李曉楠，唐青海,*，李 羽，王 瑾，姚倫廣，闞云超，楊 海

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061；2.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院/生物藥物研究所，湖南 衡陽(yáng) 421008)

1株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

李曉楠1，唐青海1,2*，李 羽1，王 瑾1，姚倫廣1，闞云超1，楊 海2

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473061；2.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院/生物藥物研究所，湖南 衡陽(yáng) 421008)

采集1例疑似感染豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)仔豬的糞便，運(yùn)用RT-PCR方法和血清學(xué)方法對(duì)病料進(jìn)行TGEV檢測(cè)，并應(yīng)用豬睪丸細(xì)胞(ST)進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，分別采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法檢測(cè)病毒在ST細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增分離TGEVS1基因，經(jīng)序列測(cè)定后，采用DNAStar 7.0和Mega 5.0軟件對(duì)TGEV進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，病料接種到ST細(xì)胞培養(yǎng)后，出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TGEV核酸陽(yáng)性；血清學(xué)鑒定TGEV抗原陽(yáng)性。將分離毒株命名為TGEV-NY。感染12 h后，IPMA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，且可從細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢出TGEV核酸。序列測(cè)定分析表明，分離毒株S1基因開放閱讀框(ORF)為2 220 bp，編碼740個(gè)氨基酸。進(jìn)化分析顯示，分離毒株與我國(guó)2006年分離的SC-Y毒株親緣關(guān)系最近，分離毒株屬于基因Ⅰ群。

豬傳染性胃腸炎病毒； 分離培養(yǎng)； 免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色法；S1基因

傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是冠狀病毒科(Coronaviridae)成員，該病毒是引起豬胃腸炎的主要病原體。所有年齡段的豬均能夠被該病毒感染，尤其以哺乳期仔豬易感性最強(qiáng)，發(fā)病率和死亡率最高，哺乳動(dòng)物死亡率可高達(dá)100%[1-2]。TGEV是囊膜病毒，遺傳物質(zhì)為正鏈、單股RNA，基因組的1/3堿基編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，編碼基因按照5′-rep-S-3a-3b-E-M-N-ORF7-3′順序排列。其中，纖突蛋白(S蛋白)、跨膜蛋白(M蛋白)、小包膜蛋白(E蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)為病毒結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白不僅是介導(dǎo)病毒吸附宿主細(xì)胞、入侵機(jī)體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗TGEV中和性抗體的主要抗原蛋白。S蛋白是一種糖基化蛋白，肽鏈全長(zhǎng)約為1 450個(gè)氨基酸，糖基化分子質(zhì)量為128～160 ku，其N端的S1區(qū)有4個(gè)抗原位點(diǎn)，分別為A、B、C和D表位。其中，A表位可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并能夠與機(jī)體的氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒感染[3-5]。因此，S1蛋白也是TGEV基因工程疫苗、診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查分析和遺傳變異研究的主要蛋白[6-10]。本研究從采自南陽(yáng)地區(qū)1份疑似TGEV感染糞樣中分離培養(yǎng)TGEV，并進(jìn)行核酸和血清學(xué)鑒定，研究其體外培養(yǎng)特性和進(jìn)化特征，為進(jìn)一步開展更廣泛的流行病學(xué)調(diào)查、建立新的血清學(xué)診斷方法及開發(fā)新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑

1.2 病料的采集和處理

收集病料(病豬糞便)200 μg左右，置于已滅菌的EP管中，加入1 mL PBS溶液，充分混勻，放于-20 ℃和37 ℃反復(fù)凍融3次，振蕩15 s，3 000 r/min離心2 min，取上清放于-20 ℃冰箱保存。樣品編號(hào)為NY。

1.3 病料的RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)GenBank上公布的TGEV-S核酸序列(TGEV-S收錄號(hào)為EU074218)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，TGEV-S-F:5′-ACTAAGCTTTTAGCTTACATCACATGGCGTTACAG-3′， TGEV-S-R:5′-ACTGGATCCATGAAAAAATTATTTGTGGT-3′，擴(kuò)增片段大小為2 220 bp。取步驟1.2中200 μL上清，應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，取2 μg總RNA，采用PrimeScriptⅡFirst Strand cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，取2 μL合成產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用50 μL PCR反應(yīng)體系，2 μL模板DNA，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，5× Primer Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，Prime STAR GXL DNA聚合酶1 μL，ddH2O 31 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 7 min，4 ℃保存。以吉林五星疫苗毒為陽(yáng)性對(duì)照，以ddH2O為陰性對(duì)照。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 病毒的分離培養(yǎng)

