金 勤 朱丹雪 周國(guó)英 李 河 何苑皞 張 茜,2

(1. 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004；2. 湖南汽車工程職業(yè)學(xué)院 株洲 412001)

綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV在油茶體內(nèi)的定殖*

金 勤1朱丹雪1周國(guó)英1李 河1何苑皞1張 茜1,2

(1. 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004；2. 湖南汽車工程職業(yè)學(xué)院 株洲 412001)

【目的】 枯草芽孢桿菌Y13UV對(duì)油茶炭疽病具有良好的防治效果，研究其在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)，為油茶炭疽病的防治提供依據(jù)?！痉椒ā?通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法引入綠色熒光蛋白質(zhì)粒，構(gòu)建熒光標(biāo)記菌株。通過(guò)噴葉、灌根、噴葉灌根結(jié)合處理多種接種方式及重復(fù)接種，測(cè)定菌株在油茶體內(nèi)不同組織部位的定殖數(shù)量，分析其定殖規(guī)律及能力?！窘Y(jié)果】 標(biāo)記菌株可以在油茶根、莖和葉內(nèi)定殖，單次接種當(dāng)天，根內(nèi)回收的標(biāo)記菌株數(shù)量為1.07×105cfu·g-1； 噴葉灌根結(jié)合處理7天后，油茶根、莖和葉內(nèi)標(biāo)記菌株的數(shù)量分別為8.70×102、5.00×102和7.30×102cfu·g-1，均高于噴葉、灌根單獨(dú)處理。重復(fù)接種時(shí)，油茶根莖葉內(nèi)標(biāo)記菌株的定殖量在接種3～5天內(nèi)達(dá)到高峰，然后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)， 20天時(shí)定殖量開(kāi)始大幅下降，第30天噴葉灌根處理的油茶根內(nèi)的定殖量?jī)H為5.30×102cfu·g-1。熒光標(biāo)記菌株生長(zhǎng)較好，穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)炭疽病菌具有良好的抑制效果?！窘Y(jié)論】 枯草芽孢桿菌Y13UV能通過(guò)噴葉灌根方式接種在油茶體內(nèi)定殖并傳導(dǎo)，有較好的定殖能力。

綠色熒光蛋白； 枯草芽孢桿菌； 油茶炭疽??； 定殖

在油茶(Camelliaoleifera)生產(chǎn)中，油茶炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是一種最主要的病害，在各大產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，造成嚴(yán)重的落葉、落果、落蕾，產(chǎn)量降低(楊華等， 2015)。目前，防治油茶炭疽病主要是采取化學(xué)防治和生物防治手段(陳彧等， 2010)。但大量使用化學(xué)農(nóng)藥容易導(dǎo)致植物病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，引起人畜中毒等問(wèn)題(周國(guó)英等， 2007)。國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于生物防治植物病害的報(bào)道。周建宏等(2011)通過(guò)對(duì)40多種植物進(jìn)行篩選，利用篩選出來(lái)的丁香(Syringaoblata)和黃苓(Scutellariabaicalensis)研制出了防治油茶炭疽病的純植物源農(nóng)藥。宋光桃(2009)從油茶林土壤中分離出了對(duì)油茶炭疽病具有拮抗作用的放線菌CF17。美國(guó)Agraquest公司(2001)將枯草芽孢桿菌QST713制成生物殺菌劑，具有廣譜性。

