桑 亮，王學梅，許東陽，商功群，袁勝美，屠樹星

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧 沈陽 110001）

?腹部影像學?

超聲量化指標評價白藜蘆醇對大鼠肝纖維化的影響

桑 亮，王學梅，許東陽，商功群，袁勝美，屠樹星

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲科，遼寧 沈陽 110001）

目的：通過超聲量化指標觀察白藜蘆醇（Resveratrol，RES）對CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型的影響。方法：20只健康雄性SD大鼠隨機分為4組：對照組、RES組、模型組、RES干預組。造模8周后超聲檢測門靜脈近段與遠段內(nèi)徑、血流速度及肝組織楊氏模量，大鼠肝組織HE染色，光鏡下判定肝纖維化程度。結(jié)果：①RES干預后大鼠癥狀較輕，體質(zhì)量有所增加，肝纖維化病理得到改善。②大鼠門靜脈近段與遠段內(nèi)徑在模型組與RES干預組較對照組與RES組均增寬（P＜0.05）；門靜脈血流速度在模型組與RES干預組較對照組與RES組均增加，但在各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；肝組織楊氏模量在模型組與RES干預組較對照組與RES組均升高（P＜0.05）。RES干預后門靜脈內(nèi)徑及楊氏模量改變幅度有所減低。各指標在對照組與RES組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：①RES可以有效改善CCl4誘導的大鼠肝纖維化病理改變。②門靜脈內(nèi)徑與楊氏模量可以有效評價RES對CCl4誘導大鼠肝纖維化的影響。

肝硬化；大鼠；超聲檢查

肝纖維化是指各種致病因素引起肝臟損害和炎癥，在修復過程中導致肝臟細胞外基質(zhì)異常增多和過度沉積的病理過程[1]。目前，肝纖維化的隨訪與藥物療效評價主要依靠影像學檢查及血清學指標，超聲因其具有無創(chuàng)、經(jīng)濟、可重復性強等優(yōu)勢，往往成為臨床診治的首選檢查手段，但是二維超聲對肝實質(zhì)回聲的判定存在主觀性，難以進行定量分析[2－3]。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）具有顯著抗炎、抗氧化作用，有效保護肝臟不受損害[4]。本研究通過CCl4復制肝纖維化模型，并以病理做為金標準，通過超聲量化指標評價RES對大鼠肝纖維化的影響，為臨床上肝纖維化的隨訪、藥物療效及預后觀察提供更為充分的理論基礎和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠，雄性，健康，清潔級，體質(zhì)量（200±20） g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司。所有實驗大鼠均分籠飼養(yǎng)，普通飼料喂養(yǎng)，自由進水。房間溫度保持在20℃～25℃，濕度在45%～60%。

1.2 方法

1.2.1 制備動物模型

健康成年SPF級SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量（200±20）g，適應性飼養(yǎng) 1 周，隨機分為 4 組，A 組：對照組，B 組：RES組，C 組：模型組，D 組：RES干預組。用橄欖油將CCl4配成40%的溶液進行造模。A組：大鼠灌胃與RES等體積羧甲基纖維素鈉（Sodium carboxymethyl cellulose，CMC），1 次/d，30min 后腹腔注射與CCl4等體積的橄欖油，2次/周，連續(xù)8周。B組：大鼠灌胃RES溶液（提前用CMC溶解），20mg/kg，1次/d，30min后腹腔注射與 CCl4等體積的橄欖油，2次/周，連續(xù)8周。C組：大鼠灌胃與RES等體積 CMC，1次/天，30 min后腹腔注射 40%的CCl4溶液（用橄欖油配制），2mL/kg，2 次/周，連續(xù) 8周。D 組：大鼠灌胃 RES 溶液，20mg/kg，1 次/d，30min后腹腔注射 40%的 CCl4溶液，2mL/kg，2 次/周，連續(xù)8周。

1.2.2 大鼠肝臟超聲檢查

檢查前準備：大鼠稱重并記錄，用10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于平板上，電動剃發(fā)刀去除腹部體毛。

超聲儀器：應用法國聲科Supersonic彩色超聲診斷儀，配有實時剪切波彈性成像（Shear wave elastrography，SWE）功能，選用線陣探頭，探頭頻率4～15MHz。

