李小玲，華智銳，李 靜

(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

油菜素內酯對秦嶺高山杜鵑耐熱性的影響

李小玲，華智銳，李 靜

(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

以野生高山杜鵑幼苗為試材，研究不同質量濃度[0(對照)、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mg/L]油菜素內酯(BR)對高山杜鵑熱害指數及生理生化指標的影響。結果表明：在高溫脅迫下，隨著BR質量濃度的增加，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性及脯氨酸、可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且BR質量濃度在0.5 mg/L時脯氨酸含量、可溶性蛋白含量最高分別為32.8 μg/g、2.5 mg/g，SOD、POD、CAT活性最高分別為89.6、84.5、25.5 U/g；MDA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢，且BR質量濃度在0.5 mg/L時效果最為明顯，MDA含量在高溫脅迫72 h比對照組降低40.49%；不同質量濃度BR均能降低熱害指數，緩解高溫對高山杜鵑幼苗的傷害。BR質量濃度為0.50 mg/L時對高溫脅迫下高山杜鵑各項生理生化特征有較好的緩解作用，可減輕高溫對杜鵑的熱傷害，提高其耐熱性。

油菜素內酯； 高山杜鵑； 高溫脅迫； 耐熱性

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種非生物因子的脅迫，其中溫度是影響植物生理過程的重要生態(tài)因子之一[1]。研究表明，在高溫逆境條件下，植物體內光合作用受到抑制，細胞膜損傷，細胞老化死亡，細胞內蛋白質降解或變性等[2]。當高溫損傷超過植物本身的防御能力時，植物就會表現(xiàn)出外部形態(tài)上的熱害癥狀和生理生化特征變化[3]。近年來，隨著全球氣候變暖，極端天氣的頻繁發(fā)生，影響了植物的生理生態(tài)過程，給農業(yè)生產造成了一定的損失，因此，尋求簡單有效的防御措施顯得迫在眉睫。研究表明，化學控制技術作為一種簡單有效的方法，可通過激素類化合物等信號物質誘導抗性基因表達，提高植物體內保護酶活性，降低丙二醛(MDA)含量，緩解逆境對植物的傷害[4-5]。油菜素內酯(BR)是一種新型、無毒的天然植物激素，廣泛存在于植物的花粉、種子、莖、葉等器官中，其作用機制類似于生長素，在植物生長發(fā)育中起著重要的調節(jié)作用[6]。研究表明，BR在提高植物抗逆性方面有著重要作用，具體表現(xiàn)為抗旱、抗鹽、抗氧化、抗高溫能力[7-10]。此外，BR可作為信號分子增強水稻、番茄、甜瓜、無柄小葉榕、獼猴桃幼苗以及浙貝母等[11-16]的耐熱性，提高植物或農作物的產量和品質。

杜鵑花是指杜鵑花科杜鵑屬(Rhododendron)的所有種類，它不僅是世界三大高山野生花卉之一，同時也是世界園林最為著名的觀賞植物和中國傳統(tǒng)的十大名花之一。秦嶺野生的杜鵑花屬植物以其豐富的資源、優(yōu)美的姿態(tài)、艷麗的花色著稱，具有極高的觀賞價值，部分品種果實可以食用，枝葉可以入藥，開發(fā)利用價值較高[17-18]。高山杜鵑一般生長在海拔1 500～2 900 m，喜歡冷涼環(huán)境，耐高溫性不強，在高溫條件下易受傷害。目前，由于全球氣候變暖，嚴重影響高山杜鵑的生長，但迄今為止對于高山杜鵑的研究主要集中在資源調查、引種栽培管理方面，對其生理方面的研究較少，且有關BR在高山杜鵑耐熱生理方面的研究尚未見報道。為尋求有效提高高山杜鵑耐熱性的新途徑，以秦嶺杜鵑花幼苗為材料，探討高溫脅迫下BR對高山杜鵑幼苗生理特性的影響，旨在為秦嶺高山杜鵑引種栽培及耐熱性育種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

所用高山杜鵑幼苗于2016年3月中旬采自商洛鎮(zhèn)安木王國家森林公園海拔1 500 m左右的茨溝杜鵑花景區(qū)；BR購自西安晶博有限公司，含量≥95%，為分析純試劑AR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預培養(yǎng) 預處理：將所采集的高山杜鵑幼苗移栽至直徑15 cm左右的花盆中進行預培養(yǎng)，設置的培養(yǎng)溫度為20 ℃，培養(yǎng)1周左右，期間每天傍晚噴灑0.1%～0.5%的硫酸亞鐵水溶液以保持土壤濕潤。然后選取生長一致的幼苗用于試驗。

