劉逸超，付楊，郭瀅，郭琦，韓鳳娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150056；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜的影響

劉逸超1，2，付楊1，郭瀅1，郭琦1，韓鳳娟3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱市第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150056；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠血清睪酮、子宮內(nèi)膜相關(guān)基因及蛋白信號(hào)的影響。方法：90日齡清潔級(jí)SD雌性大鼠根據(jù)Poretsky造模方法皮下注射胰島素及絨毛膜促性腺激素,連續(xù)22日構(gòu)建PCOS模型。小檗堿灌胃治療28日，采用ELISA法檢測(cè)睪酮激素水平，采用免疫組化法檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織ERα蛋白表達(dá)情況，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜Kras、PTEN mRNA基因表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組相比，小檗堿組睪酮水平顯著降低(P<0.05)；ERα陽(yáng)性表達(dá)率下降(P<0.05)；Kras、PTEN mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)論：小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜有顯著影響，對(duì)激素合成、細(xì)胞癌變等信號(hào)分子具有調(diào)控作用。

多囊卵巢綜合征；子宮內(nèi)膜癌；小檗堿

多囊卵巢綜合征是臨床常見(jiàn)的生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂性疾病，由Stem和Leventhal于1935年首次提出，發(fā)病率約占育齡期婦女的10%，目前研究認(rèn)為胰島素抵抗和高雄激素血癥可能是PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的高危風(fēng)險(xiǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn),小檗堿具有與二甲雙胍相似的生物學(xué)行為，可改善胰島素抵抗，同時(shí)具有抑制卵巢細(xì)胞分泌雄激素水平的作用[2]，因此本研究選擇小檗堿作為治療藥物，進(jìn)一步探討小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜病變的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小檗堿(上?？稻呕び邢薰?；二甲雙胍 (Sigma公司)；重組人胰島素注射液(禮來(lái)蘇州制藥有限公司)；注射用人絨毛膜促性腺激素 (麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)睪酮檢測(cè)試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)；電化學(xué)發(fā)光試劑盒(Roche公司)；兔二步法檢測(cè)試劑盒(中杉金橋)；ERα(Santa Cruze公司)；PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)Poretsky法[3]建立PCOS大鼠模型，選取 90日齡 SD 雌性大鼠120只，體質(zhì)量180 g左右。分籠正常飼養(yǎng)，正常飲食水，隨機(jī)分為：1)對(duì)照組30只，每日皮下注射注射用生理鹽水 0.2 ml，連續(xù)注射22日。建模后第23日起每只大鼠給予吐溫-80生理鹽水混合液2 ml灌胃，1次/日，連續(xù)灌胃28日。2)模型組、小檗堿組及二甲雙胍組各30只，采用Poretsky法構(gòu)建PCOS大鼠模型，每只皮下注射HCG 3.0 IU/d;每日皮下注射胰島素,第1日自0.5 IU/d開(kāi)始，逐漸遞增至6.0 IU/d,并按此劑量維持至第22日。建模第23日起每只大鼠給予吐溫-80生理鹽水混合液2 ml灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃28日。藥粉均溶在吐溫-80生理鹽水混合液，以小檗堿200 mg/(kg·d)[4]，二甲雙胍300 mg/(kg·d)[5]為灌胃濃度。

1.3 睪酮水平檢測(cè)

待藥物干預(yù)治療結(jié)束，抽取眼眶靜脈血離心后，檢測(cè)血清T水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)睪酮。

1.4 ERα蛋白檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)大鼠斷髓處死后取子宮組織，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)ERα蛋白表達(dá)情況。

1.5 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)量

各組大鼠斷髓處死后取子宮內(nèi)膜組織，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PTEN、Kras mRNA 在各組大鼠子宮內(nèi)膜組織基因表達(dá)情況。使用SYBR Green PCR Master Mix 進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)。檢測(cè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct) ，求出基因相對(duì)內(nèi)參基因β-actin表達(dá)量的變化ΔCt，即ΔCt=目的基因Ctmean-內(nèi)參基因Ctmean，計(jì)算2-ΔΔCt數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠睪酮水平比較