超聲檢測：①門靜脈內(nèi)徑，二維條件下清晰顯示門靜脈主干，凍結(jié)圖像，測量距門靜脈入肝處約0.5～0.75 cm、1.5～2.0 cm 處門靜脈內(nèi)徑，分別標記為門靜脈近段內(nèi)徑（Proximal diameter of portal vein，PDPV）與門靜脈遠段內(nèi)徑（Distal diameter of portal vein，DDPV），各測量 3 次，取平均值（圖 1a，1b）。 ②門靜脈血流速度 （Blood flow velocity of portal vein，VPV），二維條件下清晰顯示門靜脈主干，開啟CDFI模式，血流信號顯示穩(wěn)定后打開PW模式，頻譜穩(wěn)定狀態(tài)下凍結(jié)圖像，測量VPV，連續(xù)測量3次，取平均值（圖2）。③實時剪切波彈性成像（SWE）技術(shù)檢測肝組織楊氏模量，二維條件下清晰顯示肝臟右葉或左葉，開啟SWE模式，圖像穩(wěn)定后凍結(jié)圖像，選取ROI測量彈性值，以kPa為單位。圖像以ROI填充均勻一致的藍色時為準。啟動儀器提供的QBOX功能定量測量成像區(qū)域內(nèi)的肝臟楊氏模量值，設定Q－BOX區(qū)域直徑為3mm，測量3次并記錄楊氏模量平均值（圖3）。

1.2.3 病理學檢查

大鼠用生理鹽水進行心臟灌流，待灌流液清澈后切除肝脾組織稱重，取一小部分肝組織立刻以10%的甲醛固定48 h以上，石蠟包埋，間距4μm連續(xù)切片，HE染色。由病理科專業(yè)醫(yī)生對肝纖維化程度進行分析、判定。肝纖維化病理診斷參照《病毒性肝炎防治方案》[5]中的病理診斷標準，根據(jù)匯管區(qū)及周圍纖維化情況及小葉結(jié)構(gòu)，將纖維化程度從無到重分為S0～S4共5期。

1.3 統(tǒng)計學分析

圖1 門靜脈內(nèi)徑測量。圖1a為門靜脈近段內(nèi)徑，距門靜脈入肝處約0.5～0.75 cm；圖1b為門靜脈遠段內(nèi)徑，距門靜脈入肝處約1.5～2.0 cm。 圖2 門靜脈血流速度測量。血流信號顯示穩(wěn)定后打開PW模式，頻譜穩(wěn)定狀態(tài)下凍結(jié)圖像進行測量。 圖3 SWE采集成功超聲圖像。采集區(qū)域取樣框內(nèi)顏色均勻一致且定量測量區(qū)域Q－BOX內(nèi)顏色完全充滿。Figure 1. Measurement of portal vein diameter.Figure 1a:PDPV,about 0.5～0.75 cm from the position of portal vein entering liver;Figure 1b:DDPV,about 1.5～2.0 cm from the position of portal vein entering liver. Figure 2. VPV measurement:opening PW mode after steady flow signals,freezing image with steady－state spectrum. Figure 3. Ultrasound image of SWE acquisition:color of sampling frame in collection area is uniform and the quantitative measurement region of Q－BOX is completely filled with color.

2 結(jié)果

2.1 一般情況與病理改變

2.1.1 一般情況

大鼠死亡4只，其中模型組死亡2只，RES干預組死亡1只，RES組麻醉過程中死亡1只，對照組大鼠全部存活。對照組及RES組大鼠飲食、精神、活動正常，體質(zhì)量增長較快；模型組大鼠攝食、活動減少，精神萎靡，毛發(fā)發(fā)黃脫落，體質(zhì)量增長緩慢，后期出現(xiàn)下降；RES干預組癥狀與模型組相比，癥狀較輕，體質(zhì)量增長有所增加。大鼠體質(zhì)量變化曲線見圖4（末次體質(zhì)量因空腹24 h，未計入）。

圖4 不同組間大鼠體質(zhì)量變化曲線：對照組及RES組體質(zhì)量增長較快；模型組體質(zhì)量增長緩慢，后期出現(xiàn)下降；RES干預組與模型組相比體質(zhì)量增長有所增加。Figure 4.The changes of body weight among different groups.Body weight increased observably in control group and RES group,model group with slow weight growth but RES intervention could increase body weight.

2.1.2 病理改變

肝組織HE染色顯示對照組及RES組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞無變性、壞死；模型組大鼠肝組織小葉內(nèi)、小葉間有炎性細胞浸潤；匯管區(qū)因纖維組織增生伴有纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)不清楚，假小葉形成。RES干預組肝纖維化有不同程度的改善，結(jié)締組織增生減少，炎性浸潤程度減輕（圖5a～5d）。

2.2 超聲檢查結(jié)果

2.2.1 門靜脈內(nèi)徑

大鼠PDPV與DDPV在模型組與RES干預組較對照組與 RES 組增寬（P＜0.05），RES 干預組相對模型組增寬幅度有所減低，兩者在對照組與RES組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），門靜脈近段內(nèi)徑在模型組與RES干預組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而門靜脈遠段內(nèi)徑在模型組與 RES干預組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 1，圖 6）。

