郭獻(xiàn)平，吳中營，王東升，張四普，牛佳佳

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因生物信息學(xué)分析及缺鐵脅迫對其表達(dá)的影響

郭獻(xiàn)平，吳中營，王東升*，張四普，牛佳佳

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

為了探究缺鐵脅迫對杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，對杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因三價鐵還原酶(PbFRO2)基因和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PbIRT1)基因的氨基酸序列進(jìn)行了多重序列比對和進(jìn)化樹分析；采用改良的Hoagland營養(yǎng)液水培杜梨的方法，研究了缺鐵脅迫對杜梨根系PbFRO2和PbIRT1基因相對表達(dá)量以及根系鐵和鋅含量的影響。結(jié)果表明，PbFRO2蛋白具有還原酶特性，PbIRT1蛋白屬于二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族—ZIP家族；缺鐵脅迫9 d內(nèi)，杜梨根系PbFRO2和PbIRT1的表達(dá)量整體上呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，脅迫3 d表達(dá)量達(dá)到最高點且與對照(加Fe-EDTA)差異顯著;缺鐵脅迫30 d，杜梨根系中鐵含量比對照降低77.46%，而鋅含量提高1 139.40%。綜上可知，缺鐵脅迫可誘導(dǎo)杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)量升高，進(jìn)而促進(jìn)二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性提高。

杜梨； 缺鐵脅迫； 鐵吸收； 三價鐵還原酶基因； 鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

鐵作為一種重要的微量營養(yǎng)元素，與果樹的生長發(fā)育密切相關(guān)[1]。鐵是植物光合作用和固氮作用2個重要的代謝途徑中必要的輔助因子，其利用效率極大地影響植物的生長[2]。盡管自然界土壤中含有較多的鐵，但在堿性或石灰性土壤中，鐵易被氧化并以三價鐵(Fe3+)形態(tài)存在，F(xiàn)e3+溶解度較低，限制了鐵的利用率。在這種條件下，為了維持植物的正常生長，在長期的進(jìn)化中，植物從形態(tài)和生理上建立了一套適應(yīng)機(jī)制。目前，對植物鐵元素代謝的初期研究主要集中在根系的鐵吸收機(jī)制方面。

R?mheld等[3]1986年在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，提出了高等植物在長期適應(yīng)缺鐵脅迫過程中所形成的2種適應(yīng)性機(jī)制，雙子葉植物以及非禾本科單子葉植物采用機(jī)制Ⅰ吸收鐵，而單子葉禾本科植物釆用機(jī)制Ⅱ吸收鐵。機(jī)制Ⅰ中，植物在進(jìn)行鐵吸收時，首先通過質(zhì)膜上的H+-ATPase向根際分泌H+，酸化根際土壤，增加土壤中Fe3+的溶解性。在鐵進(jìn)入根系細(xì)胞之前，植物會先通過鐵氧還原酶(FRO)將Fe3+還原為Fe2+，之后，再通過細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT進(jìn)入細(xì)胞。機(jī)制Ⅱ中，植物鐵吸收的關(guān)鍵物質(zhì)是麥根酸類植物鐵載體MAs。這類植物發(fā)生缺鐵脅迫時會分泌MAs，其對Fe3+親和力強(qiáng)，能形成穩(wěn)定的三價鐵螯合物Fe3+-MAs，然后被運(yùn)入植物體內(nèi)。在番茄[4]、黃瓜[5]、豌豆[6-7]、水稻[8-9]、蘋果[10]等中均發(fā)現(xiàn)了三價鐵還原酶基因(PbFRO2)和二價鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(PbIRT1)2種關(guān)鍵基因。

中國梨屬砧木資源豐富，華北、西北及華東的堿性土壤地區(qū)，多采用杜梨(Pyrusbetulifolia)作為砧木[11]。本試驗在缺鐵脅迫下對杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因PbFRO2和PbIRT1進(jìn)行初步研究，為尋找提高堿性土壤中杜梨根系鐵吸收效率的途徑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2016年2月底選擇大小一致且飽滿的杜梨種子，將種子置于無菌河沙中，在4 ℃的環(huán)境中層積催芽。2016年3月露白后播種于溫室中，基質(zhì)配比為V草炭∶V珍珠巖∶V蛭石=3∶1∶1。

1.2 主要試劑和儀器

試劑：RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(目錄號：DP419)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司(目錄號：R211-01/02)。儀器：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR系統(tǒng)，美國Teledyne Leeman Labs公司生產(chǎn)的ICP-Prodigy7等離子發(fā)射光譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 缺鐵處理 杜梨苗長出6片真葉后，進(jìn)行全營養(yǎng)液水培，每小時通氣15 min。全營養(yǎng)液利用改良的Hoagland溶液(表1)。全營養(yǎng)液培養(yǎng)2周后，進(jìn)行缺鐵處理(不加Fe-EDTA，即-Fe)，以加Fe-EDTA為對照(+Fe)。

