陳潔茹， 陳曉偉，楊利敏,3

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2.北京大學(xué)分子研究所，北京100871；3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116600 )

果蠅幼蟲的甘油三酯和蛋白的測(cè)定方法①

陳潔茹1， 陳曉偉2，楊利敏1,3

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2.北京大學(xué)分子研究所，北京100871；3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116600 )

目的：了解果蠅三齡幼蟲甘油三酯和蛋白質(zhì)的提取方法和操作的注意事項(xiàng)。方法：選取同時(shí)間段收集的WT1118果蠅三齡幼蟲雌雄各10只，以自制裂解液PBST進(jìn)行裂解研磨。取材后，利用甘油三酯測(cè)定試劑盒(凍干粉型)GPO-PAP法和BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，測(cè)量果蠅幼蟲體內(nèi)甘油三酯和蛋白質(zhì)含量，對(duì)雌雄幼蟲的甘油三酯和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)雌性幼蟲體內(nèi)，無(wú)論是甘油三酯或蛋白質(zhì)含量都高于雄性幼蟲。結(jié)論：以果蠅三齡雌性幼蟲各10只為例，雌性幼蟲的甘油三酯和蛋白含量均高于雄性幼蟲。

果蠅幼蟲；提取方法；甘油三酯和蛋白質(zhì)測(cè)試盒測(cè)定法；注意事項(xiàng)

果蠅(Drosophila)是生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中不可缺少的模型，作為經(jīng)典的模式生物，本身具有自身特異的優(yōu)勢(shì)。首先，它的生長(zhǎng)周期快，在25℃條件下，大約10～14d可繁殖一代至成蟲[1,2]。所以，為相同條件下，同時(shí)期收集同等大小及數(shù)量相同的蟲卵提供了條件。其次，果蠅培養(yǎng)基的制作方法已經(jīng)成熟，可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)條件而改變，在此所述為果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制法：例如制作200mL培養(yǎng)基，(1)瓊脂：3g(2)酵母：16g(3)玉米面：15g(4)葡萄糖：4g(5)加滅菌的超純水或三蒸水補(bǔ)齊，溶質(zhì)溶劑共200mL。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象、試劑盒及儀器

野生果蠅WT1118(來(lái)自北京大學(xué)生命科學(xué)院饒毅實(shí)驗(yàn)室)，甘油三酯測(cè)定試劑盒(北京普利萊公司)，BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Thermo科學(xué)公司)，恒溫水浴箱(保恒恒溫技術(shù)有限公司)、普通光學(xué)顯微鏡(BH-Z日本Olympus公司)。幼蟲和成蟲均可按以下方法對(duì)甘油三酯和蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，但成蟲身體成分和雜質(zhì)較多，對(duì)于測(cè)量結(jié)果易產(chǎn)生影響，所以以下實(shí)驗(yàn)未涉及果蠅成蟲的提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

(1)果蠅雜交的設(shè)計(jì)：首先收集25只未交配的WT1118成蟲處女蠅，同15只成蟲雄性果蠅放于同一培養(yǎng)瓶中，放于培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，使它們交配完全。

(2)收集蟲卵：3d后，于中午12時(shí)，將全部果蠅轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，收集時(shí)間為2h(研究表明果蠅每天12～16時(shí)內(nèi)，產(chǎn)卵率偏高)，保證蟲卵在一個(gè)發(fā)育時(shí)期。

(3)三齡幼蟲雌雄分裝：將收集兩小時(shí)蟲卵的培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱，3d后，當(dāng)幼蟲生長(zhǎng)到三齡期，用鉤針或鈍頭鑷子將蟲卵移置裝有滅過(guò)的PBS溶液或超純水中，在顯微鏡下區(qū)分雌雄，雌性各10只，用1.5mL EP管分裝，注明樣品名稱(由于三齡期幼蟲會(huì)在培養(yǎng)基內(nèi)爬行，蟲體會(huì)沾有培養(yǎng)基，會(huì)影響測(cè)量結(jié)果，可在分裝前，可用超純水清洗蟲卵3次，后用無(wú)塵紙將蟲卵表面的水分吸干)。(4)貯存方法：入管后立即放入事先準(zhǔn)備好的液氮中，凍存于-80℃冰箱(液氮和低溫凍存是為了保證幼蟲樣本體液不失活)。

