河北中醫(yī)學(xué)院(石家莊 050200)

潘麗佳 張俊茶 范璽勝 張曉琪 劉 君 邢海嬌 張選平 楊延巍 佘延芬

刮痧對正常大鼠局部肥大細(xì)胞功能狀態(tài)的影響*

河北中醫(yī)學(xué)院(石家莊 050200)

潘麗佳 張俊茶 范璽勝 張曉琪 劉 君 邢海嬌 張選平 楊延巍 佘延芬

目的：觀察刮痧前后局部肥大細(xì)胞的功能狀態(tài)，揭示刮痧療法的部分作用機(jī)制。方法：正常Wistar大鼠隨機(jī)分為刮痧前組、刮痧后即刻組，刮痧后30 min組、刮痧后60 min組、刮痧后90 min組，每組10只。除刮痧前組外，其余各組均給予刮痧干預(yù)，刮拭部位為大鼠背部督脈、兩側(cè)膀胱經(jīng)，刮拭方法為刮法，頻次為60次/分，刮拭時間30 s。各組分別于刮痧前、刮痧后即刻、30、60、90 min脫頸處死，于大鼠背部一側(cè)膀胱經(jīng)上出痧最明顯處取材。分別采用甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化的方法觀察肥大細(xì)胞數(shù)量以及脫顆粒情況、類胰蛋白酶表達(dá)情況。結(jié)果：各組肥大細(xì)胞數(shù)比較差異無顯著性，P>0.05；各組肥大細(xì)胞脫顆粒率比較差異無顯著性，P>0.05；各組類胰蛋白酶陽性細(xì)胞數(shù)比較差異無顯著性，P>0.05。結(jié)論：刮痧后以及刮痧后的90 min內(nèi)肥大細(xì)胞的功能狀態(tài)并未發(fā)生明顯改變，刮痧即刻未對正常大鼠局部肥大細(xì)胞產(chǎn)生影響，推測刮痧療法的即刻效應(yīng)與肥大細(xì)胞無關(guān)。

肥大細(xì)胞；刮痧；類胰蛋白酶；大鼠；實(shí)驗(yàn)研究

刮痧是應(yīng)用特制的刮痧工具，在人體體表的腧穴、經(jīng)絡(luò)及病變部位進(jìn)行刮拭，達(dá)到防病、治病目的的一種治療方法，具有方法獨(dú)特、簡便安全、患者易于接受、適應(yīng)癥廣、療效可靠等特點(diǎn)。[1]如今刮痧療法不僅在國內(nèi)受到群眾的歡迎，在國際上也受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用，而其治療機(jī)理卻尚不明確，相關(guān)研究也有待進(jìn)一步深化。[2]皮膚毛細(xì)血管、神經(jīng)末梢豐富，是體表防衛(wèi)、溫度調(diào)節(jié)的重要器官，刮痧主要通過刺激局部皮膚而發(fā)揮作用，刮痧的作用機(jī)制復(fù)雜與刺激皮膚后通過多種途徑發(fā)揮作用密切相關(guān)。而肥大細(xì)胞廣泛分布于皮膚及內(nèi)臟黏膜下的微血管周圍，目前許多研究表明，肥大細(xì)胞不僅參與肌體過敏、炎癥、組織損傷修復(fù)、免疫等反應(yīng)，還與很多生理病理過程有關(guān)。[3]在針刺效應(yīng)機(jī)理研究中，肥大細(xì)胞的功能狀態(tài)被認(rèn)為是針刺起效的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一，在刮痧的效應(yīng)機(jī)理研究中，肥大細(xì)胞的功能作用研究極少，刮痧后穴位處的肥大細(xì)胞功能狀態(tài)是否發(fā)生變化，刮痧是否也通過激活肥大細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)目前尚不清楚。因此，本研究從刮痧作用于正常大鼠皮膚后的出痧部位入手，觀察刮痧后90 min內(nèi)肥大細(xì)胞功能狀態(tài)的變化以及類胰蛋白酶檢測肥大細(xì)胞活性變化，探討肥大細(xì)胞在刮痧療法即刻療效中的作用機(jī)制，以揭示刮痧療法的部分作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料 選用健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(250±20) g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，不限進(jìn)食、飲水，自然光照，室溫22℃～24℃，相對濕度(50%±5%)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 肥大細(xì)胞類胰蛋白酶鼠單克隆抗體[AA1]，山羊抗小鼠Ig G/HP聚合物，DAB顯色試劑盒(20×)，脫毛膏；病理圖文分析系統(tǒng)，光學(xué)顯微鏡，冰凍切片機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將動物隨機(jī)分為5組，根據(jù)刮痧后觀察時間的不同分為刮痧前組、刮痧后即刻組、刮痧后30 min組、刮痧后60 min組、刮痧后90 min組，每組10只。

