李 楠 鄭勇奇 丁紅梅 柳新紅 盛煒彤 江 波 李海波

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 杭州310023； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053)

低溫脅迫下短枝木麻黃耐寒相關(guān)基因的差異表達(dá)分析*

李 楠1,2鄭勇奇1丁紅梅3柳新紅2盛煒彤1江 波2李海波2

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 杭州310023； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053)

【目的】 對(duì)6個(gè)耐寒相關(guān)調(diào)控基因(RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6和HSP18.2)在耐寒和不耐寒木麻黃種質(zhì)中精細(xì)表達(dá)模式進(jìn)行分析，為深入解析木麻黃耐寒的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā?測(cè)定耐寒(ZS7)和不耐寒(HN1)2種短枝木麻黃無(wú)性系在-2 ～-11 ℃低溫脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率，基于Logistic方程對(duì)處理溫度和對(duì)應(yīng)的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行擬合，計(jì)算低溫半致死溫度(LT50)。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的6個(gè)耐寒相關(guān)調(diào)控基因的EST序列設(shè)計(jì)特異引物，利用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析6個(gè)基因在-2，-5，-8 ℃連續(xù)3個(gè)溫度梯度脅迫下的表達(dá)差異，以及在-5 ℃低溫下連續(xù)脅迫1，2，5，8，16，24，48，72 h后，在耐寒和不耐寒短枝木麻黃無(wú)性系中的精細(xì)表達(dá)模式?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法?！窘Y(jié)果】 在低溫脅迫下，耐寒和不耐寒短枝木麻黃無(wú)性系的相對(duì)電導(dǎo)率存在極顯著差異(P<0.01)，低溫半致死溫度分別為-5.92 ℃和-2.87 ℃。在常溫條件下，6個(gè)基因在耐寒和不耐寒種質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量皆無(wú)明顯差異。在臨近不耐寒種質(zhì)半致死溫度的-2 ℃下持續(xù)2 h后，6個(gè)耐寒相關(guān)基因在不耐寒種質(zhì)中的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制，而在耐寒種質(zhì)中的表達(dá)被激活； 在臨近耐寒種質(zhì)半致死溫度的-5 ℃下持續(xù)2 h后，不耐寒種質(zhì)中的各基因被進(jìn)一步抑制，同時(shí)在耐寒種質(zhì)中的表達(dá)亦被強(qiáng)烈抑制； 在低于半致死溫度的-8 ℃下持續(xù)2 h后，各基因的表達(dá)繼續(xù)受到抑制。對(duì)在臨近耐寒種質(zhì)半致死溫度的-5 ℃脅迫下，耐寒種質(zhì)和不耐寒種質(zhì)的精細(xì)表達(dá)模式分析表明，在-5 ℃低溫脅迫下，耐寒種質(zhì)中6個(gè)基因的表達(dá)在8 h后開(kāi)始呈現(xiàn)極顯著上調(diào)，表達(dá)量最高值集中在低溫脅迫后的第8，24，48 h； 不耐寒種質(zhì)中6個(gè)基因的表達(dá)在1～16 h內(nèi)皆呈現(xiàn)極顯著下調(diào)，表達(dá)量最低值集中在1～5 h內(nèi)?！窘Y(jié)論】 在耐寒相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平上，耐寒和不耐寒短枝木麻黃對(duì)低溫的應(yīng)答機(jī)制明顯不同。低溫激活了耐寒種質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子、ROS家族基因、ROS應(yīng)答因子等調(diào)控基因的增強(qiáng)表達(dá)以抵御和適應(yīng)逆境脅迫，但抑制了在不耐寒種質(zhì)中的表達(dá)，顯著降低了不耐寒種質(zhì)對(duì)低溫逆境的耐受能力。該研究在一定程度上對(duì)于豐富木麻黃適應(yīng)低溫的分子機(jī)制，以及耐寒無(wú)性系的分子選育都具有一定的參考價(jià)值。