表1 改良Hoagland溶液的組成

1.3.2 杜梨根系PbFRO2和PbIRT1多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)中查詢到杜梨PbFRO2氨基酸序列(Accession no.AKI29081.1)和PbIRT1氨基酸序列(AMY26505.1)，通過NCBI中的BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列比對，獲得擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtFRO2(NP_171664.1)、小金海棠(Malusbaccatavar.xiaojinensis)MxFRO2(ABU54827.1)、番茄(Solanumlycopersicum)LeFRO1(AAP46144.1)、豌豆(Pisumsativum)PsFRO1(AAK95654.2)、黃瓜(Cucumissativus)CsFRO1(AAT01415.1)氨基酸序列，以及擬南芥AtIRT1(NP_567590.3)、AtIRT2(NP_001031670.1)，豆梨(Pyruscalleryana)PcIRT1(AMY26506.1)，小金海棠MxIRT1(AAO17059.1)，番茄LeIRT1(AAD30548.1)、LeIRT2(AAD30549.1)，豌豆PsRIT1(AAC17441.1),水稻(OryzasativaJaponica Group)OsIRT1 (XP_015632375.1)、OsIRT2(XP_015629246.1)氨基酸序列。

蛋白質(zhì)預(yù)測和分析：利用在線工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測分子量；利用CLUSTAL W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)和BOXSHADE (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進(jìn)行多重序列分析；利用在線工具(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽結(jié)構(gòu)。利用MEGA 4.0軟件以相鄰連接法(Neighbour Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 杜梨根系PbFRO2和PbIRT1在缺鐵脅迫不同時間的相對表達(dá)量 分別在缺鐵處理0、1、2、3、6、9 d取杜梨根系，放入-80 ℃液氮保存。在NCBI中獲得PbFRO2和PbIRT1 cDNA全長的基礎(chǔ)上,利用Primer 5.0設(shè)計qPCR引物，以Actin為內(nèi)參基因，PbActinQ-F：5′-TCTTCTCAACAACGACCCCA-3′，PbActinQ-R：5′-CATGAAGTCGGCAGCAAGAA-3′，PbFRO2Q-F：5′-TCAAGCCGAACCCTTCAGAC-3′，PbFRO2Q-R：5′-TCATTCCAAGCCAGAGCCAG-3′，PbIRT1Q-F：5′-TGCAGCACTGAAAACACCTC-3′，PbIRT1Q-R：5′-AGAGGTTTCGATCAGGGTGG-3′。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系參照南京諾唯贊生物科技有限公司的SYBR Green Master Mix試劑盒，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。采用2-△△CT方法進(jìn)行表達(dá)量分析。

印刷行業(yè)的質(zhì)量檢測，與其他行業(yè)有很大的不同，而且國內(nèi)外市場對于印刷質(zhì)量檢測的理解也有很大的差別。通常情況下，國內(nèi)企業(yè)在使用國外的質(zhì)量檢測系統(tǒng)時，由于產(chǎn)品的要求比國外低，故導(dǎo)致廢品率很高。凌云考慮到了這一因素，于是為研發(fā)的質(zhì)量檢測系統(tǒng)設(shè)定了一個彈性的標(biāo)準(zhǔn)，從而解決了這一問題，并可在一定程度上降低企業(yè)的成本和廢品率。“質(zhì)量是最關(guān)鍵的，我們國內(nèi)的印刷企業(yè)不是做不好，而是對質(zhì)量缺乏‘敬畏’?！绷柙瓶偛靡σ銖?qiáng)調(diào)說：“產(chǎn)品的質(zhì)量基準(zhǔn)設(shè)置好以后，大家都應(yīng)該遵循這一標(biāo)準(zhǔn)，是成品就是成品，是廢品就是廢品，這樣的意識正是國內(nèi)印刷企業(yè)所欠缺的?！币σ阏嫘南Ｍ麌鴥?nèi)印刷企業(yè)能夠重視產(chǎn)品的質(zhì)量檢測。

1.3.4 根系鐵和鋅含量的測定 在缺鐵脅迫30 d，取對照和缺鐵杜梨苗根系測定鐵和鋅含量，測定方法為酸消解-ICP法。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel和SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，以LSD最小顯著性差異法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PbFRO2和PbIRT1多重序列比對

杜梨PbFRO2基因 cDNA全長2 163 bp，開放閱讀框編碼PbFRO2蛋白具有720個氨基酸，分子質(zhì)量為80.70 ku。圖1顯示了杜梨與擬南芥、小金海棠、番茄FRO2蛋白的氨基酸序列比對，黑色部分表示完全相同的蛋白質(zhì)序列，灰色表示相似序列，其中，PbFRO2與擬南芥三價鐵還原酶蛋白AtFRO2的蛋白序列同源性達(dá)58%，相似度達(dá)76%，與小金海棠、番茄FRO2蛋白序列同源性達(dá)59%、62%，相似度達(dá)77%、79%。