1.4 各組干預(yù)方 各組大鼠于實(shí)驗(yàn)干預(yù)前24 h脫毛膏備皮，刮痧前組不給予刮痧干預(yù)，但給予同樣時間的抓取和固定，其余各組均給予刮痧干預(yù)。刮拭部位：大鼠背部督脈、兩側(cè)膀胱經(jīng)，參照《常用實(shí)驗(yàn)動物穴位定位圖譜》、《腧穴名稱與定位》(GB/T12346-2006)結(jié)合比較解剖學(xué)進(jìn)行定位，刮拭方法為刮法，手法為平補(bǔ)平瀉，刮拭次數(shù)為20次，操作方法參照“新世紀(jì)全國高等中醫(yī)藥院校創(chuàng)新教材”《刮痧療法》。刮痧前組、刮痧后即刻組、刮痧后30 min組、刮痧后60 min組、刮痧后90 min組分別于刮痧前，刮痧后即刻、30、60、90 min處死取材。

1.5 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測方法 各組大鼠干預(yù)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取大鼠背部一側(cè)膀胱經(jīng)上出痧最明顯處體積約為5×5×3 mm3的組織塊標(biāo)本(包括皮膚、肌肉)。

1.5.1 肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色：組織塊經(jīng)4%多聚甲醛固定液固定，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，制作連續(xù)切片(片厚4 μm)。石蠟切片經(jīng)脫蠟脫水后，TB溶液染色，冰醋酸液分化，脫水透明后封片。在10×40倍光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色特征：成熟肥大細(xì)胞呈圓型或卵圓型，輪廓清晰，胞體較大，細(xì)胞核常位于細(xì)胞中央，胞漿內(nèi)顆粒被染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核著色較淺。脫顆粒肥大細(xì)胞失去原有形態(tài)，細(xì)胞輪廓不完整，紫藍(lán)色顆粒游離于細(xì)胞外。

計數(shù)方法：取2張不連續(xù)切片，均在高倍視野(×400)下選取肥大細(xì)胞數(shù)目最多的5個不重復(fù)視野進(jìn)行計數(shù)，記錄5個視野細(xì)胞總數(shù)和脫顆粒細(xì)胞數(shù)，脫顆粒率=(脫顆粒細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%，取2張切片平均值。[4-5]

1.5.2 類胰蛋白酶免疫組化：石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，用脫蠟修復(fù)液(pH 6.0)微波修復(fù)抗原，滴加肥大細(xì)胞類胰蛋白酶鼠單克隆抗體，冰箱40℃過夜，PBS沖洗后，滴加山羊抗小鼠IgG/HP聚合物，室溫孵育30 min，再用PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片。觀察結(jié)果判定：細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿呈棕黃色或黃褐色為陽性細(xì)胞。

計數(shù)方法：取2張不連續(xù)切片，均在高倍視野(×400)下選取陽性表達(dá)最強(qiáng)的5個不重復(fù)視野進(jìn)行計數(shù)，取2張切片平均值。[6]