短枝木麻黃； 低溫凍害； 耐寒性； 基因表達(dá)； 分子選育

木麻黃科 (Casuarinaceae) 植物包含了4個(gè)屬96個(gè)種(Wilsonetal.,1989)，為常綠喬木或灌木，該科植物常被統(tǒng)稱為木麻黃，天然分布于東南亞地區(qū)、太平洋西南群島和澳大利亞地區(qū)。我國(guó)自20世紀(jì)50年代從國(guó)外引進(jìn)木麻黃，目前已擁有人工林30萬(wàn)hm2(仲崇祿等， 2005)。短枝木麻黃(Casuarinaequisetifolia)、細(xì)枝木麻黃(C.cunninghamiana)、粗枝木麻黃(C.glauca)和山地木麻黃(C.junghuhniana)是我國(guó)人工栽培面積最廣泛的4個(gè)種(Zhongetal., 2010)。木麻黃植物對(duì)我國(guó)沿海陸地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)、沿海自然災(zāi)害的防御、貧瘠沿海沙地和嚴(yán)重退化的南方山區(qū)丘陵地區(qū)的土壤改良等均有重要作用，特別在沿海前沿沙質(zhì)地帶仍是無(wú)可替代的樹(shù)種(陳彥等， 2005； 張?jiān)粕龋?2002； 仲崇祿等， 2005)。浙江省自20世紀(jì)60年代開(kāi)始向臺(tái)州、寧波、舟山沿海地區(qū)引種，短枝木麻黃已經(jīng)成為浙江省海岸線的重要防護(hù)林樹(shù)種(何貴平等， 2011； 張昕等， 2011)。然而，木麻黃生長(zhǎng)適溫在22.1～26.9 ℃，耐寒性較差(Duke, 1983)。引種的木麻黃常遭受較嚴(yán)重凍害，給沿海防護(hù)林建設(shè)造成較大損失。低溫凍害已成為了擴(kuò)大木麻黃種植范圍和推進(jìn)沿海防護(hù)林建設(shè)的主要制約因素。因此，研究木麻黃的耐寒機(jī)制和性能，提高木麻黃的耐寒適應(yīng)性，推進(jìn)木麻黃耐寒品種的選育，是當(dāng)前沿海防護(hù)林工程建設(shè)中迫切需要解決的瓶頸問(wèn)題。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)木麻黃樹(shù)種耐寒性的研究基本上還停留在抗性生理指標(biāo)的測(cè)定分析以及對(duì)耐寒無(wú)性系或?qū)嵣缣镩g選育的階段，從分子水平上對(duì)木麻黃耐寒機(jī)制的研究非常匱乏(仲崇祿等， 1998； 柯玉鑄等， 2000； 葉功富等， 2004； 2008； 王泳等， 2005； 薛揚(yáng)等， 2008； 2012； 何貴平等， 2011； 張勇等， 2011； 武沖等， 2012； 鄔金等， 2013)。第2代高通量測(cè)序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組具有快速得到基因表達(dá)譜變化、精確分析轉(zhuǎn)錄本的SSR、SNP位點(diǎn)和可變剪接變異，以及發(fā)現(xiàn)低豐度轉(zhuǎn)錄本和新轉(zhuǎn)錄本的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于植物冷適應(yīng)和低溫響應(yīng)機(jī)制的研究(Marionietal., 2008； Lietal., 2012； Toralesetal., 2013； Tianetal., 2013； Wangetal., 2014)。鑒于這一優(yōu)勢(shì)，為了從低溫應(yīng)答基因的表達(dá)水平上全面解析木麻黃的耐寒機(jī)制，在前期研究中對(duì)從浙江省舟山選育出的短枝木麻黃耐寒無(wú)性系(ZS7)在低溫脅迫過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定出了一批與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物合成、次生代謝以及抗氧化酶等代謝途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中包括64個(gè)與耐寒相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族基因、20個(gè)與耐寒相關(guān)的ROS家族基因成員和24個(gè)在低溫脅迫下的ROS應(yīng)答基因(Lietal., 2017)。為了進(jìn)一步了解這些差異表達(dá)基因在低溫脅迫過(guò)程中的精細(xì)表達(dá)規(guī)律，在本研究中，選用短枝木麻黃耐寒無(wú)性系ZS7和不耐寒無(wú)性系HN1為種質(zhì)材料，通過(guò)電導(dǎo)率和致死溫度來(lái)反映不同耐寒種質(zhì)在生理水平上的差異，并進(jìn)一步從分子水平上，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative Real-Time PCR，qPCR)研究不同耐寒種質(zhì)在低溫脅迫過(guò)程中的基因表達(dá)規(guī)律及表達(dá)差異，以期為深入解析木麻黃的耐寒機(jī)制提供參考，為推進(jìn)木麻黃耐寒品種分子選育提供有價(jià)值的候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以來(lái)自舟山的短枝木麻黃耐寒無(wú)性系ZS7和海南的不耐寒無(wú)性系HN1為供試材料。用于生理測(cè)試的供試材料種植于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院苗圃，各取5株1年生無(wú)性系正常生長(zhǎng)的枝條(包括葉和小枝)用于低溫梯度脅迫試驗(yàn)(王泳等， 2005； 何貴平等， 2011)。低溫脅迫試驗(yàn)?zāi)M自然界降溫過(guò)程，先將供試材料在低溫人工氣候箱(PRXD-300，上海喬躍)中從常溫(RT)預(yù)冷至10 ℃左右，之后逐步降溫至-2，-5，-8，-11 ℃，在降至每個(gè)低溫節(jié)點(diǎn)持續(xù)2 h后，各取出12個(gè)枝條測(cè)定電導(dǎo)率和致死溫度。12個(gè)枝條等分為3份作為3個(gè)重復(fù)。

