劉笑男，李璐，趙聰，鄭義，闞玉娜，劉萍，葛鵬玲*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000; 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬江旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011; 4.中國人民解放軍軍事經(jīng)濟(jì)學(xué)院門診部，湖北 武漢 430000)

實(shí)驗(yàn)研究

花旗澤仁對胰島素抵抗大鼠肝臟CaSR mRNA、蛋白表達(dá)及AKT活性的影響

劉笑男1，李璐2，趙聰3，鄭義4，闞玉娜1，劉萍1，葛鵬玲1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000; 3.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬江旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011; 4.中國人民解放軍軍事經(jīng)濟(jì)學(xué)院門診部，湖北 武漢 430000)

目的：觀察花旗澤仁對胰島素抵抗(IR)大鼠肝臟組織中鈣敏感受體(CaSR) mRNA、蛋白表達(dá)及蛋白激酶B(AKT)活性的影響，探討花旗澤仁改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制。方法：雄性Wistar大鼠用復(fù)合脂肪乳連續(xù)灌胃4周配合小劑量注射鏈脲佐菌素的方法復(fù)制2型糖尿病胰島素抵抗模型，將大鼠隨機(jī)分為花旗澤仁組、陽性對照組、模型對照組、空白對照組。檢測空腹血糖(FBG)及空腹血清胰島素(FINS)，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)；采用qRT-PCR、Western blot技術(shù)檢測CaSR mRNA、CaSR蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型對照組組大鼠FBG及FINS水平明顯增高，ISI顯著降低；與模型對照組相比，花旗澤仁組和陽性對照組大鼠FBG和FINS水平明顯降低，ISI明顯升高；與空白對照組比較，模型對照組大鼠肝臟組織中CaSR mRNA表達(dá)水平明顯降低；與模型對照組相比，花旗澤仁組和陽性對照組大鼠肝臟組織中CaSR mRNA表達(dá)水平顯著增高；與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中CaSR蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表達(dá)量均顯著降低；與模型對照組相比，花旗澤仁組和陽性對照組大鼠肝臟組織中CaSR 蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表達(dá)量均明顯增加。結(jié)論：花旗澤仁可能通過調(diào)節(jié)CaSR基因及蛋白表達(dá)，改善2型糖尿病胰島素抵抗。

2型糖尿病；胰島素抵抗；鈣敏感受體；AKT；花旗澤仁

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種與肥胖有關(guān)的慢性內(nèi)分泌和代謝性異常疾病。目前認(rèn)為胰島素抵抗是2型糖尿病重要的發(fā)病基礎(chǔ)。胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是指機(jī)體靶器官或組織對胰島素生物效應(yīng)的敏感性降低或喪失，即胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定[1]。胰島素抵抗及其次生代謝障礙是一種常見的導(dǎo)致冠心病和糖尿病的重要因素[2-4]。

目前，臨床治療T2DM的西藥多為胰島素增敏劑，長久使用存在很多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥重視整體調(diào)節(jié)及辨證論治，且中藥治療具有多通路，多靶點(diǎn)、毒副作用少等特點(diǎn)[5-6]?；ㄆ鞚扇适桥R床用于治療脾虛濕盛，濕熱內(nèi)蘊(yùn)型糖尿病的經(jīng)驗(yàn)方。本課題組前期研究表明，花旗澤仁可以通過提高胰島素敏感性，調(diào)節(jié)TNF-α水平和瘦素水平來改善2型糖尿病胰島素抵抗[7-11]，同時能降低血清總膽固醇，甘油三酯和游離脂肪酸水平[12]。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察花旗澤仁對大鼠肝臟組織中CaSR mRNA、CaSR蛋白表達(dá)及AKT活性的影響來探討花旗澤仁治療2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠50只，SPF級，體質(zhì)量180 g～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(魯-2009-0007)。造模前，實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，明暗交替周期為12 h，自由攝食和飲水，室內(nèi)溫度約為(25±5)℃，濕度約為(60±10)%。

