黃麗卿 ， 羅麗萍 ， 張亞茹 ， 王 忠 ， 夏兆飛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 北京海淀100193)

屎腸球菌NCIMB11181對鼠傷寒沙門菌感染肉雞生產(chǎn)性能、腸道微生物菌群和血液抗氧化功能的影響

黃麗卿1， 羅麗萍1， 張亞茹1， 王 忠2， 夏兆飛1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 北京海淀100193)

本試驗旨在研究飼糧添加屎腸球菌對鼠傷寒沙門菌感染肉雞的生產(chǎn)性能、腸道微生物菌群和血液抗氧化功能的影響。試驗選取432只1日齡羅斯308雄性肉雞，隨機分為4個試驗組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞。分別在各試驗組基礎(chǔ)飼糧中添加0、100、200、300 mg/kg屎腸球菌。在11，12日齡時，各個試驗組口服鼠傷寒沙門菌(1×109CFU/mL，1 mL/只雞)。結(jié)果：(1)與無添加組相比，飼糧中添加屎腸球菌可顯著提高1～21 d，22～35 d和1～35 d日采食量和日增重(P<0.05)；(2)與無添加組相比，添加屎腸球菌可顯著降低感染前期有害菌大腸桿菌和沙門菌的數(shù)量(P<0.05)，能顯著提高感染前期和后期屎腸球菌的數(shù)量(P<0.05) ；(3)與無添加組相比，屎腸球菌的添加能顯著降低感染前期GSH-Px和MDA含量(P<0.05)；在感染后期，屎腸球菌組MDA含量顯著降低(P<0.05)。表明飼糧中添加屎腸球菌可以緩解鼠傷寒沙門菌感染導(dǎo)致的肉雞飼料轉(zhuǎn)化效率下降、腸道菌群失調(diào)及機體的氧化應(yīng)激損傷。肉雞在沙門菌感染的情況下，飼糧中屎腸球菌的適宜添加劑量為200 mg/kg。

屎腸球菌 ； 肉雞 ； 沙門菌感染 ； 生產(chǎn)性能 ； 盲腸微生物 ； 抗氧化

家禽沙門菌病是一種危害雛雞存活率、蛋雞產(chǎn)蛋率和孵化率的一種重要細菌性疾病。家禽是沙門菌的主要細菌庫，其中的副傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，可通過污染的禽產(chǎn)品如雞蛋、雞肉等感染人類，導(dǎo)致人沙門菌腸炎[1]。因此，預(yù)防和控制家禽沙門菌感染是保障家禽產(chǎn)品安全和人類健康的必要前提。畜禽試驗研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌有提高飼料轉(zhuǎn)化效率[2-3]；抑制或殺滅沙門菌、大腸桿菌、梭菌等病原菌[2]，維持動物腸道微生物區(qū)系平衡[4]；提高機體抗氧化功能[5]等的作用。 然而關(guān)于屎腸球菌對鼠傷寒沙門菌感染肉雞的生產(chǎn)性能、腸道微生物區(qū)系和血液抗氧化功能的影響尚未見報道。

本試驗通過口服鼠傷寒沙門菌建立肉雞腸道感染模型，旨在研究屎腸球菌對鼠傷寒沙門菌感染肉雞生產(chǎn)性能、盲腸微生物區(qū)系和血液抗氧化功能的影響。為屎腸球菌在肉雞生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 鼠傷寒沙門菌CAU0103，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。屎腸球菌NCIMB11181，英國歐碧緹絲國際有限公司(Probiotics International Ltd.)含量≥2.00×1012CFU/kg。

1.2 試驗動物和試驗設(shè)計 試驗選取432只1日齡羅斯308公雞，隨機分為4個處理組，每個處理組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞。試驗各組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0、100、200、3 000 mg/kg屎腸球菌。在11、12日齡時，各處理組肉雞口服感染1 mL鼠傷寒沙門菌(細菌濃度為1×109CFU/mL)。試驗期為35 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧和試驗管理 參照中國肉雞飼養(yǎng)標準(2004)配制，試驗采用玉米-豆粕型飼糧，分兩階段飼喂(1～21日齡為前期，22～35日齡為后期)?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分含量見表1。試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州家禽營養(yǎng)與飼料科學(xué)試驗基地進行。采用雙層籠養(yǎng)方式，在全期飼養(yǎng)過程中自由采食，乳頭式飲水器飲水，進行常規(guī)免疫和防疫等，試驗期共35 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1：維生素預(yù)混料每千克飼糧提供：維生素A 12 500 IU，維生素D32 500 IU，微生物E 18.75 mg，維生素K3，2.65 mg，維生素B1，2 mg，維生素B26 mg，維生素B66 mg，維生素B120.025 mg，生物素0.032 5 mg，葉酸 1.25 mg，泛酸12 mg，煙酸50 mg

