昝珂 高宇明 崔淦 劉杰 過立農(nóng) 鄭健 馬雙成

[摘要]對云南重樓野生和栽培品的HPLC特征圖譜和主要皂苷含量進行比較，分析化學(xué)成分差異。以重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ等9種成分為對照品，采用Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）；乙腈（A）水（B）為流動相，梯度洗脫（0～50 min，30%～50%A；50～80 min，50% A，80～85 min，50%～30%A；85～100 min，30% A），流速1 mL·min-1，檢測波長為203 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，建立云南重樓野生品和栽培品的特征圖譜，并同時測定9種甾體皂苷的含量。野生品中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H的平均含量高于栽培品；重樓皂苷I的平均含量低于栽培品；4種偏諾皂苷平均含量總和顯著高于栽培品；5種薯蕷皂苷平均含量總和顯著低于栽培品。云南重樓栽培品和野生品化學(xué)成分具有一定的差異，使用中應(yīng)通過更多藥理和臨床試驗進一步研究。

[關(guān)鍵詞]云南重樓； 野生； 栽培； 特征圖譜； 甾體皂苷； 高效液相色譜； 含量測定

Comparative study on specific chromatograms and main active components of

wild and cultivated rhizomes of Paris polyphylla var yunnanensis

ZAN Ke1， GAO Yuming2， CUI Gan3， LIU Jie1， GUO Linong1，

ZHENG Jian1*， MA Shuangcheng1*

（1 National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China；

2 Ziyang Institute for Food and Drug Control， Ziyang 641300， China；

3 School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China）

[Abstract]The present study is to compare specific chromatograms and main acitive components between wild and cultivated rhizomes of Paris polyphylla var yunnanensis by HPLC HPLC analysis was performed on a Waters XSelect HSS T3 C18 clumn （46 mm×250 mm， 5 μm）， with a mobile phase consisting of acetonitrile （A）water （B） at a flow rate of 1 mL·min-1 （050 min，30%50%A；5080 min，50% A，8085 min，50%30%A；85100 min，30% A） The detection wavelength was 203 nm and the column temperature was controlled at 30 ℃， and the injection volume was 10 μL HPLC specific chromatograms of wild and cultivated rhizomes of P polyphylla var yunnanensis were established and nine steroidal saponins were simultaneously determined by the above method The mean contents of paris saponin Ⅶ， paris saponin H and total average contents of four pennogenyl saponins in Rhizomes of wild samples were significantly higher than those of cultivated ones However， this result is opposite from the average content of paris saponin Ⅰ and total average contents of five dioscins in the wild and cultivated samples Because the significant differences occurred for the specific chromatograms and main active components between the wild and cultivated P polyphylla var yunnanensis， much more pharmacological and clinical researches are therefore necessary.

[Key words]Paris polyphylla var yunnanensis； wild； cultivated； specific chromatograms； steroidal saponins； HPLC； content determination

重樓是《中國藥典》2015年版一部收錄品種，根莖入藥，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的功效[1]，是云南白藥、宮血寧和季德勝蛇藥等中成藥的重要原料。云南重樓Paris polyphylla Smith var yunnanensis（Franch） HandMazz是重樓的基原植物之一。因使用量不斷加大，生長周期較長，野生資源過度采集，現(xiàn)已趨于枯竭，目前市場上以栽培品為主。據(jù)文獻報道，甾體皂苷是重樓中的主要活性成分，現(xiàn)已從重樓屬植物中分離鑒定200多個甾體皂苷類成分，其苷元主要有薯蕷皂苷元、偏諾皂苷元。本研究中重樓皂苷Ⅶ，D，H，Ⅵ屬于偏諾皂苷；重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，薯蕷皂苷，纖細薯蕷皂苷屬于薯蕷皂苷[27]。采用HPLC或UPLC法測定重樓中甾體皂苷類成分有一些報道。目前，《中國藥典》含量測定項下控制重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ 共4種成分的總含量不少于060%。鄒亮等[8]采用HPLC測定了不同產(chǎn)地云南重樓中的4種重樓皂苷；李懿等[9]采用HPLC測定了云南重樓的6種皂苷。王永慧等[10]采用UPLC測定重樓藥材中重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ的含量；韓燕全等[11]采用UPLCELSD測定4種皂苷成分；張紹山等[12]采用UPLCELSD測定了云南重樓中7種甾體皂苷含量。本研究采用HPLC建立云南重樓野生品和栽培品的特征圖譜，并同時測定重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ共9種甾體皂苷的含量，為野生和栽培品的質(zhì)量評價提供參考。