1.2 藥品與試劑

花旗澤仁復(fù)方(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局提供)；鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)、丙硫氧嘧啶、RNase-free water(Sigma公司)；膽固醇(上海山浦化工有限公司)；果糖(上海蘭季科技有限公司)；蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、無水乙醇、丙烯酰胺、10%過硫酸銨、甲醇、10%十二烷基硫酸鈉(天津天力化學(xué)試劑有限公司)；谷氨酸鈉(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)；Tween80(天津大茂化工試劑有限公司)；丙二醇(天津富寧精細(xì)化工有限公司)；諾和靈R生物合成人胰島素(丹麥諾和諾德公司)；馬來酸羅格列酮(葛蘭素史克公司)；Ins放射免疫試劑盒(北方生物技術(shù)研究所)；Trizol Reagen(Invitrogen公司)；焦炭酸二乙酯(DEPC)(Amresco公司)；AccuPower RocketScript RT PreMix、AccuPower GreenStar qPCR PreMix(Bioneer公司)；氯仿、異丙醇(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；Tris-HCl，pH 6.8、Tris-HCl，pH 8.8(北京諾博萊德公司)；N,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)(上海海曲化工有限公司)；蛋白裂解液、4×蛋白上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Solarbio公司)；蛋白預(yù)染Marker(Fermentas公司)；AKT一抗、T308一抗、S473一抗(兔、CST公司)；CaSR一抗(小鼠)、β-actin(兔)(abcam公司)；二抗(中杉金橋公司)；Tween20(湖北興銀河化工有限公司)；5%脫脂奶粉(伊利公司)。

1.3 儀器

分析天平(Sartorius公司)；酶標(biāo)儀(BIO-TEX Instruments INC公司)；羅康全活力型血糖監(jiān)測儀(德國羅氏公司)；放射免疫計數(shù)器(西安核儀器廠)；梯度單頭PCR儀 Bio-RadS1000、Real-time PCR儀Bio-Rad CFX96、電泳儀、Universal Hood 2型Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂公司)；紫外分光光度計(島津公司)；離心機(jī)(Thermo公司)。

1.4 胰島素抵抗大鼠模型制備

將Wistar大鼠按照隨機(jī)原則分為模型對照組(40只)和空白對照組(10只)，模型對照組灌胃脂肪乳10 ml/(kg·d)，連續(xù)灌胃20天后，禁食12 h，正常給水，腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)40 mg/(kg·d)，接連注射2天，每次腹腔注射STZ 15 min后，給大鼠腹腔注射胰島素0.4 U，并于2.5 h和5 h后分別灌胃給予25%葡萄糖10 ml/kg。最后一次注射STZ 72 h后，空腹血糖值≥16.7 mmol/L，且胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity Index，ISI)與空白對照組比較具有顯著差異的大鼠作為胰島素抵抗模型大鼠。

1.5 分組及給藥

取36只造模成功大鼠按隨機(jī)原則分成三組：模型對照組(10只)、花旗澤仁組(10只)和陽性對照組(10只)。花旗澤仁組按4.5 g/kg灌胃給藥；陽性對照組按0.4 mg/kg灌胃給藥；空白對照組和模型對照組分別給予同等劑量的蒸餾水，共灌胃28天。

1.6 指標(biāo)及檢測

4周后，大鼠腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉，腹主動脈采血，血液靜置30 min后，4℃ 3 000 rpm離心15 min，吸取上清液，-80℃保存待測。隨后迅速打開腹腔取出肝臟組織約100 mg剪碎置于液氮中迅速冷凍，2 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，待測。用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測鈣敏感受體(CaSR)mRNA、蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表達(dá)水平。

1.6.1 一般指標(biāo)

