劉陸濱,趙禹仲,孫啟菲,趙 亮

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

2型糖尿病性牙周病患者唾液中白細(xì)胞介素6含量測(cè)定①

劉陸濱,趙禹仲,孫啟菲,趙 亮

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：測(cè)定2型糖尿病性牙周病患者口腔唾液中白細(xì)胞介素6(IL-6)的含量。方法：利用Bio-Plex 懸液芯片技術(shù)分別測(cè)量2型糖尿病性牙周病患者和健康人唾液IL-6含量。結(jié)果：2型糖尿病性牙周病患者唾液中IL-6的含量(3.88±0.24)pg/L，健康人唾液IL-6含量(2.78±0.31)pg/L，二者之間有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：利用口腔唾液中IL-6的含量評(píng)價(jià)2型糖尿病性牙周病患者的嚴(yán)重程度是可行的。

糖尿病性牙周??；唾液；白細(xì)胞介素6(IL-6)；Bio-Plex；懸液芯片技術(shù)

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病[1]。近年來隨著人們生活質(zhì)量的提高和餐飲質(zhì)量的變化，2型糖尿病患者的發(fā)病率也逐年增加。研究發(fā)現(xiàn)[2]，近5年來其發(fā)病率由占全國慢性病第7位上升到第3為。牙周病是口腔科常見疾病之一，在我國人群的患病率較高[3,4]。它是一類牙齒支持組織的慢性炎癥性疾病，多發(fā)生于牙齦、牙周膜等部位。牙周病被認(rèn)為是糖尿病的第六大并發(fā)癥[5]，炎癥被認(rèn)為是糖尿病的危險(xiǎn)因子，可影響胰島素抵抗和代謝控制，通過生活方式或治療降低炎癥水平可降低糖尿病進(jìn)一步發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)性[6]。白細(xì)胞介素6(IL-6)是主要炎癥介質(zhì)，它在唾液和齦溝液中的濃度是牙周病及糖尿病的活動(dòng)性指標(biāo)，與治療有著密切的關(guān)系。本次研究擬對(duì)糖尿病性牙周病患者和健康人唾液中IL-6含量進(jìn)行測(cè)定，探討兩組研究對(duì)象中唾液中IL-6含量變化規(guī)律以及與糖尿病性牙周病發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

微珠(240μL 25×stock beads加入5760μL Bio-Plex Assay Buffer)，檢測(cè)抗體(60μL 50×Stock Detection Antibody加入2940μL Detection Antibody Diluent A)和Streptavidin-PE 熒光色素(60μL 100×Streptavidin-PE加入5940μL Bio-Plex Assay Buffer)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及樣本采集

通過篩查居民健康檔案，分別選擇2型糖尿病性牙周病人和健康人各40例作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：2糖尿病性牙周病患者符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，無糖尿病并發(fā)癥，婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內(nèi)未做過牙周基礎(chǔ)治療；最近3個(gè)月未服用過抗生素；全口無齲者；無抽煙者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：全身無系統(tǒng)性疾??；婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內(nèi)未做過牙周基礎(chǔ)治療；最近3個(gè)月未服用過抗生素；全口無齲者；無抽煙者。與實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組參與者簽訂知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

采樣前夜采用Bass法刷牙，次日上午8時(shí)清醒空腹情況下進(jìn)行標(biāo)本采集。唾液采集采用經(jīng)典的非刺激性全唾液采集法，每人采集唾液99μL，加入保護(hù)液1μL，干冰保溫盒中保存。待樣本采集完畢，冰浴解凍。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)流程按照Bio-Plex pro assay說明書進(jìn)行。

(1)打開Bio-Plex System系統(tǒng)并校正。真空吸板機(jī)的真空度調(diào)節(jié)為1～2Hg壓力，用96孔板蓋住。(2)將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加入96孔板中，然后加入微珠。輕輕蓋上封板膜和鋁簿，使每個(gè)小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動(dòng)30s，再以600轉(zhuǎn)/秒下振動(dòng)30min。(3)振動(dòng)結(jié)束后，以100μL Bio-Plex Assay Buffer潤濕濾板，輕輕打開封板膜和鋁簿，用100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(4)每孔加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕蓋上封板膜和鋁薄，使每個(gè)小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動(dòng)30s，再以600r/s下振動(dòng)30min。然后將封板膜和鋁薄打開，過程中要避免濺出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(5)漩渦振動(dòng)檢測(cè)抗體數(shù)秒，每孔加入detection antibodies25μL，輕輕蓋上封板膜和鋁簿，使每個(gè)小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動(dòng)30s，再以600r/s下振動(dòng)30min。然后將封板膜和鋁薄打開，過程中要避免濺出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(6)漩渦混合Streptavidin-PE 熒光色素，每孔加入50μL，輕輕蓋上封板膜和鋁簿，使每個(gè)小孔完全遮住。室溫下以1100r/s下振動(dòng)30s，再以600r/s下振動(dòng)30min。然后將封板膜和鋁薄打開，過程中要避免濺出，真空抽去buffer，再100μL Bio-Plex wash buffer 洗2次，吸去buffer，使之完全吸凈以防止交叉污染。(7) 每孔加入125μL Bio-Plex assay buffer 微珠重懸，輕輕用密封袋蓋住，1100轉(zhuǎn)室溫?fù)u床30秒后立即放入儀器中進(jìn)行讀盤檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將數(shù)據(jù)輸入該軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，認(rèn)為P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中唾液中IL-6含量，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；颊咄僖褐械腎L-6含量與糖尿病性牙周病患者有一定的關(guān)聯(lián)。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組唾液中IL-6含量