利用能夠在寄主植物體內(nèi)定殖的內(nèi)生拮抗菌對(duì)病害進(jìn)行防治具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(楊光道等， 2009)，實(shí)際應(yīng)用中拮抗作用強(qiáng)并不一定是最好的生防因子，生防菌能否在植株體內(nèi)定殖才是取得防效的關(guān)鍵。研究?jī)?nèi)生細(xì)菌定殖的常用方法有同位素示蹤法(葛銀林等， 1995)、免疫學(xué)方法(劉云霞等， 1996)、抗生素標(biāo)記法(吳藹民等， 2001)、熒光標(biāo)記法(殷幼平等， 2010)。熒光標(biāo)記中的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)熒光性能穩(wěn)定、無(wú)需外源反應(yīng)底物、對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒害作用、檢測(cè)方便，成為研究微生物與宿主或環(huán)境互作的重要工具(王卿等， 2015)。劉郵洲等(2014)發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在番茄(Lycopersiconesculentun)根際土壤中有一定的定殖能力，接種30天后仍可檢測(cè)到標(biāo)記菌株。杜芳等(2015)研究了枯草芽孢桿菌Y10在白菜(Brassicarapa)根、莖及葉部組織的定殖情況，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌在白菜體內(nèi)有良好的定殖能力，且這種特性可能與其防治根腫病有關(guān)。Yang等(2013)將攜帶質(zhì)粒gfpmut3a基因的穿梭載體pGFP4412 導(dǎo)入生防枯草芽孢桿菌中，通過(guò)浸種、蘸根以及灌根接種研究其在黃瓜(Cucummissativus)根表的定殖，發(fā)現(xiàn)在根基部和中部都有標(biāo)記菌株聚集而形成膜狀結(jié)構(gòu)，在根的分叉和根冠處可觀察到大量標(biāo)記菌株。關(guān)于綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌在油茶體內(nèi)定殖的研究，國(guó)內(nèi)目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

枯草芽孢桿菌Y13UV是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)誘變獲得的優(yōu)良菌株，本試驗(yàn)通過(guò)GFP標(biāo)記研究Y13UV在油茶體內(nèi)的定殖及消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，為提高Y13UV防治油茶炭疽病效果和制定施用方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株： 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Y13UV，本實(shí)驗(yàn)室分離、誘變保存。

供試質(zhì)粒和內(nèi)切酶： pHT315-GFP，高效表達(dá)綠色熒光蛋白基因的大腸桿菌(Escherichiacoli)一蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)穿梭載體，HindⅢ和XbaⅠ內(nèi)切酶均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

供試油茶苗： 湘林210品種，2年生健康盆栽苗，購(gòu)于湖南省林業(yè)種苗中心； 長(zhǎng)勢(shì)、苗高、大小一致。

1.2 GFP標(biāo)記菌株Y13UV的構(gòu)建及檢測(cè)

參考陳燕紅等(2014)的方法，本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建標(biāo)記菌株。

1.2.1 熒光顯微鏡檢測(cè) 挑取少許綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株菌體涂布固定，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下檢測(cè)(激發(fā)光波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)520 nm)，觀察有無(wú)熒光產(chǎn)生。

1.2.2 GFP標(biāo)記菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定 挑取GFP標(biāo)記菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h，按1%的接種量接種到100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，每隔4 h測(cè)定OD600值。

1.2.3 GFP標(biāo)記菌株抑菌活性測(cè)定 采用平板對(duì)峙法： 取炭疽病菌菌餅放在PDA平板中央，將GFP標(biāo)記菌株接種至距離炭疽病菌1.5 cm處，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。待朝向標(biāo)記菌株方向的病原菌菌落不再生長(zhǎng)時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.3 GFP標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)

1.3.1 單次接種監(jiān)測(cè)GFP標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 采用噴葉法、灌根法和噴葉灌根結(jié)合法接種標(biāo)記菌菌懸液，濃度為3.2×108cfu·mL-1，每處理3次重復(fù)，每處理100株，以無(wú)菌水處理為對(duì)照。噴葉法： 用噴霧器將菌液均勻地噴灑到油茶葉片上，每株10 mL； 灌根法： 將GFP標(biāo)記菌株菌液澆灌于油茶根部，每株10 mL； 噴葉灌根綜合法： 噴葉和灌根同時(shí)接種，分別為每株5 mL，共10 mL。分別于接種0，1，3，5，7天……對(duì)油茶根(主根與側(cè)根混勻)、莖(莖下： 地表3～8 cm莖部；莖中： 8～13 cm莖部；莖上： 13～20 cm莖部)、葉(從上往下不同部位的葉子混勻)進(jìn)行取樣回收，每處理隨機(jī)抽取3株，每份組織樣品0.5 g，直至回收不到標(biāo)記菌株。

1.3.2 重復(fù)接種監(jiān)測(cè)GFP標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 單次接種7天后，進(jìn)行第2次接種。采用的接種方法、菌液濃度及用量與1.3.1 相同。