ST細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(青霉素鈉和硫酸鏈霉素各100 μg/mL)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，用PBS洗滌1次，并將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。將1.2中處理上清，經(jīng)0.22 μm濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，接種細(xì)胞(體積比1∶10)。每間隔24 h觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，在CPE達(dá)80%以上時(shí)，凍融3次，收獲病毒，按照上述方法將病毒進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，另設(shè)定正常細(xì)胞為對(duì)照。

1.5 病毒在ST細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)檢測(cè)

日本的立法模式采用的是混淆可能性包含于商標(biāo)近似的判定標(biāo)準(zhǔn)。這種模式的好處是考慮因素比較全面，而且對(duì)商標(biāo)近似的判定將會(huì)更加準(zhǔn)確，因?yàn)槠湟揽可虡?biāo)混淆可能性的判定因素來(lái)確定。日本商標(biāo)法37條提煉了8個(gè)商標(biāo)侵權(quán)的行為要件。因?yàn)槿毡镜呐卸?biāo)準(zhǔn)在前文中也進(jìn)行分析了，主要采用“商標(biāo)近似+商品類似”的方法，后來(lái)又凝練成三要素的判定方法，但是在司法實(shí)踐中日本也并非全是按照這種判定方法進(jìn)行審理商標(biāo)侵權(quán)案件的，在1959年以后，多冊(cè)進(jìn)行修改，也出現(xiàn)很多典型的判例，最后在司法實(shí)踐和理論探討中形成了混淆可能性包含于商標(biāo)近似的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.1 病毒感染上清RT-PCR檢測(cè) 將ST細(xì)胞接種到8個(gè)直徑為35 mm培養(yǎng)皿中，保持密度適當(dāng)，以24 h長(zhǎng)至80%為宜；將分離得到的第3代病毒(F3)接種至ST細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)皿接種劑量為4×103TCID50，留1個(gè)培養(yǎng)皿不接種病毒為對(duì)照。棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入2 mL無(wú)血清的培養(yǎng)基，取10 μL病毒液加入到培養(yǎng)基中，充分搖勻，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別收集單層接毒后4、6、8、12、24、48 h樣品。每個(gè)培養(yǎng)皿取上清200 μL提取RNA，用于RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)方法如1.3所述，以不接毒細(xì)胞為陰性對(duì)照，擴(kuò)增片段大小為718 bp。

1.5.2 免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色法(IPMA)檢測(cè)細(xì)胞中病毒動(dòng)態(tài) IPMA方法參考文獻(xiàn)[11]改進(jìn)后進(jìn)行，每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞用2 mL PBS洗滌3次，真空干燥，加入1.5 mL 4%的多聚甲醛，室溫條件下固定1 h，真空干燥，加入1.5 mL 按1∶20比例稀釋的TGEV S1蛋白多克隆抗體(本實(shí)驗(yàn)室制備)，37 ℃條件下孵育1 h。PBS洗滌3次。加入1.5 mL經(jīng)1∶3 000倍稀釋的HRP-SPA，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，加入1.5 mL AEC底物顯色液，37 ℃孵育15 min。棄掉反應(yīng)液，蒸餾水沖洗2次，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入終止液2 mL。

1.6 TGEV-NYS1基因的克隆及序列分析

將1.3中得到PCR產(chǎn)物采用Axygen公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物按1∶1的比例與Premix ExTaq混合，經(jīng)95 ℃ 5 min、68 ℃ 20 min反應(yīng)后，用Axygen公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物與pET28a載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和序列測(cè)定，將得到的重組載體命名為pET28a-TGEV-S1。將測(cè)序序列與GenBank中公布的TGEV-133(登錄號(hào)JQ693049)等33株(毒株信息見表1)S1全基因序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用Mega 5.0軟件進(jìn)行分析，通過(guò)鄰接法比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析分離毒株的進(jìn)化地位。

表1 TGEV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測(cè)

從圖1可以看出，樣品NY和陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增出了2 220 bp條帶，與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致。這一結(jié)果表明，樣品NY為TGEV核酸陽(yáng)性。

M：Marker 2000；1：樣品NY；2：陽(yáng)性對(duì)照；3：陰性對(duì)照?qǐng)D1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 病毒的分離培養(yǎng)

鑒于病料NY中TGEV核酸陽(yáng)性，將處理過(guò)的病料按同步接毒的方式接種至ST細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，未接種病料的對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)正常，接種病料的細(xì)胞出現(xiàn)典型的TGEV細(xì)胞病變，細(xì)胞變圓、脫落、拉網(wǎng)(圖2)。連續(xù)接種培養(yǎng)3代，均出現(xiàn)出明顯的CPE。將分離培養(yǎng)的病毒命名為TGEV-NY。