2：微量元素預(yù)混料每千克飼糧提供：銅8 mg，鋅75 mg，鐵80 mg，錳100 mg，硒0.15 mg，碘0.35 mg

3：為理論計算值

1.4 檢測指標和方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 分別于鼠傷寒沙門菌攻毒后9 d和17 d稱量肉雞體重和飼料剩余量，計算肉雞各階段平均采食量、平均體增重和耗料增重比。

1.4.2 盲腸微生物計數(shù) 無菌采集感染后3 d和7 d的盲腸，進行盲腸細菌計數(shù)。具體方法如下：稱取0.5 g左右食糜[6-7]，置于滅菌離心管中。加滅菌生理鹽水至5 mL，倍比稀釋至10-7g/mL。取100 μL接種到相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上，每個梯度2個重復(fù)，選取菌落在30～300個之間的平板進行細菌計數(shù)。其中大腸桿菌選用麥康凱培養(yǎng)基(北京陸橋生物技術(shù)責任有限公司，CM908)，沙門菌用S.S.瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋生物技術(shù)責任有限公司，CM206-01)，37℃培養(yǎng)24h；乳酸菌用MRS瓊脂培養(yǎng)基(北京陸橋生物技術(shù)責任有限公司，CM187)，雙歧桿菌選用BL瓊脂培養(yǎng)基[12](北京陸橋生物技術(shù)責任有限公司，CM194)，5%CO2條件下37 ℃培養(yǎng)48 h。腸球菌的稀釋方法同上，接種到平板時取1 mL稀釋溶液，加到滅菌平皿中，并與降溫后的腸球菌培養(yǎng)基[12](北京陸橋生物技術(shù)責任有限公司，CM1507)混合，搖勻，37 ℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果用每克腸道內(nèi)容物中細菌個數(shù)的對數(shù)表示(1g CFU /g)

1.4.3 外周血抗氧化指標 使用南京建成生物工程公司試劑盒結(jié)合分光光度法測量總超氧化物歧化酶(T-SOD，A001-1)，總抗氧化能力(T-AOC，A015)，丙二醛(MDA，A003-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，A005)。

1.5 數(shù)據(jù)處理 經(jīng)Excel2007初步處理后，對所有處理組采用SPSS 17.0軟件進行One-Way ANOVA分析。統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 生產(chǎn)性能 見表2。由表2可見，與無添加組相比，飼糧中添加不同劑量的屎腸球菌可顯著增加1～21 d，22～35 d和1～35 d的日采食量和日增重(P<0.05)，200 mg/kg和300 mg/kg添加組效果尤為顯著；對料肉比沒有顯著影響(P> 0.05)。

表2 飼糧添加屎腸球菌對感染鼠傷寒沙門菌肉雞生產(chǎn)性能的影響

注：同行數(shù)據(jù)無肩標或相同字母肩標表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母肩標表示差異顯著(P<0.05)，下表同

2.2 盲腸微生物計數(shù) 見表3。 從表3可看出，與無添加組相比，添加屎腸球菌可顯著降低感染前期有害菌大腸桿菌和沙門菌的數(shù)量(P<0.05)，能提高有益菌乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，差異不顯著(P>0.05)，能顯著提高屎腸球菌的數(shù)量(P<0.05)；后期對腸道有害菌和有益菌作用均不顯著(P>0.05)，但能顯著提高屎腸球菌的數(shù)量(P<0.05)。

表3 飼糧添加屎腸球菌對感染鼠傷寒沙門菌肉雞腸道菌群的影響

注： dpi, days post-infection，感染后天數(shù)

2.3 外周血抗氧化指標 從表4可看出，與無添加組相比，屎腸球菌的添加能顯著降低感染前期GSH-Px和MDA含量(P<0.05)，但高劑量添加組MDA含量高；對T-SOD活力和T-AOC含量無顯著影響(P> 0.05)。在后期，添加屎腸球菌能顯著降低MDA含量(P<0.05)，但高劑量添加組MDA含量高；對T-SOD和T-AOC無明顯影響(P>0.05)。

