楊茹薇+馮懷章+孫慧+徐琳黎+李江濤

摘要：為有效而快速評價不同馬鈴薯品種對馬鈴薯早疫病的抗性水平，選取D5、D19、D30、A1、B1、C3的6個馬鈴薯品種的脫毒試管苗和馬鈴薯早疫病菌為試驗材料，將脫毒試管苗接種馬鈴薯早疫病菌，調(diào)查其生長情況。結(jié)果表明，脫毒試管苗接種適當(dāng)濃度的早疫病孢子囊懸濁液，可判斷不同品種的馬鈴薯試管苗的抗性，其中，B1品種抗病性表現(xiàn)最強。使用孢子懸濁液接種馬鈴薯脫毒試管苗是可行的，可用于對抗性資源的早期評價。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯早疫病；接種；馬鈴薯脫毒試管苗；抗性鑒定

中圖分類號：S532；S432.4+4 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2674-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.018

Abstract： For the effective and rapid evaluation the potato varieties of early blight resistance level， selecting D5，D19，D30，A1，B1，C3 six varieties of virus-free potatos tube plantlets and potato early blight fungus as experimental material， the virus-free tube plantlets inoculated potato early blight fungus， and investigated its growth. The results showed that the virus-free potato tube plantlets inoculation of the appropriate concentration of early blight sporangium suspension， which could diagnose the resistance of different varieties of potato tube seedlings， and B1 breed showed the strongest disease resistance. The use of virus-free potato tube plantlets inoculated with spore suspension was feasible， which could be used for early evaluation of antagonistic resources.

Key words： potato early blight； inoculate； virus-free potato tube plantlets； resistance identification

馬鈴薯是茄科茄屬的一年生草本塊莖植物，是重要的糧食、蔬菜兼用作物。馬鈴薯早疫病由茄鏈格孢（Alternaria dauci）侵染引起，是馬鈴薯生產(chǎn)中嚴重的病害，在馬鈴薯各產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，并有逐年加重的趨勢[1，2]。尤其在發(fā)展中國家被認為是僅次于馬鈴薯晚疫病的第二大馬鈴薯病害[3]。生產(chǎn)上對馬鈴薯晚疫病、病毒病的抗病性評價較多[4，5]，而對早疫病研究較少[6，7]。選用抗病品種是防治馬鈴薯早疫病最經(jīng)濟、最有效的措施，而對馬鈴薯品種抗病性的評價可為馬鈴薯品種種植的合理布局提供可靠依據(jù)[8]。

通過不同品種脫毒試管苗接種早疫病菌的觀察總結(jié)，本試驗擬初步建立馬鈴薯抗早疫病試管苗評價體系，成為最經(jīng)濟有效且能快速應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的手段，并選育出適合新疆栽培的抗早疫病馬鈴薯品種。

1 材料與方法

1.1 材料

選用D5、D19、D30、A1、B1、C3的馬鈴薯脫毒試管苗為接種材料，以接無菌水的材料為對照。

1.2 標(biāo)本采集

2016年7月，在新疆主產(chǎn)區(qū)采集馬鈴薯不同栽培品種的早疫病病樣，將采集到的植株裝于密封袋中，做好標(biāo)記并放入冰盒中，回到實驗室后立即將植物樣品放入4 ℃冷藏冰箱中低溫保存，以確保樣品中早疫病菌的活性。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂17 g，去離子水1 000 mL。每瓶所含培養(yǎng)基體積均為40 mL[9]。