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠組織中肥大細(xì)胞數(shù)、肥大細(xì)胞脫顆粒率比較 各組大鼠組織中肥大細(xì)胞數(shù)比較差異無顯著性，P>0.05，各組大鼠組織中肥大細(xì)胞脫顆粒率比較差異無顯著性，P>0.05，詳見表1。

表1

各組刮痧前后肥大細(xì)胞數(shù)、肥大細(xì)胞脫顆粒率比較 ±s,n=10)

2.2 各組大鼠組織中類胰蛋白酶陽性細(xì)胞數(shù)比較 各組大鼠組織中類胰蛋白酶陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異無顯著性，P>0.05，詳見表2。

表2 各組大鼠組織中類胰蛋白酶陽性細(xì)胞數(shù)比較 ±s,n=10)

3 討論

刮痧是中醫(yī)外治疾病的主要方法之一，使用范圍涉及內(nèi)外婦兒等各科疾病和亞健康狀態(tài)的防治，且臨床療效十分顯著。[7]在刮痧作用機(jī)理研究中，Musial F研究團(tuán)隊提出刮痧作為一種反射療法，可能在傷害感受器和脊髓水平作用于慢性疼痛；在外周可能通過C-纖維，Aδ-纖維連接傷害感受器，在脊髓水平通過脊髓丘腦束上行。[8-9]目前有研究結(jié)果顯示刮痧可升高局部皮膚溫度、血流量，改善局部微循環(huán)，促進(jìn)組織細(xì)胞能量代謝，[10-13]并能使皮下毛細(xì)血管擴(kuò)張和破裂，局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，使組織中的TNF-α、IL-6、IL-12、IL-23等炎癥因子上調(diào)，DCs(樹突狀細(xì)胞，dendritic cells)、T淋巴細(xì)胞、F4/80巨噬細(xì)胞等免疫激活細(xì)胞比率升高，細(xì)胞因子水平發(fā)生變化，對血液中的膽紅素、超氧化物歧化酶、細(xì)胞因子、血細(xì)胞及神經(jīng)遞質(zhì)等也有影響，刮痧后皮下組織和血液中相關(guān)化學(xué)物質(zhì)的變化是刮痧提高肌體免疫力，起到保健、治療作用的主要機(jī)理。[14-16]

經(jīng)穴處的肥大細(xì)胞較非經(jīng)穴處數(shù)目更集中，功能更為活躍，針刺可激活局部肥大細(xì)胞，釋放神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、激素等多種信號分子，這些信號分子又可興奮周圍神經(jīng)末梢感受器，釋放大量化學(xué)物質(zhì)，物質(zhì)間相互作用，啟動針刺效應(yīng)。[17-18]本實(shí)驗(yàn)中刮痧前與刮痧后不同時間節(jié)點(diǎn)的肥大細(xì)胞數(shù)比較、肥大細(xì)胞脫顆粒率比較差異均無顯著性(P>0.05)，可見刮痧后90 min內(nèi)肥大細(xì)胞的功能狀態(tài)沒有發(fā)生明顯改變。推測可能與刺激方式不同有關(guān)，刮痧主要以對皮膚的按壓力和摩擦力為主，對皮膚下結(jié)締組織的影響相對較小，而針刺作為一種機(jī)械刺激，針體刺入皮下組織并進(jìn)行提插捻轉(zhuǎn)時，針體可深入到穴位處的結(jié)締組織中，可導(dǎo)致穴區(qū)結(jié)締組織中的膠原纖維變形，細(xì)胞骨架重排，[19]有研究表明穴位處膠原纖維結(jié)構(gòu)的破壞可明顯減弱肥大細(xì)胞脫顆粒程度及手針介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。[20]刮痧對皮膚的刺激是否可導(dǎo)致穴位處膠原纖維變形尚未可知，推測刮痧后肥大細(xì)胞功能狀態(tài)并未激活與刮痧刺激對穴位處膠原纖維的影響程度有關(guān)。另有研究結(jié)果顯示，皮下肥大細(xì)胞膜上存在具有機(jī)械敏感性的TRPV2通道，針刺的機(jī)械力傳遞給皮下的肥大細(xì)胞時，需要達(dá)到一定閾值，該通道才能被激活，進(jìn)而引起胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引發(fā)活性物質(zhì)的分泌釋放，從而作用于周圍的神經(jīng)末梢上行傳導(dǎo)針刺信號。[21]本實(shí)驗(yàn)中刮痧前后肥大細(xì)胞功能狀態(tài)并未發(fā)生明顯改變也可能與刮痧產(chǎn)生的機(jī)械力并沒有達(dá)到一定的閾值，肥大細(xì)胞膜上的TRPV2通道沒有被激活有關(guān)。