分別于接種后1，3，5，10，15，20，30天對(duì)油茶根、莖、葉進(jìn)行取樣回收，每處理隨機(jī)抽取3株，每份組織樣品0.5 g，直至回收不到標(biāo)記菌株。

1.3.3 標(biāo)記菌株的回收與鑒定 分別稱取油茶苗根、莖、葉組織各0.5 g，經(jīng)表面消毒后研磨成勻漿，分別取0.1 mL各梯度稀釋液涂布LB氯霉素抗性平板，28 ℃培養(yǎng)2～3天，在熒光顯微鏡下觀察熒光菌落數(shù)。用接種環(huán)挑取單菌落到10 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)6 h，提取質(zhì)粒，用HindⅢ和XbaⅠ從GFP兩端切開(kāi)驗(yàn)證回收的菌株是否為標(biāo)記菌株。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用Excel 2007和SPSS19.0軟件處理，顯著性水平采用Duncan’s新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV的構(gòu)建及其檢測(cè)

2.1.1 綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌Y13UV的熒光檢測(cè) 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株構(gòu)建好之后，挑取標(biāo)記菌株于載玻片上涂布并固定，在熒光顯微鏡下檢測(cè)到菌株發(fā)熒光(圖1)，并將綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株記為Y13UV-GFP。

圖1 Y13UV-GFP在熒光顯微鏡下的表現(xiàn)Fig.1 Fluorescence under the fluorescence microscope of Y13UV-GFP

2.1.2 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Y13UV-GFP生長(zhǎng)曲線測(cè)定 從圖2可以看出，綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Y13UV-GFP的生長(zhǎng)趨勢(shì)與原始菌株Y13UV基本一致。這表明外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入以及綠色熒光蛋白的表達(dá)對(duì)菌株Y13UV生長(zhǎng)沒(méi)有產(chǎn)生不利影響。

圖2 Y13UV菌株及Y13UV-GFP標(biāo)記菌株生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Y13UV and Y13UV-GFP strains

2.1.3 綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株Y13UV-GFP的抑菌效果測(cè)定 從表1可知： 標(biāo)記菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV相比，對(duì)炭疽病的抑制效果無(wú)顯著差異，因此Y13UV-GFP可以用來(lái)進(jìn)行定殖動(dòng)態(tài)和生防能力的研究。

表1 標(biāo)記菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV的抑菌效果①

①平均數(shù)后相同字母表示無(wú)顯著性差異(P>0.05)。The same letter after the averages indicate there was no significant difference(P>0.05).

2.2 標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)

2.2.1 標(biāo)記菌株的回收與鑒定 從LB平板上挑取的Y13UV-GFP中提取出 pHT315-GFP(約7.2 kb)質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后可獲得與GFP片段(約714 bp)長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)钠?。由此可以確定回收到的菌株是Y13UV-GFP。如圖3： M為DL10000 marker，1為從回收菌株中提取的質(zhì)粒pHT315-GFP，2為HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后的產(chǎn)物。

2.2.2 單次接種監(jiān)測(cè)Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 如表2所示： 灌根處理當(dāng)天，油茶苗根部能夠檢測(cè)到Y(jié)13UV-GFP，其定殖數(shù)量高達(dá)1.07×105cfu·g-1。接種后第1天，在莖及葉組織可以檢測(cè)到標(biāo)記菌株； 莖上部位及葉片，定殖數(shù)量隨時(shí)間遞增逐漸減少。接種后第7天，葉片內(nèi)定殖數(shù)量顯著低于根部(P<0.05)； 并且回收的植株中，有的葉內(nèi)已經(jīng)檢測(cè)不到標(biāo)記菌株。表明Y13UV-GFP能夠通過(guò)油茶苗根部短時(shí)間內(nèi)侵入并向上傳遞，但定殖時(shí)間有限。

