郝濤，馬沖，李保松，劉春遠(yuǎn)，蔣宏

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院結(jié)直腸腹壁疝外科，山東濱州256600）

Mob1a真核表達(dá)載體構(gòu)建方法及對MEN通路基因表達(dá)的影響研究

郝濤，馬沖，李保松，劉春遠(yuǎn)，蔣宏

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院結(jié)直腸腹壁疝外科，山東濱州256600）

目的探討Mobla真核表達(dá)載體構(gòu)建方法及對MEN通路基因表達(dá)的影響。方法利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增出Mobla編碼基因，將其構(gòu)建到真核表達(dá)Mobla載體上，利用脂質(zhì)體將構(gòu)建的真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，采用Western blot檢測Mobla蛋白是否表達(dá)，采用熒光素梅報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對MEN通路基因表達(dá)活性的影響。結(jié)果本研究成功構(gòu)建Mobla真核載體，經(jīng)過小鼠肝臟細(xì)胞轉(zhuǎn)染后能對其蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，Western blot顯示：Mobla質(zhì)粒在小鼠肝臟細(xì)胞中表達(dá)水平未見異常。熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)結(jié)果顯示：Mobla能抑制MEN通路基因信號，能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論采用PCR擴(kuò)增技術(shù)能成功擴(kuò)增、構(gòu)建出Mobla真核表達(dá)載體，并且對MEN通路基因表達(dá)存在一定的影響。

Mobla真核表達(dá)；構(gòu)建方法；MEN通路；基因表達(dá)；PCR擴(kuò)增技術(shù)

有絲分裂是一個(gè)多因素過程，如果有絲分裂調(diào)控中存在明顯的差錯(cuò)后，將會(huì)引起腫瘤[1]。有絲分裂退出途徑（Mitotic Exit Network，MEN）是一種相對完整的控制信號，能有效的調(diào)整信號的分裂退出途徑，并且經(jīng)過聯(lián)級放大后能有效的對有絲分裂的終末進(jìn)行有效的控制[2]。但是，細(xì)胞有絲分裂后期需要在紡錘體下進(jìn)行基因的重新組合，此時(shí)MEN則能激活退出信號，完成核定位操作，完成有絲分裂的退出[3]。細(xì)胞有絲分裂過程中，Dbf2-Mob1之間相互作用，磷酸化的Dbf2-Mob1作為效應(yīng)器促進(jìn)下游反應(yīng)[4]。

在芽殖酵母中，Mob1蛋白是有絲分裂退出途徑的重要因子，并可調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂。在人類癌細(xì)胞中，hMOB1的過表達(dá)激活LATS活性，抑制細(xì)胞增殖或引起凋亡。相反，短發(fā)夾（sh）RNA抑制hMOB1引起細(xì)胞增殖增加[5]。肝癌是人類癌癥死亡的第三大原因，患者預(yù)后較差，死亡率較高。目前對于Mob1a-shRNA真核表達(dá)載體，研究其在體外對肝細(xì)胞分裂的影響缺乏報(bào)道。本研究探討Mobla真核表達(dá)載體構(gòu)建方法及對MEN通路基因表達(dá)的影響，為肝癌的基因治療提供了新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑為了保證試驗(yàn)的順利完成，采用的主要儀器和試劑主要由CR及酶切產(chǎn)物純化試劑盒（Promega公司）、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（Promega公司）、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（Invitrogen公司）、CL顯色劑（Pierce）、雙熒光素酶檢測試劑盒（Invitrogen公司）、ECL顯影試劑（北京威格拉斯生物技術(shù)公司）等。

1.2 方法利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增出Mobla編碼基因，將其構(gòu)建到真核表達(dá)Mobla載體上，利用脂質(zhì)體將構(gòu)建的真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，采用Western blot檢測Mobla蛋白是否表達(dá)，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對MEN通路基因表達(dá)活性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用“n（%）”表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用“x±s”表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增出Mobla真核載體通過獲得Mobla真核序列，并且根據(jù)相關(guān)引物的長度設(shè)計(jì)有關(guān)引物，并且從既往報(bào)道中找出編碼基因，基恩GG一系列處理后完成真核表達(dá)的構(gòu)建，結(jié)果顯示：本課題中成功構(gòu)建Mobla真核載體。見圖1。2.2Mobla在真核細(xì)胞中的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示：Mobla質(zhì)粒在小鼠肝臟細(xì)胞中表達(dá)水平未見異常。見圖1、圖2。

2.3 Mobla真核能負(fù)調(diào)節(jié)MEN通路基因Mobla真核載體構(gòu)建后，容易引起細(xì)胞內(nèi)信號之間進(jìn)行相應(yīng)的傳遞，使得MEN通路基因發(fā)生明顯的變化。本課題中為了進(jìn)一步了解Mobla真核構(gòu)建后對MEN通路基因表達(dá)的影響，采用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：Mobla能抑制MEN基因信號通路，能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路轉(zhuǎn)錄活性。見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增出Mobla真核載體Figure 1 PCR was amplified by Mobla eukaryotic vector

圖2 Mobla真核能負(fù)調(diào)節(jié)MEN通路基因Figure 2 Mobla,true nuclear energy,negative regulation,MEN pathway,gene