1.2.2 試驗設計 用少量無水乙醇溶解再加Tween-80溶液配制質量濃度為0.05(T1)、0.10(T2)、0.50(T3)、1.00(T4)、1.50 mg/L(T5)的BR溶液，以相同濃度無水乙醇加Tween-80溶液為對照(CK)。每天17：00噴灑高山杜鵑幼苗葉面。每種藥劑重復3次，每次重復設3株苗。

噴灑10 d后，采用人工模擬氣候法對幼苗進行高溫脅迫。溫度設為白天40 ℃/夜晚32 ℃，光照強度10 000 lx，處理時間96 h，每間隔24 h測定1次相關生理指標。將植株取出后，立即剪下適宜的葉片，洗凈，然后用蒸餾水沖洗，取出主葉脈后，剪碎，用于測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、MDA含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量等生理指標。

1.2.3 生理指標的測定 脯氨酸含量的測定參照朱廣廉等[19]的茚三酮法，MDA含量的測定參照張志良等[20]的硫代巴比妥酸法，SOD活性的測定參照李合生[21]的氮藍四唑(NBT)光還原法，POD活性的測定參照郝再彬等[22]的愈創(chuàng)木酚顯色法，CAT活性的測定參照高俊鳳[23]的紫外光譜法，可溶性蛋白含量的測定參照高俊鳳[23]的考馬斯亮藍G-250法。

1.2.4 熱害指數的計算 高溫處理期間對高山杜鵑生長狀況進行觀察，并分級記錄高溫對杜鵑幼苗的傷害程度。高溫傷害程度分為5個級別，其中0級指無熱傷害癥狀；1級指1～2片葉子開始變黃變枯；2級指2～4片葉子黃化，1片枯死；3級指2片葉枯死；4級指2片葉以上枯死；5級指整株枯死。通過公式計算熱害指數[24]，熱害指數=(∑熱害級數×相應株數)/(最高級數×總株數)。

1.3 數據處理

用Excel 2010進行數據統(tǒng)計，用SPSS 17.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度BR對高山杜鵑葉片脯氨酸含量的影響

由圖1可知，隨著高溫脅迫時間的延長，脯氨酸含量呈現(xiàn)先緩慢上升再下降的趨勢，但各處理組的脯氨酸含量有明顯的差異。高溫脅迫起始時，各處理組與對照組的脯氨酸含量水平較低，均處于10 μg/g左右,高溫脅迫48 h后對照、T1、T2、T3、T4、T5處理組的脯氨酸含量上升至20.8、25.6、27.9、32.8、29.7、23.8 μg/g,其中 0.50 mg/L BR效果最明顯，與對照組差異顯著(P<0.05)。由此可知，BR能有效促進高山杜鵑葉片脯氨酸的積累，提高植物耐熱性。

圖1 高溫脅迫下BR對高山杜鵑葉片脯氨酸含量的影響

2.2 不同質量濃度BR對高山杜鵑葉片MDA含量的影響

由圖2可知，隨著高溫脅迫時間的延長，MDA含量一直呈緩慢上升趨勢，說明高溫逆境下細胞質膜發(fā)生了過氧化作用，引起質膜正常的生理功能發(fā)生紊亂。經不同質量濃度BR處理過的試驗組高山杜鵑幼苗MDA含量在同一時間均低于對照組，說明適宜濃度的BR可緩解高溫脅迫引起的MDA含量的升高，不同質量濃度BR對高山杜鵑幼苗MDA的影響程度不同，就同一時間來說，隨著BR質量濃度的增大，MDA含量呈先下降后上升的趨勢，在整個處理過程中，0.50 mg/L BR處理效果最為明顯，在72 h相對于對照組降低的比例最大，為40.49%。

圖2 高溫脅迫下BR對高山杜鵑葉片MDA含量的影響

2.3 不同質量濃度BR對高山杜鵑葉片SOD、POD、CAT活性的影響

由圖3—5可以看出，隨著高溫脅迫時間的延長，3種抗氧化酶的活性呈先上升后下降的趨勢，這說明高山杜鵑幼苗對高溫脅迫的反應比較明顯。不同質量濃度BR處理均顯著提高了3種抗氧化酶的活性，且與對照組差異顯著(P<0.05)，其中 BR為0.50 mg/L時效果最好，且SOD、POD活性均在72 h達到最大值，分別為89.6、84.5 U/g,CAT活性在48 h達到量大值(25.5 U/g)。