圖1顯示，PbFRO2中445—458氨基酸序列含有氧化還原酶的標(biāo)識序列[12]。通過跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測，PbFRO2具有10個跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽序列。另外，在第七和第八跨膜結(jié)構(gòu)域之間，存在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合位點(氨基酸序列337—382)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)結(jié)合位點(427—432)。

杜梨PbIRT1 cDNA全長1 188 bp，開放閱讀框編碼PbIRT1蛋白具有364個氨基酸，分子質(zhì)量為39.10 ku。圖2顯示了杜梨與豆梨、小金海棠、番茄、豌豆、水稻IRT1蛋白的氨基酸序列比對，其中，PbIRT1與擬南芥鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtIRT1的蛋白序列同源性達(dá)59%，相似度達(dá)73%，與豆梨、小金海棠、番茄、豌豆、水稻IRT1蛋白序列同源性達(dá)99%、98%、73%、67%、55%，相似度達(dá)99%、98%、84%、80%、72%。

圖2顯示，PbIRT1中227—231氨基酸序列符合ZIP家族的標(biāo)識序列區(qū)域的氨基酸序列[LIVFA][GAS][LIVMD][LIVSCG][LIVFAS]H[SAN][LIVFA][LIVFMAT][LIVDE]G[LIVF][SAN][LIFVF][GS][13]。通過跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測，PbIRT1具有8個跨膜結(jié)構(gòu)域，N端1—30為信號肽序列，在第三和第四跨膜結(jié)構(gòu)域間有一可變區(qū)，可變區(qū)方框內(nèi)富含組氨酸(His)。通過以上分析推理得出，PbIRT1具有ZIP家族的特征[14]，為家族成員之一。

2.2 PbFRO2和PbIRT1系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 缺鐵脅迫不同時間杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)特性分析

對杜梨進(jìn)行缺鐵脅迫9 d，檢測不同時期杜梨根系PbFRO2和PbIRT1相對表達(dá)量(圖4)，采用2-△△CT方法進(jìn)行表達(dá)量數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，對照0 d二者相對表達(dá)量為1，缺鐵脅迫1 d，PbFRO2相對表達(dá)量比對照顯著降低，PbIRT1相對表達(dá)量與對照無顯著差異。缺鐵脅迫2 d后，PbFRO2和PbIRT1逐漸升高，在3 d達(dá)到最高(分別為25.41和13.91)，之后二者的相對表達(dá)量降低，但均與對照差異顯著，在9 d分別為2.85和4.07。缺鐵脅迫9 d內(nèi)，對照之間的相對表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

TM1—10表示跨膜結(jié)構(gòu)域1—10；FAD-binding site表示黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合位點；NADPH-binding site表示還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合位點；Oxidoreductase signature 表示氧化還原酶的標(biāo)識序列

TM1—8表示跨膜結(jié)構(gòu)域1—8；Variable region表示可變區(qū)，方框內(nèi)富含組氨酸殘基序列；Signal peptide 表示信號肽序列；ZIP signature 表示ZIP家族的標(biāo)識序列

圖3 PbFRO2和PbIRT1進(jìn)化樹分析

同一時間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 缺鐵脅迫30 d對杜梨根系鐵和鋅含量的影響

在缺鐵脅迫30 d時，對照和缺鐵處理的杜梨苗已有明顯的表型差異(圖5)，此時，缺鐵脅迫的杜梨根系鐵含量比對照降低77.46%，而鋅含量比對照提高1 139.40%，鐵和鋅含量均與對照差異顯著(圖6)。

圖5 缺鐵脅迫30 d對照(左)和缺鐵處理(右)杜梨表型差異

同一指標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，杜梨根系三價鐵還原酶PbFRO2具有還原酶特性，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PbIRT1屬于二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族—ZIP家族。二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族—ZIP基因家族由IRT1和相關(guān)的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因組成[15]，擬南芥AtIRT1是ZIP基因家族的第1個成員。該基因家族編碼一種長度為309～476個氨基酸殘基的膜結(jié)合蛋白，具有8個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都含有20多個氨基酸殘基[15]。二價鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因IRT表達(dá)量升高，不僅增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的效率，同時也提高了轉(zhuǎn)運(yùn)鋅和錳等二價金屬離子的能力，缺鐵脅迫下，擬南芥根系中鋅和錳含量均顯著高于對照[16]，豌豆根系中鋅、錳、銅含量以及有毒的鎘含量均顯著高于對照[17]。ZIP基因家族在跨膜結(jié)構(gòu)域3和4之間是一個與金屬離子結(jié)合的可變區(qū)，這個富含His的區(qū)域?qū)τ诮饘匐x子的結(jié)合和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是重要的，改變其內(nèi)的某些氨基酸殘基可以改變其對二價金屬離子結(jié)合的特性。將擬南芥AtIRT1氨基酸序列103位通過點突變由谷氨酸(E)改為丙氨酸(A)，在酵母二價鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體fet3fet4中相同表達(dá)量下，與對照相比，在鐵的吸收效率不降低的情況下，可有效減少鋅的吸收效率[18]。