模型組與空白組比較，睪酮分別為(339.33±66.41)、(243.04±69.08)pg/ml，差異極顯著(P<0.01)。小檗堿組與模型組比較，睪酮分別為(206.14±14.63)、(339.33±66.41)pg/ml，差異極顯著(P<0.01)。二甲雙胍組與模型組比較，睪酮分別為(250.67±33.23)、(339.33±66.41)pg/ml，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠睪酮水平比較

注：與空白組比較，*P<0.01;與模型組比較，△P<0.01。

2.2 雌激素受體α蛋白在子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況比較

模型組與空白組比較，ERα蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為91.67%、16.67%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小檗堿組與模型組比較，ERα蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別33.33%、91.67%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組與模型組比較，ERα蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為25.00%、91.67%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖1。

表2 雌激素受體α(ERα)表達(dá)[n(%)]

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

圖1 小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜ERα蛋白的影響

2.3 PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜組織Kras mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)情況比較

模型組與空白組比較，Kras mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(82.915 9±8.836 7)、(1.000 0±0.000 0),t=-20.728,P=0.000。小檗堿組與模型組比較，Kras mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(12.432 9±1.872 2)、(82.915 9±8.836 7),t=-17.448,P=0.000；二甲雙胍組與模型組比較，Kras mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(1.397 0±0.406 6)、(82.915 9±8.836 7),t=-20.606,P=0.000。結(jié)果見(jiàn)表3，圖2。

表3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Kras mRNA、PTEN mRNA情況比較

注：與空白組比較，*P<0.01;與模型組比較，△P<0.01。

圖2 小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜Kras mRNA的影響

模型組與空白組比較，PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(20.540 9 ±4.701 9)、(1.000 0±0.000 0),t=-9.293,P=0.000。小檗堿組與模型組比較，PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.168 6±0.264 8)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.673,P=0.000；二甲雙胍組與模型組比較，PTEN mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(0.529 9±0.362 6)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.488,P=0.000。結(jié)果見(jiàn)表3,圖3。

圖3 小檗堿對(duì)PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜PTEN mRNA的影響

3 討論

多囊卵巢綜合征患者發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的發(fā)病率逐年升高[6-10]，研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜持續(xù)受到雌激素的刺激、高胰島素血癥以及肥胖是促使形成子宮內(nèi)膜癌變的重要因素[11]。Harding等研究發(fā)現(xiàn),在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的影響因素里胰島素抵抗發(fā)揮著非常重要的作用，甚至與因接觸外源性雌激素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌變的患者相比，胰島素抵抗患者更具有發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的高危風(fēng)險(xiǎn)[12]。Shafiee進(jìn)行一項(xiàng)回顧性研究評(píng)估PCOS患者子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的機(jī)制，可能是通過(guò)分子級(jí)細(xì)胞調(diào)控的，胰島素樣生長(zhǎng)因子及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的功能被激活，導(dǎo)致胰島素水平升高，通過(guò)激活PI3K/AKT及Ras/MAPK信號(hào)通路，加速細(xì)胞有絲分裂的作用[13]?；蚪M學(xué)和蛋白組學(xué)已經(jīng)證實(shí)在PCOS患者子宮內(nèi)膜組織里胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路影響子宮內(nèi)膜癌變的基因和蛋白，其表達(dá)均上調(diào)[14]。Savaris研究也指出,過(guò)度激活PCOS子宮內(nèi)膜MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，可以導(dǎo)致PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜病變，而激活MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路是由胰島素抵抗和高胰島素血癥調(diào)控的[15]。