1材料

11儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司），二極管陣列檢測器（安捷倫公司），QUINTIX3131CN型1/1萬電子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10萬電子天平（Sartorius公司），KQ300DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司），MilliQ純水儀（密理博公司）。

12試藥

對照品重樓皂苷Ⅶ（批號111593201303），重樓皂苷Ⅱ（批號111591201103），重樓皂苷Ⅵ（批號111592201303），重樓皂苷Ⅰ（批號111590201103）由中國食品藥品檢定研究院提供；對照品重樓皂苷H（批號C20J7G16481）由上海源葉生物科技有限公司提供；重樓皂苷D（批號151105）和重樓皂苷Ⅴ（批號150716）由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供，薯蕷皂苷（批號15110210）和纖細薯蕷皂苷（批號15181110）由北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司提供，HPLCDAD（面積歸一化法）檢測純度均大于980%。甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司），試驗用水為超純水。

13藥材

藥材采自產(chǎn)地，編號1～10為野生品，編號11～20為野生品。樣品經(jīng)中國食品藥品檢定研究院民族藥室鄭健研究員鑒定為百合科云南重樓P. polyphylla var. yunnanensis的干燥根莖。

2溶液的制備

21混合對照品溶液的制備

取重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解配制成上述9種成分分別含2 042，985，475，1 051，921，856，1 041，915，1 031 mg·L-1的混合對照品儲備液。取各對照品儲備液適量加甲醇配制成上述9種成分分別為1021，9850，4750，5255，4605，4280，5205，4575，5155 mg·L-1的混合溶液，即得。

22供試品溶液的制備

取本品粉末（過4號篩）05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足失重，搖勻，用022 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

3色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱Waters XSelect HSS T3 C18（46 mm×250 mm，5 μm）；乙腈（A）水（B）為流動相，梯度洗脫（0～50 min，30%～50%A；50～80 min，50% A，80～85 min，50%～30%A；85～100 min，30% A），流速1 mL·min-1，檢測波長為203 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

4特征圖譜

41云南重樓特征圖譜的建立

取云南重樓野生品（樣品1～10）和栽培品（樣品11～20）粉末，精密稱定，按22項方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別進樣測定，記錄80 min的HPLC色譜圖（圖1，2）。根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern化學(xué)計量學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)定樣品1為參照圖譜，將野生品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，生成云南重樓野生品的特征圖譜（圖3）；以樣品11為栽培品的參照圖譜，將栽培品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，生成云南重樓栽培品的特征圖譜（圖4）。

42特征峰的標定

根據(jù)10批云南重樓野生品的特征圖譜檢測結(jié)果，共標定9個特征峰。經(jīng)過與對照品比對，可知1號峰為重樓皂苷Ⅶ，2號峰為重樓皂苷D，3號峰為重樓皂苷H，4號峰為重樓皂苷Ⅵ，5號峰為重樓皂苷Ⅱ，6號峰為薯蕷皂苷，7號峰為纖細薯蕷皂苷，8號峰為重樓皂苷Ⅰ，9號峰為重樓皂苷Ⅴ。

43方法學(xué)考察

431精密度試驗精密吸取同一云南重樓供試品溶液（樣品1）10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。以重樓皂苷Ⅰ為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，采用科邁恩（北京）科技有限公司Chempattern化學(xué)計量學(xué)軟件進行評價，相似度為099，結(jié)果表明儀器精密度良好。

432穩(wěn)定性試驗精密吸取同一云南重樓供試品溶液（樣品1）10 μL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以重樓皂苷Ⅰ為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，采用Chempattern化學(xué)計量學(xué)軟件進行評價，相似度為099，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

433重復(fù)性試驗取同一批云南重樓樣品粉末（樣品1）6份，精密稱定，按22項方法分別制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別進樣測定，記錄色譜圖。以重樓皂苷I為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，采用Chempattern化學(xué)計量學(xué)軟件進行評價，相似度為099，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好。

44野生品和栽培品特征圖譜比較

從建立的特征圖譜比較，野生品中峰1～3、峰7均高于栽培品；峰8低于栽培品，峰6和9基本相同，峰4含量均較低。以云南重樓野生品的共有模式為參照圖譜，采用Chempattern化學(xué)計量學(xué)軟件，夾角余弦法計算相似度，野生品1～10的相似度分別為0574，0922，0888，0922，0597，0602，0620，0936，0655，0906；栽培品11～20的相似度分別為0793，0904，0473，0664，0751，0887，0631，0680，0719，0815。從相似度分析，云南重樓野生品和栽培品之間差別較大，但由于野生品和栽培品組內(nèi)差異也較大，從相似度無法區(qū)分野生品和栽培品。