1.3 裂解液的配置

通過(guò)查閱文獻(xiàn)，可以自制研磨蟲體的裂解液PBST(PBS+0.05%Tween20，二者比例4:1)[3，4]，配置好后，通過(guò)濾膜過(guò)濾雜質(zhì)，將裂解液放于4℃冰箱貯存。

2 試劑盒測(cè)定原理

2.1 甘油三脂(TG)診斷試劑盒

對(duì)于凍干粉型甘油三酯測(cè)試盒，實(shí)驗(yàn)原理如下：1)甘油三脂+水在脂肪酶催化下生成甘油+脂肪酸 2)甘油+ATP在甘油激酶的作用在生成甘油-3-磷酸+ADP 3)甘油-3-磷酸+氧氣在甘油磷酸氧化酶催化下生成磷酸二羥丙酮過(guò)氧化物酶+雙氧水 4)雙氧水+4-氨基安替比林+對(duì)氯苯酚在過(guò)氧化物酶作用下生成醌染料+水+氯化氫，醌染料在波長(zhǎng)500nm有最大光吸收，顏色的強(qiáng)度與血清中甘油三酯含量成正比。

反應(yīng)液可按照說(shuō)明書進(jìn)行配置，一般條件是向干粉瓶中加入10mL R1原液，室溫手動(dòng)勻速搖瓶10min即可。標(biāo)準(zhǔn)品用所配置的PBST裂解液按照1:4的比例進(jìn)行稀釋，單獨(dú)用EP管進(jìn)行分裝，以免對(duì)原裝校準(zhǔn)品造成污染，結(jié)束后立即放入4℃貯存。

2.2 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒

BCA法是應(yīng)用較廣的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。原理為雙縮脲反應(yīng)，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將二價(jià)酮離子還原成一價(jià)酮離子，產(chǎn)生一種紫藍(lán)色復(fù)合物，這種復(fù)合物在一定波長(zhǎng)處有較高的吸光值，同時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物量與蛋白質(zhì)的濃度成正比。試劑盒中所提供的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)為實(shí)驗(yàn)者設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線提供了便捷。試劑盒可室溫保存，但蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)需負(fù)20℃保存。

2.3 配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和工作液

(1)配制BSA標(biāo)準(zhǔn)液：1)向30mg BSA標(biāo)準(zhǔn)品中加入1mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制液，充分溶解后配制成30mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)母液，配置后應(yīng)立即稀釋使用。2)取適量濃度為30mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)母液，稀釋至終濃度為2mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為蛋白樣品的裂解液，原則上是：蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用該溶液稀釋(也可用0.9%的Nacl或PBS溶液進(jìn)行稀釋)。

(2)配制BCA工作液：1)計(jì)算實(shí)驗(yàn)中所需要的BCA工作液總體積公式：BCA工作液總體積=(標(biāo)準(zhǔn)品+待測(cè)樣品)×重復(fù)數(shù)×每個(gè)樣品所需要的BCA工作液。2)配制BCA工作液：在50體積的BCA試劑A中加入1體積的BCA試劑B(比例為A:B=50:1)，使其充分混勻。BCA試劑B加入BCA試劑A中后，立即渾濁，搖勻后則立即變澄清。

3 提取方法

待一切準(zhǔn)備就緒，正式開始實(shí)驗(yàn)前，預(yù)冷4℃離心機(jī)，準(zhǔn)備好足夠冰盒、冰袋或者鋁塊(鋁塊傳導(dǎo)溫度快)，將負(fù)80℃樣本取出，用長(zhǎng)鑷子夾住EP管，置于鋁塊或冰上。