觀察大鼠行為表現(xiàn)、體質(zhì)量。

1.6.2 空腹血糖(FBG)檢測方法

用毛細(xì)玻璃管法尾尖取血后，滴于血糖試紙上，應(yīng)用血糖儀測試空腹血糖(FBG)。

1.6.3 空腹胰島素(FINS)檢測方法

眼底取血約1.0 ml置于1.5 ml EP管中，按照酶聯(lián)免疫法(ELISA)測空腹胰島素，按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6.4 計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)

采用李光偉法[13]計算ISI。

ISI =ln[1/(FBG×FINS)]

1.6.5 肝臟組織中CaSR mRNA的表達(dá)

取50 mg樣本在研缽中加入液氮快速研磨成為細(xì)小顆粒，并將研磨好的樣本轉(zhuǎn)移入冰浴中的l.5 ml EP管中，參照TRIZOL(Invitrogen)提取RNA的方法提取總RNA[14]；然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，并測定總RNA的完整性，計算RNA的濃度和純度。

反應(yīng)體系：2×Greenstar Master Mix 12.5 μl+cDNA樣本2.0 μl+引物F-primer：TTCTTTGAACCTGGACGACGAGT 1.0 μl +引物R-primer：GCGAGGAAGGATTTGTAC 1.0 μl + DEPC 8.5 μl ；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性10 s、47℃退火30 s、47℃延伸30 s、40個循環(huán)。

1.6.6 蛋白印跡法(Western blot)檢測各組織鈣敏感受體(CaSR)蛋白表達(dá)量及Akt活性

將肝臟組織研至粉末狀，每20 mg中加入150～250 μl組織裂解液，靜置于冰上反應(yīng)30 min；然后12 000 rpm離心10 min；取出上清液，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，使其熱變性，-20°C保存?zhèn)溆谩嶙冃院蟮臉悠?，即可進(jìn)行電泳(分離膠配制濃度10%，濃縮膠配制濃度5%)。電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上(恒流轉(zhuǎn)膜90 min左右)。轉(zhuǎn)膜后，將膜取出，朝向膠的方向?yàn)檎?，在左上角做?biāo)記，并放入5%脫脂牛奶封閉液中，37℃平緩搖動1 h。封閉結(jié)束后，用TBST洗膜，放置搖床上，室溫?fù)u動10 min，重復(fù)3次。洗完膜后，將一抗用TBST稀釋比例為1:1 000，將膜放入一抗中4℃過夜，第二日，用TBST洗膜3次，每次10 min。將二抗用TBST稀釋比例為1∶5 000，將PVDF膜放入二抗中，室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次，每次10 min。配制比例是1:1的ECL發(fā)光液，混勻后滴加到PVDF膜正面上，確保ECL發(fā)光液反應(yīng)2～3 min后置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，盡快拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)結(jié)果

空白對照組大鼠皮毛平整、色澤光亮、活動迅速；模型對照組大鼠毛發(fā)暗淡無光、動作緩慢、精神萎靡不振；模型對照組大鼠與空白對照組大鼠對比，其攝食量、飲水量、尿量都明顯增加，體質(zhì)量下降；花旗澤仁組及陽性對照組大鼠與模型對照組比較，毛發(fā)有色澤、精神好轉(zhuǎn)、活動增多，在攝食量、飲水量和尿量方面有所減少，體質(zhì)量上升。

2.2 花旗澤仁對大鼠體質(zhì)量、FBG、FINS及ISI的影響

如表1、圖1所示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠體質(zhì)量減少，具有顯著差異(P<0.01)；與模型對照組比較，花旗澤仁組及陽性對照組大鼠體質(zhì)量升高，但不具有顯著差異(P>0.05)。如表1、圖1、2、3、4所示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠血糖(FBG)和胰島素(FINS)水平明顯升高，胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著降低(P<0.001)；與模型對照組比較，花旗澤仁組和陽性對照組的空腹血糖(FBG)和空腹胰島素(FINS)水平明顯下降，胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著升高(P<0.001)。