3 討論

Mobl基因最早在芽殖酵母中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞的有絲分裂中發(fā)揮了重要的作用，能有效的參與、調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和增殖[6]。有絲分裂必須經(jīng)過信號復(fù)合物的組裝，這一過程的調(diào)控嚴(yán)格受時(shí)間和空間的控制。有絲分裂調(diào)控出錯(cuò)則引發(fā)腫瘤發(fā)生（tumorigenesis）。在芽殖酵母中，有絲分裂退出途徑(Mitotic Exit Network,MEN)是一套控制有絲分裂退出的信號途徑。在有絲分裂后期，MEN信號復(fù)合物觸發(fā)有絲分裂退出的信號。其中，磷酸化的Dbf2-Mob1作為效應(yīng)器促進(jìn)下游反應(yīng)。但是，哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞中這一通路如何發(fā)揮效應(yīng)尚屬未知。本研究發(fā)現(xiàn)Mobla能抑制MEN通路基因信號通路，能抑制TNF-a刺激引起的MEN通路轉(zhuǎn)錄活性。

目前，臨床上對于Mobl的功能尚不完全知曉，除了能實(shí)現(xiàn)MEN的調(diào)控外，還具備其他重要的功能。Hippo信號通路控制器官大小和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其失調(diào)與人類癌癥有關(guān)。Mobl構(gòu)成哺乳動(dòng)物肝臟中Hippo信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵中樞，限制肝細(xì)胞生長和維持肝細(xì)胞干/祖細(xì)胞靜止[7]。LATS激酶級聯(lián)是Hippo通路的核心。Mob1促進(jìn)LATS多步、順序過程的激活并有效地耦合同一級聯(lián)中兩個(gè)激酶的激活[8]hMOB1A可以作為腫瘤抑制劑在人類癌細(xì)胞中起作用[5,9]。MOB1A在黑素瘤和乳腺癌細(xì)胞系發(fā)生突變，在結(jié)腸直腸、非小細(xì)胞肺癌、皮膚癌中hMOB1下調(diào)或缺失。小鼠肝臟中的Mob1a/1b雙缺陷（LMob1DKO）導(dǎo)致超過一半的突變小鼠在出生的3周內(nèi)死亡，所有幸存者最終發(fā)展為肝癌。Mob1a/1b的缺失是小鼠肝臟腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)因子[10]。但是目前Mob1在人類肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制目前報(bào)道尚少。本課題以Mob1a基因作為肝細(xì)胞的有絲分裂生的靶基因，為肝細(xì)胞的有絲分裂研究提供了新的思路和方法，也為進(jìn)一步研究應(yīng)用控制MEN通路進(jìn)行肝癌的基因治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]劉學(xué)，李洪輝，王中華，等.牛MEN1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，24（3）：366-372.

[2]周鑫，占力，楊德吉，等.馬立克氏病病毒MEQ基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對CEF細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（11）：91-94.

[3]陳偉，徐衛(wèi)華.棉鈴蟲β-catenin基因的克隆、表達(dá)分析及真核表達(dá)載體構(gòu)建[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2015，37（2）：274-280.

[4]O'Brien FG，Eto KY，Murphy RJT，et al.Origin-of-transfer sequences facilitate mobilisation of non-conjugative antimicrobial-resistance plasmids inStaphylococcus aureus[J].Nucleic Acids Research,2015,43(16)：7971-7983.

[5]Chow A,Hao Y,Yang X.Molecular characterization ofhumanhomologsofyeastMOB1[J].International journal of cancer,2010,126(9)：2079-2089.

[6]蘇俊男.DZNep對Molt-4細(xì)胞株MOB1A/B基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9甲基化及其對該基因表達(dá)水平的影響[D].福建醫(yī)科大學(xué)，2013.

[7]Zhou D,Conrad C,Xia F,et al.Mst1 and Mst2 maintain hepatocyte quiescence and suppress hepatocellularcarcinomadevelopmentthroughinactivationof the Yap1 oncogene[J].Cancer cell,2009,16(5)：425-438.

[8]Ni L,Zheng Y,Hara M,et al.Structural basis for Mob1-dependent activation of the core Mst-Lats kinase cascade in Hippo signaling[J].Genes&development,2015,29(13)：1416-1431.

[9]Bardin AJ,Amon A.Men and sin：what's the difference?Nature reviews[J].Molecular cell biology,2001, 2(11)：815-826.11.

[10]Nishio M,Sugimachi K,Goto H,et al.Dysregulated YAP1/TAZ and TGF-beta signaling mediate hepatocarcinogenesisinMob1a/1b-deficientmice[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesofthe United States of America,2016,113(1)：E71-80.

Construction of Mob1a eukaryotic expression vector and its effect on MEN pathway gene expression

Hao Tao,Ma Chong,Li Bao-song,Liu Chun-yuan,Jiang Hong
(Department of Colorectal Hernia Surgery,Affiliated Hospital of Binzhou Medical College,Binzhou,Shandong,256600,China)

Objective To investigate the effects of Mobla eukaryotic expression vector construction method and the expression of MEN pathway genes.Methods PCR amplified Mobla gene encoding by PCR,cloned into eukaryotic expression vector Mobla,to construct the eukaryotic expression vector transfected stem cells by liposome was detected by Mobla Western blot is the expression,activity of fluorescent reporter gene expression on Al MEN pathway genes.Results This study successfully constructed Mobla eukaryotic vector after transfection in mouse liver cells can be carried out after the protein Western extraction,blot showed that the expression level of Mobla plasmid showed no abnormalities in mouse liver.The luciferase reporter gene into test results showed that Mobla could inhibit MEN signaling pathway genes,can inhibit the TNF-a pathway induced by stimulation of MEN transcriptional activity.Conclusion Using PCR amplification technique can be successfully amplified,construct the eukaryoticexpression vector Mobla and the expression of MEN pathway genes have a certain influence.

Mobla eukaryotic expression;Construction method;MEN pathway;gene expression;PCR

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.23.004

濱州市科技發(fā)展計(jì)劃（2014ZC0110）