用于分子試驗(yàn)的供試材料采用盆栽方式，在浙江省林業(yè)科學(xué)研究院溫室進(jìn)行扦插繁殖。塑料盆尺寸為13 cm(高)×20 cm(直徑)。盆栽基質(zhì)為泥炭和蛭石混合物(4∶1)，裝盆前進(jìn)行滅菌處理。培養(yǎng)條件為： 光照16 h，溫度25 ℃，光強(qiáng)180 μmoL·m-2s-1，相對(duì)濕度60%～70%。在溫室中培養(yǎng)2個(gè)月后，扦插苗高度達(dá)到15～20 cm時(shí)，選取生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)較一致的植株，開(kāi)始低溫處理。Ⅰ)低溫梯度處理設(shè)計(jì)： 參照上述用于電導(dǎo)率測(cè)定的低溫梯度脅迫試驗(yàn)。將ZS7和HN1無(wú)性系置于低溫人工氣候箱中，從常溫(RT)預(yù)冷至10 ℃左右，之后逐步降溫至-2，-5，-8 ℃，在降至每個(gè)低溫節(jié)點(diǎn)持續(xù)2 h后，各取出5株，取幼嫩枝條用錫箔紙包裹后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。以在常溫25 ℃下同步培養(yǎng)的ZS7和HN1無(wú)性系作為2種低溫處理的對(duì)照，取樣方法同上。將每次取樣的5株幼嫩枝條剪碎后混合，等分為3份作為3個(gè)重復(fù)，用于RNA的提取、qPCR試驗(yàn)。Ⅱ)連續(xù)低溫處理設(shè)計(jì)： 將ZS7和HN1無(wú)性系各40株移入低溫人工氣候箱內(nèi)，在-5 ℃下連續(xù)處理1，2，5，8，16，24，48，72 h，并于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取ZS7和HN1的5株幼嫩枝條，用錫箔紙包裹后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 電導(dǎo)率、致死溫度測(cè)定 細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)法(劉會(huì)超等， 2008； 李迎春等， 2012)。應(yīng)用Logistic方程y=k/(1+ae-bx)對(duì)處理溫度和對(duì)應(yīng)的相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行擬合，并得出低溫半致死溫度LT50(朱根海等， 1986)。式中：y為低溫處理下的相對(duì)電導(dǎo)率；x為處理溫度；k、a和b均為方程的參數(shù)，k為y的最大極限值，b反映了x和y之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，a表示曲線對(duì)原點(diǎn)的相對(duì)位置。推導(dǎo) Logistic 方程的二階導(dǎo)數(shù)并令其為零，計(jì)算方程的拐點(diǎn)溫度 LT50。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 采用離心柱型RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒(TIANGE，北京天根)提取短枝木麻黃幼嫩枝條的總RNA，提取方法參照試劑盒的操作說(shuō)明?？俁NA樣品經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó)熱電)測(cè)定濃度及純度。將質(zhì)量檢測(cè)合格的總RNA樣品用于qPCR反應(yīng)合成cDNA。cDNA合成采用進(jìn)行qPCR反應(yīng)的專(zhuān)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TAKARA，大連寶生)，逆轉(zhuǎn)錄方法參照試劑盒的操作說(shuō)明。

1.2.3 qPCR候選基因與引物設(shè)計(jì) 用于qPCR分析的6個(gè)差異表達(dá)基因及特異引物見(jiàn)表1。選擇組成型表達(dá)的UBCE(ubiquitin-conjugating enzyme)作為內(nèi)參基因。特異引物的設(shè)計(jì)利用Oligo 6.54軟件(MBI，USA)。引物合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)(TSINGKE)有限公司完成。

1.2.4 qPCR qPCR分析在ABI ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI ViiA 7 Real Time PCR System，Applied Biosystems，USA)上進(jìn)行，采用ABI SYBR? Select Master Mix試劑盒，方法參照試劑盒的操作說(shuō)明。具體為，在20 μL的反應(yīng)體系中，包含2×SYBR? Select Master Mix 10 μL、Forward Primer (10 pmol·μL-1) 1 μL、Reverse Primer (10 pmol·μL-1) 1 μL、cDNA模板1 μL、RNase Free ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸各40 s，共50個(gè)循環(huán)。每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)3次。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性： 將該反應(yīng)體系從60 ℃緩慢升溫至95 ℃，每升高1 ℃采集5次熒光信號(hào)。

表1 用于本研究的短枝木麻黃候選基因及qPCR引物①

①R2表示標(biāo)準(zhǔn)曲線(cDNA模板濃度與CT值)的相關(guān)系數(shù)。R2represent the correlation coefficient of standard curve (cDNA templet concentration and circulated threshold).