噴葉處理后，根、葉片、莖下部位的Y13UV-GFP定殖數(shù)量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。接種后第1天葉內(nèi)的定殖數(shù)量顯著高于灌根處理(P<0.05)； 莖上部位的定殖數(shù)量為1.1×103cfu·g-1，莖中部位僅有2.1×102cfu·g-1。在3，5，7天均出現(xiàn)了莖上部位的定殖量高于莖中，此現(xiàn)象在噴葉灌根結(jié)合處理后再次出現(xiàn)，且第7天回收的大部分油茶苗葉片內(nèi)檢測(cè)不到Y(jié)13UV-GFP，說(shuō)明通過(guò)葉部侵入的Y13UV-GFP有一定向下傳遞的能力。

噴葉灌根結(jié)合處理后，接種后1天根部定殖數(shù)量為2.00×104cfu·g-1，顯著高于灌根處理的數(shù)量3.00×103cfu·g-1(P<0.05)； 莖上部位的定殖數(shù)量高于莖中部位，此現(xiàn)象與噴葉方式處理相同。第7天根部定殖數(shù)量為8.70×102cfu·g-1，仍然高于灌根處理； 葉內(nèi)Y13UV-GFP定殖數(shù)量也高于噴葉處理的數(shù)量。

綜合來(lái)看，3種接種方式下Y13UV-GFP定殖量存在顯著性差異，噴葉灌根結(jié)合處理為最優(yōu)接種方式。

圖3 Y13UV-GFP酶切鑒定Fig.3 Enzyme identification of Y13UV-GFP

表2 單次接種情況下Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)①

①同一組織不同時(shí)間列中具有相同小寫字母的處理表示不同天數(shù)沒(méi)有達(dá)到顯著差異(P>0.05)The same column with the same letters are not significant difference on different day(P>0.05).

2.2.3 重復(fù)接種監(jiān)測(cè)Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 1) 灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 通過(guò)灌根處理，回收檢測(cè)結(jié)果顯示： 在油茶根莖葉組織中均可分離檢測(cè)到標(biāo)記菌株Y13UV-GFP，且根內(nèi)的定殖量顯著高于葉(P<0.05)。在接種初期，根內(nèi)的定殖量為3.73×103cfu·g-1，高于莖和葉中的定殖量。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，在根中的定殖量逐漸下降，在30天時(shí)僅有5.30×102cfu·g-1。在莖的各部位(莖下、莖中、莖上)和葉中的定殖量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，莖下部位定殖量在第3天達(dá)到高峰，而莖中、莖上和葉的高峰期均為第5天。各組織中標(biāo)記菌株的數(shù)量在第5～15天較為穩(wěn)定， 20天后數(shù)量迅速減少。在第30天時(shí)，根內(nèi)的數(shù)量高于莖內(nèi)各部位和葉。

圖4 灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)Fig.4 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by pouring root

2) 噴葉接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 采用噴葉法將標(biāo)記菌株Y13UV-GFP接入油茶苗后，回收檢測(cè)結(jié)果表明： 在接種后第1天，標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶葉內(nèi)的定殖數(shù)量為6.00×103cfu·g-1，然后迅速下降； 在無(wú)套袋處理、自然滴落的情況下，在接種1天后根部回收到的Y13UV-GFP數(shù)量為3.27×103cfu·g-1，與灌根處理的油茶根部第1天的回收量基本一致。莖內(nèi)各部位Y13UV-GFP的定殖量先增后減，莖下部的定殖量在第5天達(dá)到最大值1.60×103cfu·g-1，而莖中部和上部在第3天就達(dá)到最大值，3～10天莖上部位回收量均高于莖中部位。第30天時(shí)，根內(nèi)的數(shù)量高于葉和莖內(nèi)各部位； 葉內(nèi)Y13UV-GFP的定殖數(shù)量為4.00×102cfu·g-1，略高于灌根處理葉內(nèi)30天的定殖量。

圖5 噴葉接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)Fig.5 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by spraying leaf

3) 噴葉灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài) 通過(guò)噴葉灌根接種處理，根內(nèi)標(biāo)記菌株的定殖數(shù)量高于噴葉或灌根單獨(dú)處理的數(shù)量。在接種后第1天，根部標(biāo)記菌株Y13UV-GFP數(shù)量達(dá)8.67×103cfu·g-1，然后降低，第30天的數(shù)量與灌根接種處理的相同。莖各部位的定殖量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，高峰期分別為3天和5天。接種后1天，葉內(nèi)Y13UV-GFP的數(shù)量較高，第3天有所下降，第5天出現(xiàn)第2次高峰，之后下降。第30天時(shí)，葉內(nèi)的定殖量高于其他2種處理方式。