2.2.2 VPV

大鼠VPV在模型組與RES干預組較對照組與RES組均加快，RES干預組相對模型組加快幅度有所減低，但是在各組間比較差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 1，圖 6）。

2.2.3 SWE 楊氏模量

大鼠SWE楊氏模量在模型組與RES干預組較對照組與 RES 組均升高（P＜0.05），RES 干預組相對模型組升高幅度有所減低。在模型組與RES干預組間以及對照組與RES組間比較差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 1，圖 6）。不同組間 SWE 楊氏模量圖像采集測量見圖7a～7d。

圖5 不同組間病理改變。圖5a，5b：對照組及RES組大鼠肝組織無變性、壞死。圖5c：模型組大鼠肝組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤；匯管區(qū)及中央靜脈周圍纖維組織增生，出現(xiàn)纖維間隔，假小葉形成。圖5d：RES干預組大鼠肝纖維化出現(xiàn)不同程度的改善。大鼠肝組織HE染色。Figure 5. The histology changes of liver samples.Figure 5a,5b:Control group and RES group without degeneration and necrosis in liver tissue.Figure 5c:Rat liver tissue in model group showing inflammatory cell infiltration,hyperplasia of fibrous tissue around the portal area and central vein,fiber spacing and pseudolobule.Figure 5d:RES intervention group:varying degrees improvement of hepatic fibrosis.Liver tissues were stained with HE.

Table 1.Ultrasound comparison among different groups

3 討論

肝纖維化是一種正常微循環(huán)、血管解剖學和肝臟結(jié)構(gòu)被損壞，并有纖維化再生、纖維結(jié)節(jié)改變的肝病，肝硬化是肝臟纖維化的最后階段。肝組織活檢對肝纖維化判定最為可靠，目前仍是確診肝纖維化的最主要依據(jù)。本研究病理結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織可見肝細胞壞死，間質(zhì)纖維組織增生，形成假小葉；RES干預組肝細胞壞死減輕，雖然大鼠肝組織也顯示膠原纖維不同程度增生，但主要分布于肝臟間質(zhì)內(nèi)，無明顯假小葉形成。本研究驗證了RES有較好的抗肝纖維化的作用，其機理可能與保護肝細胞、減輕組織炎癥、抑制膠原纖維增生有關，我們會在下一步的分子生物學研究中進行探討。

圖 6 不同組間超聲結(jié)果比較，a：與對照組比較，P＜0.05；b：與 RES 組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.05。 PDPV 與 DDPV 在模型組與RES干預組較對照組與RES組均增寬，VPV在模型組與RES干預組較對照組與RES組均加快，楊氏模量在模型組與RES干預組較對照組與RES組均升高。RES干預組相對模型組變化幅度有所減低。Figure 6. Comparison of ultrasonic results among different groups.a:P＜0.05,vs control group;b:P＜0.05,vs RES group;c:P＜0.05,vs model group.Compared with the control group and RES group,PDPV and DDPV were widened,VPV and the Young’s modulus were increased in the model group and RES intervention group.The change of RES intervention group was lower than that of model group.

圖7 不同組間SWE楊氏模量采集測量。圖7a：對照組；圖7b：RES組；圖7c：模型組；圖7d：RES干預組。Figure 7.SWE image acquisition and measurement among different groups.Figure 7a:Control group;Figure 7b:RES group;Figure 7c:Model group;Figure 7d:RES intervention group.

既往研究表明，肝活檢會對受檢者產(chǎn)生創(chuàng)傷或潛在風險，嚴重危及生命，較難作為隨訪和療效觀察的檢查方法[6－7]，因此本實驗通過經(jīng)典CCl4藥物損傷構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，并以病理做為金標準，探討超聲量化指標評價RES對大鼠肝纖維化病理改變的影響。

肝臟發(fā)生纖維化改變時肝組織纖維間隔收縮，肝內(nèi)膽管周圍纖維組織及膽汁不同程度的淤積加重肝小葉周圍的機械壓力，使門靜脈的阻力增加，內(nèi)徑增寬。其次隨著肝纖維化的加重，纖維組織過度增生伴有間隔形成，導致側(cè)支循環(huán)建立，高壓的肝動脈血流入低壓的門靜脈內(nèi)使門靜脈壓力增高，導致內(nèi)徑增寬。溫小鳳等[8]、陳永鵬等[9]的研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加重，慢性肝炎患者門靜脈主干直徑逐漸擴張。我們預實驗研究發(fā)現(xiàn)，門靜脈隨著肝纖維化加重，PDPV與DDPV擴張程度存在差異，故本研究將門靜脈分成近段與遠段分別進行分析。隨著肝纖維化的加重，PDPV與DDPV均有增寬的趨勢，大鼠PDPV與DDPV在模型組與RES干預組較對照組與 RES 組均增寬（P＜0.05），可以起到很好的臨床提示作用，而RES干預組相對模型組增寬幅度有所減低，證明了RES對肝纖維化起到了預防保護作用。PDPV在模型組與RES干預組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 DDPV 在模型組與 RES 干預組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），雖然我們觀察到發(fā)生肝纖維化時，PDPV擴張不如DDPV明顯，但是從統(tǒng)計學意義上來講，其在療效觀察時或許更有意義。