肥大細(xì)胞活化后能釋放多種活性物質(zhì)，其中類胰蛋白酶是肥大細(xì)胞活化和釋放顆粒的特異性標(biāo)志。[22]本實(shí)驗(yàn)中，類胰蛋白酶免疫組織化學(xué)染色與肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)特殊染色所得到的結(jié)果一致，刮痧前與刮痧后不同時間節(jié)點(diǎn)的類胰蛋白酶陽性細(xì)胞數(shù)比較差異均無顯著性(P>0.05)，但類胰蛋白酶標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)卻少于甲苯胺藍(lán)特殊染色所得到的肥大細(xì)胞數(shù)，推測與肥大細(xì)胞脫顆粒狀態(tài)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示刮痧后以及刮痧后的90 min內(nèi)肥大細(xì)胞的功能狀態(tài)并未發(fā)生改變，但現(xiàn)有研究結(jié)果顯示刮痧后皮下組織增多物質(zhì)與肥大細(xì)胞激活后釋放的化學(xué)物質(zhì)有許多相似之處，如TNF-α、IL-6等，[15，18]推測刮痧后皮下增多的這些化學(xué)物質(zhì)可能是非肥大細(xì)胞源性，刮痧后短時間內(nèi)可能并沒有通過激活肥大細(xì)胞而發(fā)揮治療和保健效應(yīng)。

[1]楊繼軍,佘延芬.刮痧療法[M].北京:中國中醫(yī)藥,2011.1

[2]LiuM.Y，ChenK.J. Gua Sha, an ancient technical management, for certain illness[J].Chin J Integr Med, 2013，19(1): 3-4

[3]肖淑華，劉陽陽，魏連海，等.肥大細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展,2011,42(2):104-107

[4]薩喆燕,黃猛,張迪,等.手針刺激“足三里”穴局部肥大細(xì)胞活動與外周神經(jīng)放電的相關(guān)性研究[J].針刺研究,2013,38(2):118-122

[5]張迪,丁光宏,沈雪勇,等.肥大細(xì)胞功能對針刺大鼠“足三里”鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響[J]. 針刺研究,2007,32(3):147-152

[6]何天峰,張樹輝,李連波,等.針刺對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜肥大細(xì)胞脫顆粒和類胰蛋白酶表達(dá)的影響[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2010,8(7):670-677

[7]陳蔣楠,顏威,潘飛,等.刮痧療法的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2015,13(8):148-150

[8]MusialF,MichalsenA,DobosG. Functional chronic pain syndromes and naturopathic treatments: neurobiological foundations[J]. Forsch Komplementmed,2008,15(2):97-103

[9]MusialF,SpohnD,RolkeR. Naturopathic reflex therapies for the treatment of chronic back and neck pain - Part 1: Neurobiological foundations[J]. Forsch Komplementmed, 2013,20(3):219-224

[10]徐青燕,楊金生,楊莉,等.委中穴區(qū)刮痧對本經(jīng)同側(cè)經(jīng)脈線上皮膚微循環(huán)血流灌注量的影響[J]. 針刺研究,2013,38(1):52-56

[11]徐青燕,楊金生,楊莉.應(yīng)用紅外熱像技術(shù)監(jiān)測和評價刮痧的臨床效應(yīng)[Z].廈門: 中國針灸學(xué)會砭石與刮痧專業(yè)委員會年會，2014.771-773