5含量測定

51系統(tǒng)適用性試驗

按3項色譜條件進行檢測，以重樓皂苷Ⅰ計算理論塔板數(shù)大于6 000，分離度大于15，對照品溶液及供試品溶液的色譜圖（圖5）。

52方法學(xué)考察

521線性關(guān)系考察精密吸取混合對照品儲備液01，05，10，20，40 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得2～6號混標溶液；再取1號混標溶液2 mL置10 mL量瓶中用甲醇定容至刻度，搖勻，即得1號混標溶液。分別精密吸取上述1～6號混標溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，以各對照品質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（表1），表明各化合物在相應(yīng)線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

A 混合對照品溶液； B 野生品； C 栽培品。

522精密度試驗精密吸取21項混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ的峰面積的RSD分別為056%，045%，072%，063%，075%，041%，052%，063%，065%（n=6），表明儀器精密度良好。

523重復(fù)性考察取樣品粉末（野生樣品1）6份，分別按照22項方法制備供試品溶液，按3項色譜方法測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果各份供試品溶液的重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ的測定結(jié)果RSD（n=6）分別為11%，13%，14%，15%，093%，13%，086%，094%，17%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

524溶液穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（野生樣品1），分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定。結(jié)果重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅰ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ的峰面積的RSD（n=6）分別為032%，068%，075%，091%，035%，045%，074%，055%，081%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

525加樣回收試驗取已知含量的1號云南重樓野生品粉末6份，每份約025 g，置具塞錐形瓶中，精密加入各對照品溶液（重樓皂苷Ⅶ 6126 mg·L-1、重樓皂苷D 2955 mg·L-1、重樓皂苷H 5700 mg·L-1、重樓皂苷Ⅵ 4204 mg·L-1、重樓皂苷Ⅱ 6447 mg·L-1、薯蕷皂苷2568 mg·L-1、纖細薯蕷皂苷5205 mg·L-1、重樓皂苷Ⅰ 4575 mg·L-1和重樓皂苷Ⅴ 5155 mg·L-1）各1 mL，分別按照22項方法制備供試品溶液，按3項下色譜方法測定，記錄峰面積，計算回收率結(jié)果重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ平均加樣回收率（n=6）分別為9915%，9732%，9865%，1012%，9836%，9731%，9818%，1005%，1024%，RSD分別為13%，15%，11%，22%，13%，19%，14%，13%，24%。

526樣品含量測定分別取不同產(chǎn)地云南重樓藥材，按22項方法制備供試品溶液，再按3項色譜條件進行測定，用外標法計算樣品含量。結(jié)果見表2，3。

6討論

61色譜條件的選擇

本文采用梯度洗脫法分離云南重樓藥材栽培品中的9種主要甾體皂苷成分，80 min內(nèi)完成分離，重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ分離效果良好，符合含量測定要求。本文通過二極管陣列檢測器考察所測物質(zhì)紫外吸收，9種成分均為末端吸收，故選擇203 nm作為檢測波長。流動相比較了乙腈水和乙腈005%磷酸系統(tǒng)，乙腈水梯度洗脫各色譜峰均實現(xiàn)基線分離，能夠達到定量要求。

62提取條件的優(yōu)化

本實驗對不同提取方式（加熱回流和超聲）、提取溶劑（50%，70%甲醇和甲醇）及提取時間（30，45，60 min）和取樣量（02，05，10 g）進行考察，最終確定，稱取藥材粉末05 g，加甲醇25 mL加熱回流提取30 min為最佳提取條件。

63含量測定結(jié)果分析

野生品和栽培品中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅴ 9種甾體皂苷類成分含量差異較大，野生品和栽培品中組內(nèi)9種成分的含量也相差較大。從樣品測定總體結(jié)果來看，這9種成分中重樓皂苷D、重樓皂苷Ⅵ、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅴ在野生品和栽培品中含量均較低；野生品中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H的平均含量高于栽培品；重樓皂苷I的平均含量低于栽培品；4種偏諾皂苷平均含量總和顯著高于栽培品；5種薯蕷皂苷平均含量總和顯著低于栽培品；栽培品種9種甾體皂苷平均含量高于野生品。偏諾皂苷和薯蕷皂苷具有相反的藥理活性，薯蕷皂苷具有活血作用，偏諾皂苷具有止血作用[1314]，云南重樓栽培品可能更適合用于活血作用。

本研究建立云南重樓野生品和栽培品的特征圖譜，并同時測定9種甾體皂苷成分，并進行了比較分析，為云南重樓藥材質(zhì)量綜合評價提供了科學(xué)依據(jù)。云南重樓栽培品和野生品化學(xué)成分具有一定的差異，使用中應(yīng)通過更多藥理和臨床試驗進一步研究。

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[責(zé)任編輯丁廣治]