胰島素增敏劑二甲雙胍通過(guò)改善胰島素抵抗，可以逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜的增生，降低PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變的風(fēng)險(xiǎn)。Engelman等研究認(rèn)為,二甲雙胍作為胰島素增敏劑，通過(guò)改善胰島素敏感性，減輕體質(zhì)量，可阻止PCOS患者發(fā)展成子宮內(nèi)膜癌，臨床上可以顯著阻止癌癥細(xì)胞的癌變[16]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將具有胰島素增敏作用的二甲雙胍作為治療子宮內(nèi)膜癌的參考用藥。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),二甲雙胍可以阻止子宮內(nèi)膜增生，在使增生的子宮內(nèi)膜組織恢復(fù)正常的過(guò)程中起到積極地調(diào)控作用[17]。

Hsu等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),小檗堿可以改善AKT/PI3K信號(hào)通路，改善胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，顯著改善胰島素抵抗[18]。同時(shí)小檗堿具有植物性抗癌成分，作為從植物中提取的生物堿，具有廣泛的生物學(xué)活性，可以治療多種疾病。子宮內(nèi)膜病變與雌孕激素長(zhǎng)期刺激密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可以顯著降低雌激素受體α蛋白的表達(dá)，使雌激素的生物學(xué)功能在子宮內(nèi)膜局部的作用降低，減少雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜的持續(xù)刺激，降低發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)甾體激素水平發(fā)現(xiàn),小檗堿具有降低睪酮水平的作用，并且小檗堿降低雄激素睪酮的療效優(yōu)于二甲雙胍。本實(shí)驗(yàn)為研究PCOS相關(guān)子宮內(nèi)膜癌變的作用機(jī)制，選取原癌基因Kras和抑癌基因PTEN作為研究指標(biāo)。小檗堿可以使PCOS模型大鼠子宮內(nèi)膜組織Kras和PTEN mRNA表達(dá)均下降，與二甲雙胍作用趨勢(shì)是一致的。PTEN mRNA表達(dá)下降的原因可能是PTEN廣泛影響細(xì)胞功能，細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)降低，可能使更多的AKT蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)，使胰島素信號(hào)通路發(fā)生變化，PTEN編碼的蛋白具有酪氨酸磷酸化特性，可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)與癌變相關(guān)的信號(hào)通路[19]。因此，小檗堿通過(guò)增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，抑制細(xì)胞增殖，對(duì)甾體激素合成、細(xì)胞增殖、內(nèi)膜癌變等信號(hào)分子具有調(diào)控作用,可以防治PCOS發(fā)生子宮內(nèi)膜癌變。

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EffectofBerberineontheEndometriaofthePCOSRats

LIUYi-chao1,2,FUYang1,GUOYing1,GUOQi1,HANFeng-juan3*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheSecondHospitalofHarbin,Harbin150056China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To explore the influence of Berberine on testosterone level and the expressions of endometrial gene and its protein in rats with polycystic ovarian syndrome (PCOS). Methods:120 female Sprague-Dawley rats of 90 days were made into PCOS models with 22-day subcutaneous injection of insulin and human chorionic gonadotropin(HCG). After modeling, Berberine was given to rats in the next 28 days. The testosterone levels was tested by ELISA method; the protein expression of endometrial estrogen receptor α(Era) was detected with immunohistochemical method; the expression levels of endometrial Kras and PTEN mRNA gene were detected with qRT-PCR technique. Results:Compared to the model group, the testosterone level in Berberine group was significantly decreased(P<0.05); the positive protein expression of Era, and the gene expressions of Kras and PTEN mRNA were significantly reduced in endometrial tissue(P<0.05). Conclusion: Berberine has significant effects on the endometria of PCOS rats, which regulates the hormone synthesis and cell carcinoma.

Polycystic ovary syndrome(PCOS); Endometrial carcinoma; Berberine

國(guó)家中醫(yī)藥管理局國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)課題(No.JDZX2012038)

劉逸超(1983-)，女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)婦科學(xué)專業(yè)博士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)治療婦科疾病。

韓鳳娟*(1971-)，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：婦科腫瘤。

2017-03-15

修回日期：2017-04-10

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0016-04