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCT法計(jì)算qPCR試驗(yàn)中的基因相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為： 基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT。其中，ΔΔCT計(jì)算公式為： ΔΔCT=ΔCT(試驗(yàn)組)-ΔCT(對(duì)照組)； 試驗(yàn)組或?qū)φ战M的ΔCT計(jì)算公式為： ΔCT=CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)。為了驗(yàn)證qPCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，將cDNA模板濃度經(jīng)5倍梯度稀釋?zhuān)媚康幕蚺c內(nèi)參基因的qPCR引物進(jìn)行擴(kuò)增得到CT值，每個(gè)模板重復(fù)3次，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)和斜率(slope)，計(jì)算得到擴(kuò)增效率E=10-1-slope-1。利用Excel 2010、Origin 7.5和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同耐寒型短枝木麻黃無(wú)性系在低溫脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率變化

低溫引起的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致植物低溫?fù)p傷和死亡的根本原因。相對(duì)電導(dǎo)率可作為鑒定植物耐寒性的指標(biāo)。在低溫脅迫下，2種供試材料的相對(duì)電導(dǎo)率變化見(jiàn)圖1。短枝木麻黃耐寒無(wú)性系ZS7和不耐寒無(wú)性系HN1葉片的相對(duì)電導(dǎo)率均隨溫度的降低而升高，總體呈S型曲線的變化趨勢(shì)。在每個(gè)脅迫溫度下，ZS7和HN1的相對(duì)電導(dǎo)率均存在極顯著差異(P<0.01)。在-2 ℃到-8 ℃脅迫期間，耐寒ZS7的相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度較大，在-8 ℃到-11 ℃趨于緩慢。不耐寒HN1在-2 ℃到-5 ℃相對(duì)電導(dǎo)率迅速升高，在-5 ℃到-11 ℃趨于緩慢。該結(jié)果表明，HN1在-5 ℃下細(xì)胞膜透性已經(jīng)遭到破壞，呈不可逆的狀態(tài)，而耐寒ZS7相對(duì)電導(dǎo)率的變化從-8 ℃才開(kāi)始趨緩，表明耐寒ZS7葉片的質(zhì)膜穩(wěn)定性比不耐寒HN1高，受低溫傷害程度較輕，體現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐寒性。

圖1 低溫脅迫下2種短枝木麻黃無(wú)性系葉片的相對(duì)電導(dǎo)率變化Fig.1 Changes of relative electric conductivity in leaves of two Casuarina equisetifolia clones under low temperature stress同一曲線不同小寫(xiě)字母和大寫(xiě)字母分別表示該無(wú)性系葉片在不同溫度下相對(duì)電導(dǎo)率之間差異顯著(P<0.05)、極顯著(P< 0.01)。Different small and capital letters in the same curve represent significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01) difference between relative electric conductivity in leaves of the clone at various temperatures, respectively．

2.2 不同耐寒性短枝木麻黃無(wú)性系的低溫半致死溫度

低溫半致死溫度(half-lethal temperature，LT50)是指電解質(zhì)滲出率達(dá)到50%時(shí)的溫度，可用于評(píng)價(jià)一個(gè)物種的耐寒性強(qiáng)弱。表 2 所示為2種短枝木麻黃無(wú)性系的Logistic方程及低溫半致死溫度。耐寒無(wú)性系ZS7和不耐寒無(wú)性系HN1的擬合度分別為0.998和0.997，都達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)，說(shuō)明擬合的Logistic方程可靠性強(qiáng)。根據(jù)Logistic方程進(jìn)一步計(jì)算得到ZS7和HN1的低溫半致死溫度(LT50)分別為-5.92 ℃和-2.87 ℃，由此進(jìn)一步證明了ZS7比HN1具有更強(qiáng)的耐寒能力，也為后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展耐寒相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)模式分析提供了參考溫度。

表2 低溫脅迫下2種短枝木麻黃無(wú)性系相對(duì)電導(dǎo)率回歸方程及半致死溫度①

①**: 極顯著差異 Highly significant (P< 0.01).

2.3 低溫脅迫下各耐寒相關(guān)基因的表達(dá)分析

2.3.1 低溫梯度脅迫下耐寒相關(guān)基因的表達(dá) 為了進(jìn)一步了解木麻黃應(yīng)答低溫脅迫的分子機(jī)制，選取了在前期轉(zhuǎn)錄組研究中鑒定出的6個(gè)耐寒相關(guān)調(diào)控基因(Lietal., 2017)，分別代表了轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)家族基因成員(包括RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44)、ROS家族基因成員(GRXC6)和ROS應(yīng)答基因(HSP18.2)，基于qPCR分析耐寒相關(guān)基因的精細(xì)表達(dá)規(guī)律(表1)。本研究以ZS7和HN1的LT50(-5.92 ℃和-2.87 ℃)為參考，設(shè)置在達(dá)到LT50前的-2 ℃、-5 ℃以及降至LT50后的-8 ℃共3個(gè)低溫梯度來(lái)分析各個(gè)基因表達(dá)模式。

在qPCR試驗(yàn)中，6個(gè)耐寒相關(guān)調(diào)控基因和1個(gè)內(nèi)參基因的溶解曲線均呈單一峰值擴(kuò)增。根據(jù)濃度梯度稀釋擴(kuò)增得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，擴(kuò)增效率介于97.27%～108.05%，表明所有qPCR引物的擴(kuò)增具有高特異性，且擴(kuò)增效率一致，滿足利用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