(1)加入200μL事先配制的裂解液進(jìn)行勻速研磨，盡量降低研磨過(guò)程中摩擦產(chǎn)熱，研磨速度為10次/分(研磨器可使用成品，需事先將研磨棒進(jìn)行滅菌，一種樣本用一根，切勿混淆；若沒(méi)有成品研磨器，可用干凈的1000μL槍頭制作簡(jiǎn)易的研磨棒。用酒精燈灼燒槍頭尖部，塑料制品遇火融化，槍頭融為閉塞狀，可用1.5mL EP管測(cè)試與管底契合程度，按照實(shí)驗(yàn)需求制作，滅菌備用)。所有的研磨都要在冰上進(jìn)行，防止樣本降解。

(2)待裂解樣本溶液呈均勻渾濁樣，于4℃離心機(jī)瞬離30秒，將管壁上殘留的樣品溶液輕輕彈下，后置于冰上。將離心好的樣品溶液，取出100μL上清液到另一個(gè)1.5mL EP管后置于冰上或負(fù)80℃貯存，待測(cè)甘油三酯；剩余100μL用來(lái)測(cè)定蛋白含量(鑒于蛋白成分易受溫度影響，建議先做蛋白濃度測(cè)定)。

4 甘油三酯和蛋白質(zhì)濃度測(cè)量

4.1 甘油三酯的測(cè)定

將用于測(cè)定甘油三酯的100μL樣本的EP管，置于70℃水浴鍋煮10min。待到時(shí)間，按照下列表格(表1)加好樣品，37℃水浴鍋加熱30min后加樣。

表1 甘油三脂加樣表

很多甘油三酯測(cè)試盒說(shuō)明上都以水為背景作為空白對(duì)照組，但考慮到果蠅無(wú)血液且數(shù)據(jù)的嚴(yán)密，所以將裂解液作為背景。30min后，取出用指腹輕彈管壁，充分混勻。按照上述列表順序加樣，盡量減少加樣產(chǎn)生的氣泡；如果為了測(cè)量的準(zhǔn)確，可同一種樣本分別三次加樣，取平均值。根據(jù)說(shuō)明書要求的波長(zhǎng)進(jìn)行設(shè)置，完畢后進(jìn)行讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

計(jì)算公式：

圖1 WT1118雌性與雄性幼蟲甘油三酯含量

4.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

將用于測(cè)定的蛋白的100μL樣品溶液4℃ 12000rpm離心10min，吸取BSA反應(yīng)液于酶標(biāo)板，定好點(diǎn)樣圖，做好標(biāo)記。吸取離心后樣品上清溶液(上樣量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)范圍顯色而定于反應(yīng)液。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線6個(gè)點(diǎn)，分別是0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0(mg/mL),加5μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于反應(yīng)。將盛有混合液的酶標(biāo)板置于37℃水浴10min后取出放于室溫。然后微孔板加樣，加樣方法如下：1)各取25μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到微孔板中 2)每孔加入200μL BCA工作液，振蕩30秒充分混勻，37℃放置30min 3)冷卻到室溫，在酶標(biāo)儀上的562nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度 4)根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。置于酶標(biāo)儀測(cè)定，記錄分析。見(jiàn)圖2。

圖2 WT1118 雌性與雄性幼蟲蛋白含量

使用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)量時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷加深，且顯色反應(yīng)的速度和溫度相關(guān)，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需注意保持定時(shí)和定溫，以確保定量精確。每次測(cè)定時(shí)，都需重新做相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5 討論

根據(jù)以上兩項(xiàng)結(jié)果顯示：雌性果蠅三齡幼蟲體內(nèi)甘油三脂和蛋白含量均高于雄性幼蟲，這與雌性幼蟲體內(nèi)雌激素有關(guān)。希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的提取方法和操作步驟為日后其他人對(duì)果蠅的實(shí)驗(yàn)和學(xué)習(xí)提供技術(shù)支持與幫助[5,6]，本人的提取方法和實(shí)驗(yàn)操作尚有不足，我會(huì)在日后的實(shí)踐操作中繼續(xù)探索解決實(shí)驗(yàn)的瑕疵之處，努力提高實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平。

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,編號(hào)：31571087和31200839。

陳潔茹(1989～)女，黑龍江雙鴨山人，在讀碩士研究生。

楊利敏(1973～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：lmyang@jmsu.edu.cn。

R392；R446.5

A

1008-0104(2017)04-0003-02

2017-04-15)