，山東濰坊人，教授，博士，主要從事傳染病與流行病學(xué)研究。 E-mail:weiiping@yahoo.com.cn

S855.3

A

1004-3268(2017)08-0137-06