圖2所示為在常溫下和連續(xù)低溫梯度-2，-5，-8 ℃脅迫下，6個(gè)耐寒相關(guān)基因RAP2.7，ABR1，GRXC6，AtbZIP44，AtHSFA6B和HSP18.2在耐寒無(wú)性系ZS7和不耐寒無(wú)性系HN1中的表達(dá)情況。從總體上來(lái)看，耐寒無(wú)性系ZS7中各基因(除RAP2.7基因外)在低溫梯度脅迫下的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，而不耐寒無(wú)性系HN1的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。在常溫條件下，這6個(gè)基因在ZS7和HN1無(wú)性系中的相對(duì)表達(dá)量皆無(wú)明顯差異。在降至-2 ℃后，5個(gè)基因(ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6，HSP18.2)在ZS7中的表達(dá)量均極顯著高于常溫，而RAP2.7基因的表達(dá)顯著降低； 6個(gè)基因在HN1的表達(dá)量均極顯著低于常溫； 各基因的表達(dá)量在ZS7中均極顯著高于在HN1中。這表明在HN1臨近半致死狀態(tài)下，這6個(gè)耐寒相關(guān)基因在不耐寒種質(zhì)HN1中的表達(dá)被強(qiáng)烈抑制，而在耐寒種質(zhì)ZS7中的表達(dá)被激活，說(shuō)明當(dāng)外界環(huán)境從常溫降到-2 ℃時(shí)，短枝木麻黃為了抵御和適應(yīng)低溫脅迫造成的傷害，快速啟動(dòng)低溫應(yīng)答機(jī)制，激活了耐寒相關(guān)基因的增強(qiáng)表達(dá)。

在降至-5 ℃后，各基因在2種無(wú)性系中的表達(dá)均被抑制，且除RAP2.7和AtbZIP44基因在ZS7和HN1中的表達(dá)量無(wú)明顯差異外，其余4個(gè)基因在ZS7中的表達(dá)量均極顯著高于HN1。這表明當(dāng)降至臨近ZS7的半致死溫度下，不耐寒種質(zhì)HN1中的各基因被進(jìn)一步抑制，同時(shí)在耐寒種質(zhì)ZS7中的表達(dá)亦被強(qiáng)烈抑制，這也許表明當(dāng)溫度繼續(xù)下降至臨近LT50的-5 ℃時(shí)，即短枝木麻黃處于組織所受傷害不可逆轉(zhuǎn)的溫度節(jié)點(diǎn)，低溫脅迫導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲量增多，相對(duì)電導(dǎo)率迅速升高(圖1)，使其對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制受到影響，導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)耐寒調(diào)控基因的表達(dá)受到抑制，因而有必要對(duì)在該溫度脅迫下的精細(xì)表達(dá)模式進(jìn)一步研究。在降至低于半致死溫度的-8 ℃后，伴隨著明顯凍害癥狀的出現(xiàn)，葉片嚴(yán)重萎蔫，各基因的表達(dá)繼續(xù)受到抑制。

圖2 短枝木麻黃耐寒相關(guān)基因在常溫(RT)和低溫梯度脅迫下的表達(dá)Fig.2 The expression of cold resistance related genes in Casuarina equisetifolia under normal(RT) and successive low temperatures**代表基因的表達(dá)在無(wú)性系ZS7和HN1之間達(dá)極顯著差異(P<0.01)。** represent highly significant (P<0.01) difference between genes in two clones.

圖3 短枝木麻黃耐寒相關(guān)基因在常溫(RT)和連續(xù)低溫(-5 ℃)脅迫下的表達(dá)模式Fig.3 The expression of cold resistance related genes in Casuarina equisetifolia under normal(RT) and low temperature (-5 ℃) conditions for 1～72 h