[12]XuQY,YangJS,YangL, et al. Effects of different scraping techniques on body surface blood perfusion volume and local skin temperature of healthy subjects[J]. J Tradit Chin Med,2011,31(4):316-320

[13]NielsenA,KnoblauchNT,DobosGJ, et al.The effect of Gua Sha treatment on the microcirculation of surface tissue: a pilot study in healthy subjects[J].Explore (NY),2007,3(5):456-466

[14]簡力.刮痧對皮膚免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用研究[D].南京：南京大學(xué),2015.32-34

[15]崔向清,蔣燕,楊向竹,等.刮痧療法對膽紅素、SOD、IL-1、IL-6、白細(xì)胞、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響初探[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2013,41(1):33-37

[16]ChenT,LiuN,LiuJ, et al. Gua Sha, a press-stroke treatment of the skin, boosts the immune response to intradermal vaccination[J]. PeerJ,2016,4:e2 451

[17]張迪,丁光宏,沈雪勇,等.經(jīng)絡(luò)穴位與肥大細(xì)胞相關(guān)性研究進(jìn)展[J].針刺研究,2005,30(2):115-119

[18]陳波,李明月,郭義,等.肥大細(xì)胞源性外來體參與構(gòu)建針刺穴位效應(yīng)啟動小網(wǎng)絡(luò)的探討[J]. 針刺研究,2015,40(1):82-85

[19]LangevinH.M.,ChurchillD.J.CipollaM.J. Mechanical signaling through connective tissue: a mechanism for the therapeutic effect of acupuncture[J]. FASEB J, 2001，15(12):2 275-2 282

[20]余曉佳,丁光宏,姚偉,等.穴位處膠原纖維在針刺大鼠“足三里”鎮(zhèn)痛過程中的作用[J].中國針灸,2008,28(3):207-213

[21]朱海寧,張迪,黃猛,等. 肥大細(xì)胞對針灸治療過程中的物理刺激的敏感性機(jī)制研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,52(5):681-687

[22]CaugheyGH. Mast cell tryptases and chymases in inflammation and host defense[J]. Immunol Rev,2007,217:141-154

(2017-04-20 收稿)

Effect ofGuashaon the Functional Status of Partial Mast Cells in Normal RatsHebei University of Chinese Medicine

PANLi-jiaZHANGJun-chaFANXi-shengZHANGXiao-qiLIUJunXINGHai-jiaoZHANGXuan-pingYANGYan-weiSHEYan-fen

(Shijiazhuang 050200)

Objective: to observe the functional status of partial mast cells before and after scraping so as to reveal the functional mechanism ofGuashatherapy. Methods: The normal Wistar rats were randomly divided into pre-scraping group, instant group after scraping, 30 min group, 60 min group, and 90 min group, 10 rats each group. Except pre-scraping group, all the others were intervened withGuasha, scraping Du meridian and Bladder meridians, 60 times /min, for 30 seconds each time. The rats of each group were killed off before scraping, and instantly, 30 min, 60min and 90 min after scraping respectively, materials taken from the most obvious part of one Bladder meridian. Toluidine blue staining and Immunohistochemical tests were used to observe the number of mast cells, degranulations and tryptase expression. Results: there was no significant difference between the numbers of mast cells,P>0.05; degranulation rates of each group had no significant difference,P>0.05; there was no significant difference between numbers of positive tryptase,P>0.05. Conclusion: the functional status of mast cells has no obvious changes instantly after scraping and 90 min after scraping, that is,Guashadoes not affect the partial mast cells in normal rats instantly after scraping. It therefore can be predicted that the instant effect ofGuashatherapy is irrelative to mast cells.

mast cells;Guasha; tryptase; rats; experimental study

*河北省科技廳資助項(xiàng)目：No.132777236；河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目：No.2015083；河北中醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目：No.QNZ2016016

佘延芬，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

R244.4

A

1007-5615(2017)04-0046-04

針灸推拿學(xué)研究