圖2 TGEV-NY毒株的細(xì)胞病變情況

2.3 TGEV-NY毒株在ST細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 病毒感染上清RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 從圖3可以看出，TGEV-NY感染12 h后，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中能夠檢出TGEV核酸，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，擴(kuò)增條帶亮度增強(qiáng)。

M:Marker 5000；1—7依次為感染4、6、8、12、24 h后的細(xì)胞上清，48 h后的陰性細(xì)胞上清，感染48 h后的陽(yáng)性細(xì)胞上清；8：陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D3 TGEV感染細(xì)胞上清的核酸RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2 IPMA檢測(cè)細(xì)胞中病毒動(dòng)態(tài) 經(jīng)IPMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染后6 h和8 h，細(xì)胞中可見極少量特異性染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞核周圍呈棕紅色染色；感染12 h后可檢出大量陽(yáng)性細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，染色范圍越來(lái)越大，陽(yáng)性細(xì)胞越來(lái)越多，可觀察到成片感染病毒的細(xì)胞。感染24～48 h后染色效果最佳。未接毒的細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后仍然生長(zhǎng)良好(圖4)。

2.4 TGEV-NYS1基因的克隆及序列分析

用引物TGEV-S-F和TGEV-S-R對(duì)TGEV-NY進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，特異性條帶大小為2 220 bp，與預(yù)期大小相符，表明擴(kuò)增到了TGEV-NY毒株的S1基因。將基因純化回收克隆至pET28a載體并命名為pET28a-TGEV-NY-S1，重組載體經(jīng)Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切，得到相應(yīng)大小的目的條帶，表明重組載體構(gòu)建成功。經(jīng)序列測(cè)定，表明擴(kuò)增基因?yàn)镾1基因，其全長(zhǎng)為2 220 bp,編碼740個(gè)氨基酸。將測(cè)序所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TGEV-NY株與美國(guó)、英國(guó)、韓國(guó)等國(guó)際參考毒株的核苷酸和氨基酸序列的相似性都高于85%。利用Mega 5.0軟件，以鄰接法對(duì)選取的來(lái)自美國(guó)、韓國(guó)、英國(guó)等多個(gè)國(guó)家的33個(gè)參比序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5)。

圖4 IPMA檢測(cè)TGEV-NY在ST中的增殖動(dòng)態(tài)

圖5 TGEV毒株S1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

結(jié)果表明，TGEV的S1基因可以分為2個(gè)群(基因Ⅰ型和基因Ⅱ型)，TGEV-NY分離株與中國(guó)株TGEV SHXB KP202848、美國(guó)株TGEV PUR46-MAD M94101、韓國(guó)株TGEV DAE JQ693050等同屬于基因Ⅰ型，與中國(guó)株TGEV SC-Y DQ443743距離最近。

3 結(jié)論與討論

目前，臨床上用于TGEV核酸診斷最常用的方法有普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR[12-14]。本研究在臨床發(fā)現(xiàn)1例以嘔吐、水樣腹瀉和脫水為特征的病例，疑似文獻(xiàn)報(bào)道TGEV感染出現(xiàn)的癥狀[15]。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，病料的TGEV核酸檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。隨后，將病料接種ST細(xì)胞培養(yǎng)72 h，出現(xiàn)典型的CPE。由于TGEV毒株的不同，對(duì)細(xì)胞的感染力和增殖動(dòng)態(tài)有一定的差異。ST細(xì)胞接種TGEV-NY毒株后，出現(xiàn)CPE的時(shí)間與接種時(shí)的病毒量、接種方法和細(xì)胞密度等因素有關(guān)。普遍認(rèn)為細(xì)胞密度為80%左右時(shí)接種病毒，以2%左右的胎牛血清培養(yǎng)基作為維持液進(jìn)行培養(yǎng)，比較適合病毒的增殖[15]。本研究采用同樣細(xì)胞密度接種病毒，以無(wú)血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，這樣既能夠排除血清中的某些因子對(duì)病毒分離培養(yǎng)的影響，又能節(jié)約培養(yǎng)成本。