2.3.2 連續(xù)低溫脅迫下耐寒相關(guān)基因的表達(dá) 為了進(jìn)一步明確短枝木麻黃在臨近半致死溫度時(shí)6個(gè)耐寒相關(guān)基因的精細(xì)表達(dá)模式，對(duì)2種無(wú)性系在-5 ℃低溫脅迫下持續(xù)1，2，5，8，16，24，48，72 h的表達(dá)進(jìn)行比較分析。圖3所示為在連續(xù)-5 ℃低溫脅迫下，RAP2.7，ABR1，AtHSFA6B，AtbZIP44，GRXC6和HSP18.2基因在耐寒無(wú)性系ZS7和不耐寒無(wú)性系HN1中的表達(dá)模式。在常溫條件下，各基因在ZS7和HN1無(wú)性系中的相對(duì)表達(dá)量皆無(wú)明顯差異，但在-5 ℃低溫脅迫下存在顯著不同。在ZS7中，6個(gè)基因的表達(dá)在1～5 h內(nèi)與常溫沒(méi)有明顯差異，8 h后開(kāi)始呈現(xiàn)極顯著上調(diào)，表達(dá)量最高值集中在低溫脅迫后的第8，24，48 h(圖3)。而在HN1中，6個(gè)基因的表達(dá)在1～16 h內(nèi)皆呈現(xiàn)極顯著下調(diào)，表達(dá)量最低值集中在1～5 h內(nèi)(圖3)。就6個(gè)基因在ZS7與HN1無(wú)性系間的表達(dá)量差異而言，ABR1，GRXC6，AtHSFA6B和HSP18.2這4個(gè)基因在2 h內(nèi)出現(xiàn)，而RAP2.7和AtbZIP44這2個(gè)基因在8 h出現(xiàn)。此外，6個(gè)基因的表達(dá)量最高值依次為ABR1(168)>AtbZIP44(57)>GRXC6(56)>HSP18.2(54)>AtHSFA6B(33)>RAP2.7(7)，可見(jiàn)，ABR1基因的表達(dá)量最高，是AtbZIP44，GRXC6，HSP18.2，AtHSFA6B基因的3～5倍，RAP2.7基因的24倍(圖3)。這一表達(dá)模式表明對(duì)于耐寒種質(zhì)，一定時(shí)間的半致死溫度脅迫激活了耐寒相關(guān)調(diào)控基因的增強(qiáng)表達(dá)以應(yīng)對(duì)逆境； 但對(duì)于不耐寒種質(zhì)，低溫脅迫短時(shí)間內(nèi)即抑制了耐寒相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)，導(dǎo)致其耐寒性顯著降低。

3 討論

低溫半致死溫度(LT50)能較準(zhǔn)確地反映植物所能耐受的最低溫度，在植物抗寒研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用(許瑛等， 2008； 孫海偉等， 2012； 任俊杰等， 2014； Suetal., 2015)。當(dāng)溫度繼續(xù)下降至低于LT50時(shí)，組織中液態(tài)水將迅速結(jié)冰，導(dǎo)致凍害發(fā)生(Rajashekaretal., 1979)，植物組織所受的傷害也將不能恢復(fù)(任俊杰等， 2014)。因此LT50可以認(rèn)為是植物組織所受傷害不可逆轉(zhuǎn)時(shí)的轉(zhuǎn)折溫度，研究在LT50溫度前后耐寒相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)于探究木麻黃應(yīng)對(duì)低溫脅迫的分子機(jī)制具有重要意義。本研究基于LT50反映了2種不同短枝木麻黃種質(zhì)在耐受低溫程度上的差異，并進(jìn)一步從分子水平上研究了在LT50溫度脅迫前后，2種耐寒性不同的種質(zhì)在6個(gè)耐寒相關(guān)基因表達(dá)上差異。在2種低溫脅迫方式下，耐寒和不耐寒種質(zhì)對(duì)低溫的應(yīng)答機(jī)制明顯不同，在LT50前后，6個(gè)耐寒相關(guān)基因在不耐寒短枝木麻黃種質(zhì)中的表達(dá)一直被強(qiáng)烈抑制，而在耐寒種質(zhì)中，5個(gè)基因(除RAP2.7外)的表達(dá)都呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)。此外，當(dāng)臨近LT50的-5 ℃時(shí)，盡管短時(shí)間的低溫脅迫暫時(shí)抑制了耐寒種質(zhì)中5個(gè)基因(除RAP2.7外)的表達(dá)，但在脅迫達(dá)到8 h后再次增強(qiáng)表達(dá)，并一直持續(xù)至48 h。這表明未經(jīng)過(guò)耐寒鍛煉的短枝木麻黃種質(zhì)，缺乏抵御低溫脅迫的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，而耐寒短枝木麻黃種質(zhì)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的低溫適應(yīng)，形成了一系列由調(diào)控基因介導(dǎo)的耐寒調(diào)節(jié)機(jī)制，尤其在組織受到不可逆轉(zhuǎn)傷害的溫度節(jié)點(diǎn)，該機(jī)制被充分調(diào)動(dòng)，以提高自身的抗逆性。

為了適應(yīng)各種生物與非生物逆境脅迫，植物啟動(dòng)了多種防御性機(jī)制。由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是最為快速有效的防御應(yīng)答反應(yīng)之一，構(gòu)成了植物復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分(Leeetal., 2005； Ashraf, 2010)。在本研究中，-5 ℃持續(xù)低溫脅迫顯著誘導(dǎo)了耐寒短枝木麻黃ZS7中ABR1、AtbZIP44和AtHSFA6B這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的增強(qiáng)表達(dá)，其中AtHSFA6B基因的表達(dá)量在8 h達(dá)到最高，ABR1和AtbZIP44基因則在24 h之后。這表明不同轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)低溫的速度與強(qiáng)度不同，且發(fā)揮最大調(diào)節(jié)作用的時(shí)間也不一致。此外，這3個(gè)基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后下降的變化規(guī)律，這可能是由于它們被誘導(dǎo)表達(dá)后激活了下游一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)，從而提高木麻黃對(duì)低溫脅迫的抗性。而后期表達(dá)量下降的原因，可能與已經(jīng)對(duì)脅迫環(huán)境適應(yīng)有關(guān)，也可能體現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子基因的誘導(dǎo)受脅迫時(shí)間的限制，超過(guò)一定的時(shí)間，表達(dá)逐漸受到抑制，對(duì)低溫的耐受能力也逐漸降低(楊帆等， 2010)。這種隨逆境脅迫時(shí)間的持續(xù)，轉(zhuǎn)錄因子基因先升高后下降的表達(dá)模式也在對(duì)構(gòu)樹(shù)(Broussonetiapapyrifera)耐鹽(楊帆等， 2010)、水稻(Oryzasativa)耐低溫(Liuetal., 2012)和胡楊(Populuseuphratica)耐鹽(Shenetal., 2013)等的研究上得到了相似結(jié)果。