隨著影像學技術(shù)的飛速發(fā)展，超聲彈性成像已成為一項無創(chuàng)性提供組織彈性這一基本力學屬性的全新技術(shù)。而在超聲彈性成像基礎上發(fā)展起來的SWE技術(shù)[10]是一種全新、無創(chuàng)、快速、簡單、客觀的定量檢測肝纖維化的方法。SWE技術(shù)通過檢測組織內(nèi)剪切波的速度獲得楊氏模量這一代表組織硬度的參數(shù)[11]，反映組織硬度。楊氏模量值越大，組織越硬[12]。本研究結(jié)果顯示大鼠SWE楊氏模量在模型組與RES 干預組較對照組均升高（P＜0.05），并且肝臟楊氏模量值隨肝纖維化程度的加重有增高的趨勢，與文獻[13－14]報道的結(jié)果一致，說明SWE測得的肝彈性模量值能夠反映肝組織硬度的變化，在評價肝纖維化的藥物療效中具有重要價值。

肝組織損傷和修復理論上會導致肝臟微循環(huán)動力學變化[15]。既往應用Doppler超聲判定肝纖維化或肝硬化的結(jié)果存在不一致性[2，16]。Hirata等[17]的研究結(jié)果表明隨著肝纖維化加重門靜脈阻力提升，流速會不同程度下降，但Bernatik等[18]通過研究不同程度肝病患者發(fā)現(xiàn)Doppler超聲不能很好的提示嚴重性。本研究結(jié)果表明大鼠VPV在模型組與RES干預組較對照組均加快，RES干預組相對模型組加快的幅度有所減低，但是在各組間比較差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。很難作為評價肝纖維化藥物療效及預后的有效手段。Doppler超聲對于判定肝纖維化存在較大差異，可能是因為取樣角度的不同，加之不同作者之間對于采樣位置的選擇也難以保證完全一致所致。

本研究無論從病理還是從超聲量化指標都證明了RES對肝纖維化具有預防保護作用，超聲檢測門靜脈內(nèi)徑與SWE楊氏模量可以有效評價RES對肝纖維化的影響，可以作為進一步評價肝纖維化藥物療效與預后的參考指標。本研究的局限性：樣本量少，易存在個體差異，可能導致組間差異存在統(tǒng)計學誤差；研究選取的動物模型，與人的肝纖維化病理改變存在差異，今后應擴大樣本量，并進行超聲量化指標臨床試驗的探討。

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Evaluation of the effect of resveratrol on liver fibrosis in rat by ultrasound quantitative index

SANG Liang,WANG Xue-mei,XU Dong-yang,SHANG Gong-qun,YUAN Sheng-mei,TU Shu-xing
(Department of Ultrasound,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective:To investigate the effection of resveratrol(RES)on the CCl4－induced liver fibrosis in rat model by ultrasound quantitative index.Methods:Twenty male Sprague－Dawley rats were random ly divided into four groups:control group,RES group,model group,and RES intervention group.The proximal and distal diameter,blood flow velocity of portal vein and liver tissue Young’s modulus were detected by ultrasonography.The degree of hepatic fibrosis was determined under light microscope after HE stained.Results:①After RES intervention,the symptoms of rats were mild with the weight increase,and the liver fibrosis was improved.②In model and RES intervention group,the portal vein proximal and distal diameter,Young’s modulus of liver tissue were increased compared with control and RES group(P＜0.05);The portal vein blood flow velocity was increased,but the differences among the groups were not statistically significant(P＞0.05).The changes of the portal vein diameter and Young’s modulus were decreased after RES intervention.There were no significant differences between the control and RES group(P＞0.05).Conclusion:①RES can effectively improve the pathological changes of CCl4－induced liver fibrosis.②Portal vein diameter and Young’smodulus can effectively evaluate the effect of RES on CCl4－induced liver fibrosis in rat.

Liver cirrhosis;Rats;Ultrasonography

R657.31；R445.1

A

1008－1062（2017）04－0255－05

2016－09－20；

2016－10－10

桑亮（1983－），男，山東壽光人，主治醫(yī)師。 E－mail：13889167622＠163.com

王學梅，中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲科，110001。 E－mail：wxmlmt＠163.com