3 討論

人體是一個(gè)統(tǒng)一整體，任何一種疾病的發(fā)生都不是單一的組織器官的反應(yīng)，在全身均有反應(yīng)。唾液是口腔中特殊的微環(huán)境，它在口腔中作為液相自成一體，由口腔附近各類大小唾液腺的分泌液和齦溝液混合而成，其內(nèi)混懸有食物碎片、微生物和口腔上皮脫落細(xì)胞。牙周病使得唾液中的細(xì)菌，特別是牙周袋深部的致病菌、厭氧菌獲得更多的營養(yǎng)物質(zhì)，在充足營養(yǎng)物質(zhì)供給的情況下，會(huì)使得細(xì)菌大量繁殖，導(dǎo)致牙齦組織中小血管基底膜增厚，減少局部供血及供氧，降低了局部的氧分壓，使得牙周袋內(nèi)的厭氧環(huán)境進(jìn)一步增強(qiáng)，使得致病菌大量繁殖。大量細(xì)菌繁殖的結(jié)果是局部炎癥加重，作為主要炎癥介質(zhì)的白細(xì)胞介素6(IL-6)的生成大量增加。生成的白細(xì)胞介素6一部分通過血液循環(huán)進(jìn)入到機(jī)體各部，一部分在牙周組織附近起作用，大幅度提高機(jī)體內(nèi)白細(xì)胞介素6的水平，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞的功能和形態(tài)發(fā)生改變，影響胰島素的分泌，同時(shí)引起胰島素抵抗增強(qiáng)。由于減少了自身胰島素的分泌和胰島素抵抗的增強(qiáng)，使得機(jī)體內(nèi)的糖代謝的影響進(jìn)一步加劇。唾液中糖含量增加，局部炎癥加劇，主要炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素6含量進(jìn)一步增加。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

由于牙周組織的炎癥，使得牙周組織的通透性增加大量形成的白細(xì)胞介素6可以輕易通過牙周膜與牙槽相接觸，與通過血液循環(huán)聚集在牙槽骨中的白細(xì)胞介素6聚集，進(jìn)一步增加牙槽骨中的濃度，而白細(xì)胞介素6又具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的作用使得牙槽骨溶解，牙周袋加深，局部炎癥加重，生成更多的白細(xì)胞介素6。

Bio-Plex 懸液芯片技術(shù)是由最初的微球技術(shù)逐漸發(fā)展演變而來的，近年來為人類基因重組以及多種多樣的蛋白質(zhì)組提供的一項(xiàng)新技術(shù)[7]。它整合了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)并聯(lián)合運(yùn)用計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，其強(qiáng)大的分析能力優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)，具有更加精準(zhǔn)靈敏和寬廣的領(lǐng)域[8]。在當(dāng)今和未來的基因工程測(cè)序中占有重要地位，也將成為臨床醫(yī)學(xué)診斷中發(fā)揮重要作用。

盡管本研究得出II型糖尿病性牙周病患者唾液中IL-6的含量顯著高于健康人群，但I(xiàn)L-6在2型糖尿病性牙周病患者胰腺、唾液腺以及牙周組織中的動(dòng)態(tài)變化和相關(guān)聯(lián)動(dòng)機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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Highlights: Objective: Detection the content of interleukin 6 (IL-6) in oral saliva of patients with type II diabetes mellitus. Method: Determine the content of the IL-6 in saliva of patients with type II diabetes and periodontal disease was measured by Bio-Plex suspension chip technique. Result :The content of IL-6 in saliva of patients with type II diabetes mellitus was (3.88±0.24)pg/L, and the content of IL-6 in saliva of healthy people was about (2.78±0.31)pg/L, so there was significant difference between the two groups (P<0.05). Conclusion: it is feasible to evaluate the severity of patients with type II diabetes mellitus by using the content of IL-6 in oral saliva.

Type 2 diabetic patients with periodontal disease determination content of interleukin 6 in saliva

LIULu-bin,ZHAOYu-zhong,SUNQi-fei,ZHAOLiang

(Stomatology Hospital Affiliated to Jiamusi University，Jiamusi 154002，China)

diabetes mellitus;saliva;interleukin 6 (IL-6);Bio-Plex suspension chip technique

黑龍江省衛(wèi)生廳課題，編號(hào)：2012-231。

劉陸濱(1971～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，副教授，主任醫(yī)師。

孫啟菲(1987～)女，山東泰安人，在讀碩士研究生。E-mail：805038871@qq.com。

R587.1

B

1008-0104(2017)04-0011-02

2017-03-13)