AP2/ERF家族的轉(zhuǎn)錄因子處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)(Xuetal., 2011； Zhuangetal., 2011)，主要通過(guò)激活冷誘導(dǎo)基因(cold regulated，COR)、應(yīng)答脫水基因(responsive to dehydration，RD)等一系列下游冷調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)對(duì)低溫逆境的適應(yīng)。不同于AP2/ERF家族中的大多數(shù)成員，AP2型基因RAP2.7隸屬該家族中DREB亞家族轉(zhuǎn)錄因子A-5亞組基因，為EAR(ERF-associated amphiphilic repression)型轉(zhuǎn)錄抑制子(Dongetal., 2010)，其過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物耐受性降低，而缺失突變體植株則會(huì)對(duì)逆境的耐受性增強(qiáng)(Tsutsuietal., 2009； Yaishetal., 2009)。在本研究中，-2 ℃的低溫對(duì)耐寒相關(guān)基因RAP2.7具有負(fù)調(diào)控作用，在-5 ℃持續(xù)低溫脅迫下，其表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他5個(gè)基因。RAP2.7基因在耐寒短枝木麻黃中的這一低溫應(yīng)答模式表明，在低溫逆境的應(yīng)答上，一些AP2型基因成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制不同于ABR1、AtHSFA6B和AtbZIP44，耐寒短枝木麻黃是通過(guò)這些AP2型轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫下的負(fù)調(diào)控作用來(lái)增強(qiáng)其對(duì)低溫的耐受性。AP2/ERF 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員在不同植物中存在的數(shù)量及類(lèi)型不同(Velascoetal., 2010)。在前期對(duì)耐寒型短枝木麻黃的轉(zhuǎn)錄組研究中，初步鑒定出了18個(gè)在低溫脅迫下差異表達(dá)的AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子成員，其中11個(gè)上調(diào)、7個(gè)下調(diào)(Lietal., 2017)。因此為了全面了解AP2型轉(zhuǎn)錄因子在低溫逆境下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，有必要對(duì)這些AP2型成員的精細(xì)表達(dá)模式進(jìn)一步研究。

低溫誘導(dǎo)了植物體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量產(chǎn)生，進(jìn)而從根本上導(dǎo)致氧化脅迫，對(duì)植物組織內(nèi)的蛋白、脂類(lèi)、碳水化合物和核酸造成巨大傷害。在氧化脅迫下，植物細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)隨之被激活，通過(guò)清除ROS以抵御氧化脅迫導(dǎo)致的傷害(Gilletal., 2010)。硫氧還蛋白GRXC6屬于抗氧化酶類(lèi)ROS家族的成員，熱激蛋白基因HSP18.2是ROS應(yīng)答基因(Lietal., 2017)。本研究顯示在-5 ℃的低溫誘導(dǎo)下，GRXC6在48 h達(dá)到最高表達(dá)量，HSP18.2在8～48 h一直維持較高的表達(dá)量，這表明在低溫脅迫下，耐寒短枝木麻黃種質(zhì)通過(guò)誘導(dǎo)ROS家族基因和ROS應(yīng)答基因的上調(diào)表達(dá)來(lái)調(diào)整增強(qiáng)ROS清除能力，進(jìn)而減輕氧化脅迫導(dǎo)致的傷害，提高其抗氧化能力以適應(yīng)逆境。植物參與不同逆境脅迫響應(yīng)的基因之間存在復(fù)雜的互作關(guān)系(Huangetal., 2012)。熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF是植物熱激響應(yīng)的主要控調(diào)因子，在逆境脅迫下與熱激元件(heat shock element，HSE)識(shí)別并特異結(jié)合，從而激活下游基因HSP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)(Pelham, 1982)，對(duì)植物抵抗逆境傷害和其他生命活動(dòng)具有關(guān)鍵作用(Baniwaletal., 2004)。在本研究中，HSP18.2和AtHSFA6B具有同步一致的表達(dá)模式，均在8～48 h持續(xù)高表達(dá)，這可能預(yù)示了在低溫脅迫早期，AtHSFA6B基因的高表達(dá)迅速啟動(dòng)了對(duì)下游HSP18.2的調(diào)控機(jī)制，以增強(qiáng)短枝木麻黃低溫逆境的耐受能力。