圖6 噴葉灌根接種標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)Fig.6 Colonization of Y13UV-GFP in Camellia oleifera by spraying leaf and pouring root

3 討論

采用噴葉法、灌根法、噴葉灌根結(jié)合法3種接種方法接種，均能使標(biāo)記菌株侵入油茶根莖葉內(nèi)，并在油茶植株體內(nèi)繁殖和傳導(dǎo)。單次接種時(shí)，3種接種方式下標(biāo)記菌株的定殖時(shí)間短，不同接種方式的定殖量存在差異。重復(fù)接種使標(biāo)記菌株在油茶體內(nèi)的定殖時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30天，噴葉灌根結(jié)合處理30天后，根部定殖量為5.3×102cfu·g-1，葉部為6.7×102cfu·g-1，莖各部(莖上、莖中和莖下)的定殖量均高于其他2種處理方法。經(jīng)酶切鑒定分析，回收菌株均為標(biāo)記菌株Y13UV-GFP。

王瑞芹(2014)用抗利福平標(biāo)記Y13菌株，雖然抗利福平標(biāo)記的菌株與綠色熒光蛋白標(biāo)記的菌株在油茶體內(nèi)定殖沒(méi)有顯著性差異，但抗性菌株接種到植物后，部分菌株會(huì)因?yàn)樵谥参矬w內(nèi)沒(méi)有了選擇壓力而在增殖過(guò)程中丟失了抗利福平的能力(范曉靜， 2007)，再者植物內(nèi)生菌有些也可能對(duì)利福平具有抗藥性，從而造成分離到的細(xì)菌數(shù)量不準(zhǔn)確，綠色熒光蛋白基因標(biāo)記就減小了分離菌量與實(shí)際定殖菌量的差異。

研究中發(fā)現(xiàn)，單次接種時(shí)Y13UV-GFP定殖時(shí)間短，重復(fù)接種時(shí)葉部回收并未出現(xiàn)5天和7天就已檢測(cè)不到標(biāo)記菌株的情況，由此猜想，重復(fù)接種的方式更易于內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)植株生境的適應(yīng)并穩(wěn)定定殖。重復(fù)接種延長(zhǎng)了Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖時(shí)間，也有報(bào)道(王卿等， 2015)指出強(qiáng)化接種1次可能會(huì)使生防菌保持一定的種群優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而將可能對(duì)植物有較長(zhǎng)的保護(hù)作用。 彭袆等(2010)研究發(fā)現(xiàn)多黏芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)能在番茄根表面形成生物膜，國(guó)外也有研究(Timmusketal., 2005)報(bào)道多黏芽孢桿菌可以在植物根尖形成生物膜，生物膜所包被的細(xì)菌群體，對(duì)不良環(huán)境有較強(qiáng)的耐受力(Costertonetal., 1995)。至于枯草芽孢桿菌Y13UV是否能在油茶根部形成生物膜則有待進(jìn)一步研究。

噴葉灌根結(jié)合處理30天后，葉片中的定殖數(shù)量比根部多，相比噴葉灌根單獨(dú)處理的效果好。出現(xiàn)這一結(jié)果，筆者分析其原因可能是綜合處理增強(qiáng)了菌株在葉內(nèi)的定殖效果。葉內(nèi)的標(biāo)記菌株包括從根部進(jìn)入并傳遞到葉片的標(biāo)記菌株和直接從葉片侵入的標(biāo)記菌株，更多的標(biāo)記菌株與其他內(nèi)生菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位，在油茶體內(nèi)繁殖，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。針對(duì)此結(jié)果，筆者展開(kāi)了后續(xù)試驗(yàn)，研究Y13UV菌株在油茶體內(nèi)定殖對(duì)葉內(nèi)微生物的影響。