表4 飼糧添加屎腸球菌對感染鼠傷寒沙門菌肉雞外周血抗氧化指標的影響

3 討論

3.1 生產(chǎn)性能 沙門菌感染能夠引起畜禽腹瀉、導(dǎo)致胃腸道炎癥，降低生產(chǎn)性能，主要表現(xiàn)在日增重降低，而料肉比升高。Marcq等人[8]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞口服鼠傷寒沙門菌可導(dǎo)致平均日增重顯著降低。Yan[3]和Levkut[4]發(fā)現(xiàn)，添加屎腸球菌可以提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗發(fā)現(xiàn)，與無添加組相比，飼糧中添加不同劑量的屎腸球菌，可顯著增加各階段的日采食量和日增重(P< 0.05)，200 mg/kg和300 mg/kg添加組效果尤為顯著，與之前的研究結(jié)果相符。但添加屎腸球菌對各階段料肉比的影響不顯著(P> 0.05)，這與之前的報道不符，可能原因是本試驗肉雞進行了沙門菌攻毒，與健康肉雞機體狀態(tài)不一致所造成的。

3.2 盲腸微生物計數(shù) 動物機體受到外界刺激，比如應(yīng)激、飼料結(jié)構(gòu)成分的改變、病原微生物感染等，會破壞腸道菌群的穩(wěn)態(tài)[3]。研究表明，屎腸球菌可以抑制腸道致病菌的增殖, 包括產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，沙門菌[4]，志賀菌和梭菌[2]?？娠@著提高腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸菌[8]的數(shù)量。但有研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌對腸道厭氧菌和總腸桿菌的數(shù)量無明顯影響[9]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，與無添加組相比，添加屎腸球菌可顯著降低感染前期有害菌大腸桿菌和沙門菌的數(shù)量(P<0.05)，結(jié)果與Hasan[2]和Levkut[4]報道一致。后期對腸道有害菌和有益菌的作用均不顯著(P> 0.05)，與Scharek[9]研究結(jié)果相符。能顯著提高感染前期和后期的屎腸球菌數(shù)量(P<0.05)，與Marcinakova[10]研究結(jié)果相似。由此可以看出，在本試驗中，屎腸球菌起主要的保護作用。

3.3 血液抗氧化指標 過量自由基可氧化細胞膜脂肪酸和干擾細胞DNA及蛋白質(zhì)合成來破壞細胞結(jié)構(gòu)[11]。因此，氧化應(yīng)激可嚴重影響肉雞的健康狀況，最終影響肉雞生產(chǎn)性能[11]。機體內(nèi)重要的抗氧化酶有GSH-Px，T-AOC，SOD和MDA[12]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能產(chǎn)生多種抗氧化酶，清除過多的黏膜自由基，提高機體抗氧化能力[13]。但本研究發(fā)現(xiàn)，添加益生菌屎腸球菌降低了T-SOD活性、T-AOC含量和GSH-Px活性降低，與段穎[14]研究結(jié)果不符，可能的原因是本試驗進行了鼠傷寒沙門菌的攻毒，與未攻毒機體狀態(tài)不一致所造成的。也有可能是屎腸球菌作為腸道益生菌，其對機體抗氧化的作用是提高黏膜抗氧化能力，因而在血清中檢測到的抗氧化酶含量較低。屎腸球菌添加組的血清 MDA含量顯著降低(P<0.05)，表明屎腸球菌可有效緩解大腸桿菌感染造成的氧化應(yīng)激損傷，機體細胞膜受損程度低，這與唐志剛等[5]研究報道相似。前期和后期添加300 mg/kg屎腸球菌的MDA含量高，反應(yīng)機體生物膜損傷嚴重，提示屎腸球菌添加劑量過高會對機體造成危害。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在致病性鼠沙門菌感染的情況下，肉雞飼糧中添加屎腸球菌通過調(diào)節(jié)機體抗氧化體系的平衡，增加腸道中腸球菌的數(shù)量，抑制致病性大腸桿菌和沙門菌的增殖和改善飼料轉(zhuǎn)換率，來抵抗鼠傷寒沙門菌感染。綜合試驗結(jié)果，肉雞飼糧中添加200 mg/kg屎腸球菌可有效預(yù)防鼠傷寒沙門菌感染。

[1] 辛朝安.禽病學(xué)[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：162-168.

[2] Hasan E S, Nizamettinl S, Fisun K,etal. Effects ofEnterococcusfaeciumand dried whey on broiler performance, gut histomorphology and microbiota[J]. Animal Nutrition,2007,61(1):42-49.

[3] Yan F, Cao H, Cover T L,etal. Soluble proteins produced by probiotic bacteria regulate intestinal epithelial cell survival and growth[J]. Gastroenterology, 2007,132(2):562-575.

[4] Levkut M, Revajova V, Laukova,etal. Leukocytic responses and intestinal mucin dynamics of broilers protected withEnterococcusfaeciumEF55 and challenged withSalmonellaEnteritidis[J]. Research in Veterinary Science,2012,93:195-201.

[5] 唐志剛，溫超，王恬，等. 在不同營養(yǎng)水平飼糧中添加益生菌對肉雞抗氧化功能、黏膜免疫及回腸菌群的影響[J].中國糧油學(xué)報，2013，28：70-74.