目前，TGEV病毒抗原檢測(cè)方法有膠體金試紙條法、ELISA法和間接免疫熒光等方法[16-18]。ELISA法能通過(guò)吸光度檢測(cè)病毒的含量，但不能直觀顯示病毒在細(xì)胞中的分布狀態(tài)；間接免疫熒光需在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)設(shè)備要求高、操作復(fù)雜，且假陽(yáng)性率較高。IPMA法等已經(jīng)用于多種病毒如馬動(dòng)脈炎病毒[11]、豬流感病毒[19]、豬戊型肝炎病毒[20]、犬細(xì)小病毒[21-22]、豬圓環(huán)病毒[23]等及其相應(yīng)抗體的檢測(cè)。為了研究TGEV-NY的體外感染增殖特性，本研究采用IPMA法檢測(cè)了病毒在ST細(xì)胞中感染的早期增殖動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，病毒接種后24 h和48 h，TGEV核酸陽(yáng)性結(jié)果較為明顯，與之對(duì)應(yīng)的細(xì)胞IPMA染色也為陽(yáng)性；感染6 h后至感染12 h后這個(gè)階段病毒的增殖相對(duì)較慢。病毒感染24 h后，TGEV感染陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，而且染色較早期感染更深，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原含量增加；感染48 h后，90%以上的細(xì)胞均為TGEV抗原陽(yáng)性，說(shuō)明感染后24～48 h為TGEV在ST細(xì)胞中的快速增殖階段。

前人研究表明，TGEV僅有1種血清型，但從其基因組核酸特征將其劃分為基因Ⅰ型和基因Ⅱ型[1,24]。為了確定TGEV-NY毒株的基因型，測(cè)定了該病毒S1基因序列，生物信息學(xué)分析顯示，TGEV-NY屬于基因Ⅰ型，與中國(guó)株TGEV SC-Y DQ443743距離最近，與英國(guó)株TGEV AF104420、中國(guó)株TGEV TSX DQ001167距離較遠(yuǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)的大部分地區(qū)流行的毒株也以基因Ⅰ型毒株較多[15]。S蛋白氨基端是TGEV識(shí)別靶細(xì)胞和決定病毒組織噬性的密切相關(guān)區(qū)，不同毒株的氨基端變異程度差異很大[7]，將S1基因作為TGEV分子流行病學(xué)調(diào)查的靶基因?qū)τ谡莆张R床流行毒株分子進(jìn)化和抗原變異情況具有重要的指導(dǎo)意義，可為病原監(jiān)控、開發(fā)與流行毒株相匹配的診斷試劑和疫苗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[25]。

綜上，本研究成功分離鑒定了1株TGEV基因Ⅰ型毒株，研究了其體外培養(yǎng)特性，為進(jìn)一步開展該病毒的診斷和疫苗研究提供了基礎(chǔ)材料。

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Isolation and Identification of a Transmissible Gastroenteritis Virus Strain NY and Its Biological Characterization

LI Xiaonan1，TANG Qinghai1,2*，LI Yu1，WANG Jin1，YAO Lunguang1，KAN Yunchao1,YANG Hai2

(1.Henan Provincial Engineering Laboratory of Insect Bio-reactor/Henan Provincial Key Laboratory of Funiu Mountain in Insect Biology,Nanyang Normal University,Nanyang 473061,China； 2.Institute of Biological Medicine,College of Life Sciences and Environment,Hengyang Normal University,Hengyang 421008,China)

The faeces samples were collected from a pig with severe diarrhoea,transmissible gastroenteritis virus(TGEV) nucleotide was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and serological methods to isolate the new TGEV strain.The filtered samples were inoculated into ST cells to isolate viruses,then the characterization of the viruses propagated in ST cells were determined by immunoperoxidase monolayer assay(IPMA) and RT-PCR.TGEVS1 gene was amplified by RT-PCR and sequenced,analyzed by solftware DNAStar 7.0 and Mega 5.0.Results showed that significant cytopathic effect(CPE) of ST cells inoculated the sample was observed;RT-PCR detection results showed that the culture samples were TGEV nucleotide positive,as well as serologic test results showed that the culture samples were TGEV antigenic positive.The isolated virus strain was named TGEV-NY.TGEV could be detected in the ST cells 12 hours post infection(hpi) by IPMA,as well as TGEV nucleotide could be detected by RT-PCR in the culture supernant.Nucleotide sequences showed that the open reading frame ofS1 gene was 2 220 bp encoding 740 aa.Phylogenetic analysis showed that TGEV-NY strain belonged to the gene groupⅠ,shared close genetic relationship with TGEV strain SC-Y which was isolated in 2006 from China.

transmissible gastroenteritis virus; isolation and culture; immunoperoxidase monolayer assay;S1 gene

2016-12-02

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(142102110101)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A230023)；南陽(yáng)師范學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2016CX008)；衡陽(yáng)師范學(xué)院引進(jìn)人才專項(xiàng)(16D20)

李曉楠(1989-)，女，河南南陽(yáng)人，在讀碩士研究生，研究方向：生物制藥與疫苗工程。E-mail:929016862@qq.com

*通訊作者：唐青海(1982-)，男，湖南祁陽(yáng)人，講師，博士，主要從事生物制藥與疫苗工程研究。 E-mail:qinghaitang109@126.com

S855.3

A

1004-3268(2017)08-0131-06