國(guó)內(nèi)外研究表明，生防菌能否在植物體內(nèi)有效定殖是其發(fā)揮防病作用的重要因素(Kloepperetal., 1981； 連玲麗等， 2011)。本試驗(yàn)初步明確了Y13UV菌株能夠在油茶體穩(wěn)定定殖，不同部位定殖量也有較大差異，這說(shuō)明對(duì)特定部位有所偏好，可能與各部位分泌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)(李世貴等， 2009； 杜芳等， 2015)。本試驗(yàn)也只研究了Y13UV-GFP在油茶體內(nèi)的定殖動(dòng)態(tài)，能否在其他植物體內(nèi)穩(wěn)定定殖，進(jìn)而發(fā)揮防治效果，還需進(jìn)一步研究，為大范圍推廣Y13UV提供依據(jù)。

4 結(jié)論

將綠色熒光蛋白基因?qū)氲娇莶菅挎邨U菌Y13UV中，標(biāo)記菌株Y13UV-GFP在藍(lán)光激發(fā)下可以發(fā)出強(qiáng)而穩(wěn)定的綠色熒光、生長(zhǎng)好、具有較好的抑菌效果。標(biāo)記菌株可以通過(guò)灌根和噴葉的方式侵入油茶體內(nèi)，并進(jìn)行繁殖和傳導(dǎo)； 20天后達(dá)到穩(wěn)定定殖狀態(tài)，定殖時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30天，為制定枯草芽孢桿菌Y13UV的林間施用措施提供了理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Colonization of GFP-TaggedBacillussubtilisY13UVinCamelliaoleifera

Jin Qin1Zhu Danxue1Zhou Guoying1Li He1He Yuanhao1Zhang Qian1,2

(1.HunanProvincalKeyLaboratotyforControlofForestDiseaseandPestsKeyLaboratoryforNon-WoodForestCultivationandConservationofMinistryofEducationCentralSouthUniversityofForestandTechnologyChangsha410004；2.HunanAutomotiveEngineeringVocationalCollegeZhuzhou412001)

【Objective】BacillussubtilisY13UVcan controlColletotrichumgloeosporioideseffectively. Studying its colonization dynamics could provide a scientific basis for controllingC.gloeosporioides. 【Method】 The GFP plasmid was introduced into cells by protoplasts conversion and to acquire GFP-tagged Y13UV.Camelliaoleiferaplants were inoculated with the GFP-tagged Y13UVwith different methods including foliar spray, root irrigation, foliar spray plus root irrigation, and single or multiple inoculations. The population numbers of GFP-tagged Y13UVin different tissues ofCamelliaoleiferawere quantified after inoculations to test the colonization ability of the GFP-tagged strain. 【Result】 GFP-tagged Y13UVcould colonize in root, stem and leaf tissues ofCamelliaoleifera. In the same day after single inoculation, the population numbers of the marked strain in root were 1.07×105cfu·g-1. Seven days after inoculation by foliar spray plus root irrigation, the population of marked strain in root, stem and leaf tissues ofCamelliaoleiferawere 8.70×102, 5.00×102 and 7.30×102cfu·g-1, respectively. And the population numbers were higher than inoculation by foliar spray or root irrigation alone. With multiple inoculations, the population numbers of the tagged strain reached their peaks about 3-5 days after inoculation, the populations kept stable until they dropped dramatically 20 days after inoculation,. The population number of 30th day in root tissue ofCamelliaoleiferawas5.30×102cfu·g-1when inoculated by foliar spray plus root irrigation. The results showed that GFP-tagged Y13UVgrew better, expressed stably and still had good inhibition toC.gloeosporioides. 【Conclusion】 After inoculated by foliar spray or root irrigation, GFP-tagged Y13UVcould colonize and transfer inCamelliaoleifera, and displayed good colonization ability.

green fluorescent protein(GFP)；Bacillussubtilis；Colletotrichumgloeosporioides； colonization

10.11707/j.1001-7488.201707012

2016-04-08；

2016-12-26。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2012BAD19B0803)； 湖南省研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX2015B294)； 中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX2015B15)。

S763.13

A

1001-7488(2017)07-0111-07

* 周國(guó)英為通訊作者。