4 結(jié)論

在耐寒相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)水平上，耐寒和不耐寒短枝木麻黃種質(zhì)對(duì)低溫的應(yīng)答機(jī)制明顯不同。低溫激活了耐寒種質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子、ROS家族基因、ROS應(yīng)答因子等調(diào)控基因的增強(qiáng)表達(dá)以抵御和適應(yīng)逆境脅迫，但抑制了在不耐寒種質(zhì)中的表達(dá)，顯著降低了不耐寒種質(zhì)對(duì)低溫逆境的耐受能力。這在一定程度上對(duì)于豐富木麻黃適應(yīng)低溫的分子機(jī)制，以及耐寒無(wú)性系的分子選育都具有一定的參考價(jià)值。顯然，要全面深入解析木麻黃耐寒的分子機(jī)制，還需要增加更多耐寒相關(guān)候選基因的表達(dá)模式研究，并進(jìn)一步開(kāi)展功能分析研究。為此，克隆基因全長(zhǎng)、構(gòu)建木麻黃功能基因超表達(dá)載體、建立遺傳轉(zhuǎn)化體系等，將是在本研究基礎(chǔ)上繼續(xù)跟進(jìn)的工作。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Analysis on Differential Expression of Cold Resistance Related Genes ofCasuarinaequisetifoliaunder Low Temperature Stress

Li Nan1,2Zheng Yongqi1Ding Hongmei3Liu Xinhong2Sheng Weitong1Jiang Bo2Li Haibo2

(1.KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationofStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestryBeijing100091; 2.ZhejiangAcademyofForestryHangzhou310023; 3.ZhejiangChineseMedicalUniversityHangzhou310053)

【Objective】 The expression patterns of 6 cold resistance related genes (RAP2.7,ABR1,AtHSFA6B,AtbZIP44,GRXC6 andHSP18.2) in cold-tolerant and cold-intolerantCasuarinaequisetifoliawere analyzed in order to provide a theoretical basis for elucidating the molecular mechanism ofCasuarinatrees in response to cold stress.【Method】 The relative conductivity in cold-tolerant (ZS7) and cold-intolerant (HN1) clones ofC.equisetifoliawere measured under low temperature stresses at -2--11 ℃. The low half-lethal temperature (LT50) were calculated by fitting the temperature with the relative conductivity based on the logistic equation. Quantitative Real-Time PCR (qPCR) was employed to investigate the differential expression of the 6 cold resistance related genes in cold-tolerant and cold-intolerant clones under successive low temperature stresses at -2, -5 and -8 ℃, as well as precise expression patterns under low temperature stresses at -5 ℃ for 1, 2, 5, 8, 16, 24, 48 and 72 h. The specific primers for qPCR were designed based on the EST sequences of 6 cold resistance related genes identified from previous transcriptome analysis. Analysis of relative gene expression data was performed using 2-ΔΔCTmethod.【Result】 Under low temperature stresses, relative conductivity in cold-tolerant and cold-intolerant clones had a very highly significant difference (P<0.01), LT50was -5.92 ℃ and -2.87 ℃, respectively. Under normal temperature condition, the relative expression of all the 6 genes in 2 clones had no significant differences. However, under low temperature stress at -2 ℃ for 2 h, which was close to the LT50of cold-intolerant clone, expression of these genes in the cold-intolerant clone were strongly inhibited, while in the cold-tolerant clone were activated. Under low temperature stress at -5 ℃ for 2 h, which was close to the LT50of the cold-tolerant clone, expression of these genes were further inhibited in the cold-intolerant clone, also in the cold-tolerant clone. Under low temperature stress at -8 ℃ for 2 h, which was lower than the LT50, the expression of all 6 genes in 2 clones were inhibited continuously. The precise expression patterns analysis revealed that the expression of all 6 genes were significantly up-regulated in the cold-tolerant clone under low temperature stress at -5 ℃ for 8 h, reaching the maximum at 8 h, 24 h and 48 h, and significantly down-regulated in the cold-intolerant clone at 1-16 h, reaching the minimum at 1-5 h.【Conclusion】 On the expression level of cold resistance related genes, different clones showed significantly different responding mechanisms to low temperature stress. Low temperature induces the expression of genes belonging to transcription factors and ROS family, and genes related with the response to ROS in cold-tolerantC.equisetifoliato resist or adapt to cold stress, instead it was inhibited in the cold-intolerantC.equisetifolia, thus significantly decreased its adaptation to cold stress. This study provided a useful basis for enriching the molecular mechanism ofCasuarinatrees in coping with cold stress, and for molecular selection and breeding of cold-tolerantCasuarinaclones.

Casuarinaequisetifolia； low temperature stress； cold tolerance； gene expression； molecular breeding

10.11707/j.1001-7488.20170707

2017-03-10；

2017-06-01。

浙江省農(nóng)業(yè)(林木)新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2016C02056-9)。

S718.46

A

1001-7488(2017)07-0062-10

*李海波為通訊作者。