[6] 甘利平，李追，郭雙雙，等.飼喂復(fù)合脂肪酸酯及糞腸球菌對改善肉雞早期腸道健康的影響[J].飼料研究，2016，23:1-8.

[7] 王忠，強文軍，咼于明，等.β-1,3-葡聚糖對感染沙門菌雞免疫功能和腸道菌群數(shù)量的影響[J].中國家禽，2010，32(5):14-18.

[8] Marcq C, Cox E, Szalo I M,etal.SalmonellaTyphimuriumoral challenge model in mature broilers: bacteriological, immunological, and growth performance aspects[J]. Poultry Science, 2011,90(1):59-67.

[9] Scharek L, Guth J, Reiter K,etal. Influence of a probioticEnterococcusfaeciumstrain on development of the immune system of sows[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2005, 105:151-161.

[10] Marcinakova M, Strompfova V, Boldizarova K,etal. Effect of potential probiotic Enterococcus faecium strains on selected microflora in turkeys[J]. Czech Journal of Animal Science, 2005, (50):341-346.

[11] Rajput I R, Yan L L, Xu X,etal. Supplementary Effects ofSaccharomycesboulardiiandBacillussubtilisB10 on digestive enzyme activities, antioxidation capacity and blood homeostasis in Broiler[J]. International Journal of Agriculture and Biology, 2013,15(2): 231-236.

[12] Russel J, Dun X R, Carmen T,etal. Actions of melatonin in the reduction of oxidative stress[J]. Journal of Biomedical Science,2000, 7:444-458.

[13] Rochat T, Gratadoux J, Gruss A,etal. Production of a heterologous nonheme catalase byLactobacilluscasei: an efficient tool for removal of H2O2and protection ofLactobacillusbulgaricusfrom oxidative stress in milk[J]．Applied and Environmental Microbiology,2006,72: 5 143-5 149.

[14] 段穎，趙玉鑫，潘翠玲，等. 富硒益生菌對蛋雞抗氧化能力和腸道菌群及消化酶活性的影響[J] .南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，33(2)：68-72.

Effects of dietary supplementation of probioticEnterococcusfaeciumNCIMB11181, on growth performance, intestinal microflora and serum antioxidant in broiler chickens challenged withSalmonellatyphimurium

HUANG Li-qing1, LUO Li-ping1, ZHANG Ya-ru1, WANG Zhong2, XIA Zhao-fei1

(1.College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193,China ; 2.College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

The effects of feedingEnterococcusfaeciumon growth performance, cecal microflora and serum antioxidant capacity in broiler chickens challenged withSalmonellatyphimuriumwere investigated. Four hundred thirty-two 1-day-old birds were randomly assigned to 4 treatments with six replicates and each replicate contains twelve birds. The basal diet of 4 treatments were added with different dose ofEnterococcusfaecium: 0, 100, 200 and 300 mg/kg. All birds were oral challenged withSalmonellatyphimurium(1×109CFU/mL，1mL/bird)on day 11 and 12. The results showed as follows:1) Compared with unsupplemented group (NG),the supplementation ofEnterococcusfaeciumincreased the ADFI and ADG on 1-21 d, 22-35 d and 1-35 d (P< 0.05); 2) Compared with NG group,Enterococcusfaeciumsupplementation decreased the concentration of cecalE.coliandsalmonella(P< 0.05) at 3d post-infection. while the number ofE.faeciumwas increased at both 3d and 7d post-infection(P< 0.05). 3) Compared with NG group,Enterococcusfaeciuminclusion decreased serum Glutathione peroxidase(GSH-Px) activity and serum malondialdehyde (MDA) concentration (P< 0.05) at 3d post-infection.Enterococcusfaeciumaddition reduced the concentration of serum MDA (P<0.05)at 7d post-infection. These results suggest thatE.faeciumcan promote growth performance, beneficially manipulate the cecal microflora and improve antioxidant capability in broilers challenged withSalmonellatyphimurium. The recommendation additional dose is 200mg/kg in basal diet.

broilers ;Enterococcusfaecium;Salmonellatyphimuriuminfected ; performance ; microflora ; antioxidant

XIA Zhao-fei

2017-02-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市家禽創(chuàng)新團隊(CARS-PSTP)

黃麗卿(1992-)，女，碩士生，研究方向為臨床內(nèi)科學(xué)，E-mail: hlqtotoro@163.com；羅麗萍(1990-)，女，碩士，從事小動物營養(yǎng)研究，E-mail:631834439@qq.com

注：羅麗萍與黃麗卿對本文具有同等貢獻

夏兆飛，E-mail: drxia@126.com

S828

A

0529-6005(2017)07-0016-04