在高溫脅迫0～72 h，BR處理組的SOD活性一直處于上升趨勢，之后開始下降，但與對照組有明顯不同的是，對照組在48 h后SOD、POD活性開始降低。在0～24 h內對照組與BR處理組差異不顯著，但在24 h后對照組與BR處理組差異顯著(P<0.05)。SOD活性表現(xiàn)為0.50 mg/L處理>1.00 mg/L處理>0.10 mg/L處理>0.05 mg/L處理>1.50 mg/L處理>CK，表明BR為0.50 mg/L時效果最好。不同質量濃度BR對高山杜鵑幼苗POD活性的影響與SOD相同。由此說明高溫脅迫下，適宜濃度的BR可提高SOD、POD活性，增強植物耐熱性。

圖3 高溫脅迫下BR對高山杜鵑葉片SOD活性的影響

圖4 高溫脅迫下BR對高山杜鵑葉片POD活性的影響

圖5 高溫脅迫下BR對高山杜鵑葉片CAT活性的影響

由圖5可知，在整個高溫脅迫過程中，BR處理組的CAT活性在不同時間段總體上高于對照組，且在高溫脅迫0～48 h內，BR處理組的CAT活性一直處于上升趨勢，在48 h達到最大值，之后開始下降，對照組CAT活性也在48 h后開始降低。就同一時間來說，隨著BR質量濃度的增大，CAT活性呈先上升后下降的趨勢，但在高溫脅迫48 h，對照組與處理組差異顯著(P<0.05)；高溫脅迫96 h，當脅迫壓力超過植物所能承受的極限時，高溫會破壞酶的活性中心，通過改變酶的結構或抑制酶的表達，使得酶活性下降。由此認為，適宜質量濃度的BR可提高CAT活性，這與萬正林等[12]的研究結果不同。

2.4 不同質量濃度BR對高山杜鵑葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，隨著高溫脅迫時間的延長，與對照組相比，BR試驗組高山杜鵑幼苗可溶性蛋白含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，并且在同一時間BR試驗組的可溶性蛋白含量均高于對照組，說明在高溫脅迫下BR可明顯提高蛋白質的合成能力，有效維持其穩(wěn)定性。不同質量濃度BR對可溶性蛋白含量的影響程度是不同的，就同一時間來說，隨著BR質量濃度的增大，可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趨勢，其中，以0.50 mg/L BR處理效果最好，在96 h可溶性蛋白含量最高，為2.5 mg/g,相對于對照組升高的幅度最大，為54.32%。

圖6 高溫脅迫下BR對高山杜鵑葉片可溶性蛋白含量的影響

2.5 不同質量濃度BR對高山杜鵑熱害指數的影響

逆境條件下，植物外部形態(tài)特征的變化可作為衡量植物抗逆能力強弱的指標。隨著高溫的延續(xù)，高山杜鵑外部形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，由圖7可知，各BR處理組的變化趨勢與對照組相似，對照組熱害指數較高，而外施0.50 mg/L BR可顯著降低高山杜鵑的熱害指數。以對照組為例，在高溫脅迫24 h，植物葉片失水現(xiàn)象明顯提高；在48 h，植物表現(xiàn)為基部葉片邊緣和葉片尖端開始變黃；在72 h，植物整個葉片開始變黃；在96 h，植物大多數葉片出現(xiàn)萎縮并枯死。說明隨著高溫脅迫時間的延長，高山杜鵑幼苗熱傷害程度逐漸加重，經不同質量濃度BR處理后杜鵑幼苗葉片熱害指數增長相對緩慢且都低于對照組。

圖7 高溫脅迫下BR對高山杜鵑熱害指數的影響

3 結論與討論

BR是一種天然植物激素，眾多研究表明，適宜濃度的BR可降低膜脂過氧化產生的MDA含量，提高植物體內保護酶活性及葉綠素含量，有效促進植物光合作用及干物質積累，從而緩解高溫、鹽堿、干旱、低氧等逆境條件對植物的傷害[25]。因此，本試驗通過對高山杜鵑幼苗葉片噴灑一定質量濃度的BR溶液，并對連續(xù)高溫脅迫下高山杜鵑幼苗葉片中各項生理生化指標進行測定，來探討外源BR對高山杜鵑耐熱性的影響。

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，通過測定MDA含量可以了解膜脂過氧化的程度，從而間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。所以高溫脅迫下MDA含量的高低可以反映高山杜鵑生物膜受傷害的程度及其耐熱性的強弱。本試驗中，隨著高溫脅迫時間的延長，MDA含量一直呈緩慢上升趨勢，而經BR處理的高山幼苗MDA含量在同一時間均低于對照組，說明BR可緩解膜脂過氧化的過程，降低MDA含量，其中以0.50 mg/L BR效果最為明顯。