表1 花旗澤仁對大鼠體質(zhì)量、FBG、FINS、ISI的影響

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001，△△P<0.01，△P<0.05；與模型對照組比較，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

圖1 花旗澤仁對IR大鼠體質(zhì)量的影響

圖2 花旗澤仁對IR大鼠空腹血糖的影響

圖3 花旗澤仁對IR大鼠空腹胰島素的影響

圖4 花旗澤仁對IR大鼠胰島素敏感指數(shù)的影響

2.3 花旗澤仁對IR大鼠肝臟組織中CaSR mRNA表達(dá)水平的影響

如表2、圖5所示，在肝組織中，與空白對照組比較，模型組CaSR mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.001)；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組大鼠肝臟中CaSR mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠肝臟組織上CaSR mRNA表達(dá)水平的比較

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001；與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.4 花旗澤仁對胰島素抵抗(IR)大鼠肝臟組織中鈣敏感受體(CaSR) 蛋白表達(dá)的影響

如表3、圖6所示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠肝臟組織中CaSR蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組大鼠肝臟中CaSR蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

圖5 花旗澤仁對IR大鼠肝臟組織中CaSR mRNA表達(dá)水平的影響

表3 各組大鼠在肝臟組織中CaSR蛋白表達(dá)水平的比較

注：與空白對照組比較，△△P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05。

圖6 花旗澤仁對IR大鼠肝臟組織中CaSR 蛋白表達(dá)水平的影響注：A：Western blot檢測結(jié)果；B：蛋白灰度值。

圖7 花旗澤仁對IR大鼠肝臟組織中磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平的影響 注：A：Western blot檢測結(jié)果；B：蛋白灰度值。

2.5 花旗澤仁對胰島素抵抗(IR)大鼠肝臟組織中蛋白激酶B(AKT)活性的影響

如表4、圖7所示，與空白組比較，模型對照組大鼠肝臟組織中磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白含量顯著下降(P<0.05，P<0.01)；與模型對照組比較，花旗澤仁組、陽性對照組大鼠磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表4 各組大鼠肝臟組織中磷酸化AKT蛋白水平的比較

注：與空白對照組比較，△△△P<0.001；與模型對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

3 討論

研究證實(shí)，肝臟中含有大量胰島素受體，能結(jié)合胰島素，在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝上發(fā)揮重要作用，是胰島素敏感組織，并且肝細(xì)胞中葡萄糖的吸收和利用出現(xiàn)障礙可能導(dǎo)致胰島素抵抗[15-16]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白家族是胰島素信號傳導(dǎo)的重要途徑，根據(jù)其不同的作用底物可分為三種亞型：I型、Ⅱ型、Ⅲ型，其中I型又分成IA和IB亞型。PI3K的IA亞型和IB亞型都能被G 蛋白偶聯(lián)受體激活，使其在細(xì)胞的生長、分化、凋亡及葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物過程中發(fā)揮重要作用。絲/蘇氨酸激酶(ser- ine threonine kinase, AKT) 位于PI3K這一信號傳導(dǎo)通路的中心環(huán)節(jié)，其主要作用是負(fù)責(zé)該通路中生物信息的傳導(dǎo)，AKT分為三種亞型：AKT1、AKT2、AKT3，其中AKT2主要分布在胰島素敏感組織中，若AKT2傳導(dǎo)信號受抑制則干擾胰島素信號傳導(dǎo)。PI3K/AKT信號通路與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，激活PI3K信號通路，可激活綁定在磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸上的絲氨酸或蘇氨酸(S473，T308)兩個主要磷酸化位點(diǎn)，從而激活A(yù)KT使其發(fā)揮作用[17]。