本研究表明，缺鐵脅迫可誘導(dǎo)杜梨根系鐵吸收關(guān)鍵基因表達(dá)量升高，進(jìn)而促進(jìn)二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性提高。缺鐵脅迫9 d內(nèi)，杜梨根系PbFRO2和PbIRT1的表達(dá)量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，脅迫3 d表達(dá)量達(dá)到最高點且與對照差異顯著，對照之間表達(dá)量變化差異不顯著。缺鐵脅迫30 d，杜梨根系中鐵含量比對照降低77.46%，而鋅含量提高1 139.40%。擬南芥在缺鐵脅迫下AtFRO2和AtIRT1的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后增高再降低的趨勢，缺鐵處理6 hAtFRO2和AtIRT1表達(dá)量比對照降低，12 h后開始上升，在24 h達(dá)到最高峰，之后逐漸降低[19]。小金海棠在缺鐵脅迫下2個關(guān)鍵基因的相對表達(dá)量也表現(xiàn)出與擬南芥相同的趨勢，缺鐵脅迫第2天表達(dá)量降低，第8天達(dá)到最高峰，之后降低[10]。有研究表明，F(xiàn)RO2和IRT1表達(dá)量受根際鐵含量和葉片鐵營養(yǎng)狀況的雙重調(diào)控，擬南芥根系周圍的鐵本身可誘導(dǎo)AtFRO2和AtIRT1表達(dá)量的升高[20]。在缺鐵脅迫初期，根系周圍的鐵含量降低，植物根系反應(yīng)為植物不再需要吸收鐵，鐵吸收相關(guān)基因表達(dá)量降低，隨著脅迫時間延長，葉片鐵含量不能滿足需求，產(chǎn)生信號物質(zhì)傳達(dá)到根系促使FRO2和IRT1表達(dá)量升高，進(jìn)而提高鐵的吸收效率。

本研究雖然對PbFRO2和PbIRT1進(jìn)行了分析，但其功能還需要通過超表達(dá)和RNA干擾進(jìn)行驗證。另外，進(jìn)一步研究FRO2和IRT1轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、鐵感受信號物質(zhì)等方面，對探索逆境條件下杜梨如何高效吸收鐵具有重要意義。

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Bioinformatics Analysis of Iron Uptake Key Gene in the Root ofPyrusbetulifoliaand the Effect of Iron Deficiency on Its Expression

GUO Xianping，WU Zhongying，WANG Dongsheng*，ZHANG Sipu，NIU Jiajia

(Institute of Horticulture，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China)

To explore the effect of iron deficiency on iron uptake key gene expression in the root ofPyrusbetulifolia,the amino acid sequences of ferric reduction oxidase gene(PbFRO2) and iron-regulated transporter gene(PbIRT1) ofPyrusbetulifoliawere separately compared with other plants，phylogenetic analysis was used to examine the evolutionary relationships，and the effects of iron deficiency on thePbFRO2 andPbIRT1 gene expression and Fe and zinc contents in the root ofPyrusbetulifoliawere studied by using the modified Hoagland nutrient solution for culture.The results showed that PbFRO2 protein had reductase features，and PbIRT1 protein was one of the members of the ZIP family.ThePbFRO2 andPbIRT1 gene expression showed a trend of increase first and then decrease under iron deficiency for 9 days，and the expression level reached its highest point on the 3rd day,with a significant difference from the control.Fe content in root was reduced by 77.46%，and the zinc content was increased by 1 139.40% on the 30th day under iron deficiency.In conclusion，the increase of iron uptake key gene expression in the root ofPyrusbetulifoliacan be induced under iron deficiency stress，which further promotes the activity of divalent metal ion transporters.

Pyrusbetulifolia; iron deficiency; iron uptake; ferric reduction oxidase gene; iron-regulated transporter gene

2017-02-20

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(162300410147)；國家梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-29-3)

郭獻(xiàn)平(1982-)，男，河南內(nèi)黃人，助理研究員，博士，主要從事梨樹栽培生理與分子生物學(xué)研究。 E-mail:xianping2005@163.com

*通訊作者：王東升(1966-)，男，河南武陟人，研究員，碩士，主要從事梨栽培生理研究。E-mail:wdse66@126.com

S661.2

A

1004-3268(2017)08-0096-06