脯氨酸作為植物細胞內重要的一種滲透調節(jié)物質，與植物抗逆性密切相關。脯氨酸能有效幫助植物細胞組織持水和防止脫水，并能保護質膜完整性。在逆境脅迫條件下，耐熱植物與不耐熱植物相比，體內積累了更多的脯氨酸，并且耐熱性強弱與植物體內脯氨酸維持積累的時間長短呈現(xiàn)正相關[26]。因此，推測BR處理可能通過調節(jié)植物細胞水分的變化來增強植物的耐熱性。

SOD是生物機體內天然存在的超氧自由基清除因子，可以與超氧物陰離子自由基發(fā)生歧化反應，生成O2和H2O2，生成的H2O2可被CAT分解為O2和H2O，以避免H2O2積累對細胞的氧化破壞作用。本試驗中，高溫脅迫下，BR明顯提高了高山杜鵑幼苗SOD、POD、CAT活性，從而提高了植物的耐熱性。這與在番茄[12]、獼猴桃[16]、蝴蝶蘭[27]上的研究結果一致。

可溶性蛋白含量的高低可以反映植物抗逆性的強弱，其主要起到維持滲透調節(jié)和防止細胞脫水的功能。本試驗結果表明，BR能顯著提高高山杜鵑葉片的可溶性蛋白含量。其作用機制可能是高溫脅迫導致了大量熱激蛋白的合成并集中在膜組分中，同時以分子伴侶形式結合在受熱脅迫而解折疊的蛋白質上，避免蛋白質凝聚，穩(wěn)定了其原有的空間構象，保持了生物活性，從而避免了生物膜的變性與受損，增強了植物抗逆能力[28]，而BR可能參與了植物逆境生理過程，提高了植物體內可溶性蛋白含量，但具體機制有待進一步探討。

熱害指數是評價杜鵑耐熱性的重要指標，在植物整個生長發(fā)育過程中常常會遭受各種非生物因子的脅迫，其中溫度是影響其生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一。本試驗結果表明，在高溫脅迫條件下，高山杜鵑幼苗均受到了不同程度的傷害，而適宜濃度的BR可抑制MDA含量的增加，提高植物細胞內抗氧化酶活性和抗氧化物質的含量，增強植物抗逆性，并在一定程度上降低熱害指數，而高濃度的BR反而降低保護酶的活性，促進有害物質積累，加深高溫脅迫的作用。

綜合各項指標表明，對高溫脅迫下秦嶺高山杜鵑進行的不同BR處理中，以質量濃度為0.50 mg/L的BR處理效果最佳，建議在農業(yè)生產中選取該濃度的BR溶液作為處理液，緩解高山杜鵑的熱害現(xiàn)象，為高山杜鵑的引種馴化栽培和耐熱育種研究提供參考,也為BR廣泛應用于林業(yè)和農業(yè)生產實踐提供理論依據。

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Effects of Brassinolide on Tolerance ofRhododendronlapponicumin Qinling to Heat Stress

LI Xiaoling,HUA Zhirui,LI Jing

(College of Biology Pharmacy and Food Engineering of Shangluo University,Shangluo 726000,China)

Wild seedlings ofRhododendronlapponicumwas taken as materials to study the effect of different concentrations of brassinolide[0(CK),0.05,0.10,0.50,1.00,1.50 mg/L] on their physiological indexes related to thermo-tolerance under high temperature stress.The results showed that,under high temperature conditions,the activities of SOD,POD,CAT and the contents of proline and soluble protein all increased first and then decreased with the increase of brassinolide concentration.When the concentration of brassinolide was 0.50 mg/L,the contents of proline and soluble protein were the highest,which were 32.8 μg/g and 2.5 mg/g,and the activities of SOD,POD and CAT were the highest,which were 89.6,84.5,25.5 U/g.The MDA content decreased first and then increased.When the concentration of brassinolide was 0.50 mg/L,the MDA content was lowest,which was decreased by 40.49% compared with the control at 72 hours.The different concentration of brassinolide could reduce damage index and relieve the damage of high temperature to the seedlings.When the concentration of brassinolide was 0.50 mg/L,the physiological and biochemical characteristics ofRhododendronlapponicumcould be relieved under the high temperature stress,which could reduce the heat damage and improve the heat tolerance ofRhododendronlapponicum.

brassinolide;Rhododendronlapponicum; high temperature stress; theromo-tolerance

2017-03-31

陜西省科技廳項目(2017NY-027)；商洛學院根植地方行動計劃項目(gz16015)

李小玲(1980-)，女，陜西藍田人，副教授，主要從事園林植物生理生態(tài)研究。E-mail:lxlflower@163.com

S685.21

A

1004-3268(2017)08-0126-05