在本研究中，通過模型對照組和空白對照組比較，發(fā)現(xiàn)模型對照組的CaSR的mRNA和蛋白表達(dá)量降低，且PI3K/AKT活性被抑制，文獻(xiàn)表明，鈣敏感受體拮抗劑可抑制Akt的活性，鈣敏感受體激動劑能增強(qiáng)Akt活性[18]，提示CaSR和PI3K/AKT之間密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，與模型對照組比較，花旗澤仁組的CaSR mRNA、CaSR蛋白表達(dá)量顯著升高，且隨著花旗澤仁組胰島素敏感指數(shù)的增加，Ser473和Thr308蛋白表達(dá)量也隨之增加。我們推測花旗澤仁可能通過激活PI3K/AKT信號通路上AKT的Ser473和Thr308磷酸位點(diǎn)，影響PI3K通路改善2型糖尿病胰島素抵抗。且此作用可能是通過影響CaSR mRNA、CaSR蛋白表達(dá)量實(shí)現(xiàn)的?；ㄆ鞚扇士赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)CaSR，激活PI3K/AKT信號通路緩解胰島素抵抗。本項(xiàng)研究的主要的目的是探究改善胰島素抵抗的新靶點(diǎn)，CaSR的發(fā)現(xiàn)為我們治療2型糖尿病胰島素抵抗拓展了新方向。

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InfluenceofHuaqizerenontheExpressionsofProteinCaSR,CaSRmRNA,andProteinAKTintheLiverTissueofT2DMRatswithIR

LIUXiao-nan1,LIlu2,ZHAOCong3,ZHENGYi4,KANYu-Na1,LIUPing1,GEPeng-Ling*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.MudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157000;3.RedFlagHospitalAffiliatedMudanjiangMedicalCollege,Mudanjiang157011;4.ChinesePeople’sLiberationArmyMilitaryEconomicsInstituteout-patientDepartment,Wuhan430000,China)

Objective:To observe the influence of Huaqizeren(HQZR) on the expressions of protein CaSR(calcium-sensing receptor), CaSR mRNA, Protein AKT (Kinase B) of the liver tissues in rats with insulin resistance(IR), in order to explore the mechanism of HQZR improving T2DM (Type 2 Diabetes Mellitus) with IR. Methods:The IR model was established with compound fat emulsion diet for four weeks and small-dose STZ injection in male Wistar rats. The rats were randomly divided into the normal control group, the model group, the HQZR group, and the positive control group. FBG(Fasting blood glucose) and FINS(fasting insulin) were tested and ISI (insulin sensitivity index) was calculated. The expressions of CaSR mRNA, protein CaSR and phosphorylated AKT(Ser473 and Thr308) were detected with qRT-PCR and Western blot techniques. Results:In terms of the levels of FBG, FINS, and ISI, FBG and FIN were significantly increased with decreased ISI in the model group, compared to the normal control group after medication; FBG and FINS were significantly decreased with increased ISI in both the HQZR group and the positive control group compared to the normal group. In terms of the expression of CaSR mRNA, it was significantly decreased in the model group compared to the normal control group; it was significantly increased after the treatment in both the HQZR group and the positive control group. In terms of protein expressions of CaSR and phosphorylated AKT, they were decreased after modeling, whereas they were significantly increased after medication both in the HQZR group and in the positive control group. Conclusion:HQZR may improve IR by regulating CaSR mRNA, protein CaSR and AKT.

Type 2 diabetes mellitus(T2DM); Insulin resistance(IR); Calcium-sensing receptor (CaSR); AKT; Huaqizeren(HQZR)

國家科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX09103201-018)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81273650)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.LC2011C03);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃” (No. 2012RCD19)；黑龍江省博士后科研啟動基金項(xiàng)目(No.LBH-Q15136)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.2016RAXXJ100)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金項(xiàng)目(No.201515)

劉笑男(1991-)，女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)2014級藥理學(xué)專業(yè)碩士研究生。

葛鵬玲*(1974-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療2型糖尿病的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。

2016-05-10

修回日期：2016-06-04

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0028-06