1.4 病原菌的分離、純化與鑒定

將具有典型癥狀的病葉經(jīng)自來水沖洗，洗去病葉表面污物、孢子囊、菌絲等，置于75%乙醇中浸泡30 s，然后放入0.1%升汞中浸泡30 s，再用滅菌水沖洗3遍[10]，放在干凈的濾紙上吸去水。用滅菌刀除去嚴重的部分，取病健交界的葉片，將其背面朝上置于經(jīng)高壓滅菌的PDA平板上，每皿3～4塊，后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)菌落直徑長到1～2 cm時，鏡檢各菌落，確認目標(biāo)菌落。在無菌操作中，從目標(biāo)菌落的邊緣挑取一小塊帶有菌絲的培養(yǎng)基再移接于PDA培養(yǎng)基進行純化，直至菌落生長整齊一致無雜菌出現(xiàn)為止[11]。

分離出的菌株進行統(tǒng)一編號，編號包含樣本采集地點和分離順序等。對分離得到的菌株，在PDA培養(yǎng)基上18 ℃培養(yǎng)，觀察并記錄各菌株的菌落形狀、色澤和生長速度；在顯微鏡下觀測菌絲的形態(tài)，并觀察是否具有孢子囊及其形態(tài)、大小，并照相。參考魏景超[12]的鑒定方法，對所得菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定，最終得到試驗所需菌株。

本試驗共分離獲得28株馬鈴薯早疫病菌，采集地點和菌株編號見表1。

1.5 致病性測定

1.5.1 孢子囊懸濁液準(zhǔn)備 在實驗室無菌條件下，將采集純化后的菌種移至PDA平板培養(yǎng)基上常溫保存，在光照下培養(yǎng)14 d生成孢子囊，在無菌條件下向平板上注入無菌水后過濾，收集孢子囊懸濁液，鏡檢并稀釋到6個孢子囊/100倍視野，備用。

1.5.2 接種方法 待試管苗長至7～8葉時，在無菌環(huán)境下用移液槍吸取10 μL接種至試管苗根莖約5 cm處注入（不接觸底部培養(yǎng)基），每個品種接種10株，以接無菌水作對照，溫度保持在25 ℃。

1.5.3 調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn) 接種后每天調(diào)查1次疫病發(fā)生情況，計算病情指數(shù)和發(fā)病率，并記載病株顯癥葉片數(shù)、病葉顏色、葉片是否脫落、卷枯等，分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[13]。

采用莖部病情分級及反應(yīng)型劃分標(biāo)準(zhǔn)。0級，無任何癥狀；1級，幼苗根莖部稍有變黑，葉片不萎蔫或可恢復(fù)性萎蔫；2級，幼苗根莖部變黑達1～2 cm，葉片不可恢復(fù)性萎蔫，下部葉片偶有脫落；3級，幼苗根莖部變黑超過1～2 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；4級，幼苗根莖部變黑、皺縮，生長點外部葉脫落或整株萎蔫；5級，植株枯死。

病情指數(shù)（DI）=[∑（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）×100]/（病級最高值×調(diào)查株數(shù)）

病情指數(shù)與抗病性的關(guān)系：免疫（I），DI=0；高抗（HR），050。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性測定

接種后各品種對早疫病的抗性結(jié)果見表2。由表2可知，脫毒馬鈴薯試管苗在接種后2 d開始發(fā)病，發(fā)病較輕的是A1和B1，3 d發(fā)病率分別為20%和10%，而D5、D19、D30、C3的發(fā)病率分別為40%、60%、50%、50%。接種后6 d，D5和B1的病情指數(shù)分別為37和20，而D19、D30、A1、C3的病情指數(shù)分別為50、63、45、47；B1的發(fā)病率最低，為20%，D19的發(fā)病率最高，為90%。接種后9 d，D19、A1、B1病情指數(shù)分別為45、43、20，而D5、D30、C3病情指數(shù)均高于50，分別為73、53、57。接種后12 d，除B1外其余品種發(fā)病指數(shù)高于50且發(fā)病率均為100%。

2.2 接種后的發(fā)病情況

接種后2 d發(fā)現(xiàn)各品種對馬鈴薯早疫病的抗性不同。由于接種采用無傷口且不接觸培養(yǎng)基操作，接種后2 d在接種點出現(xiàn)毛狀物，并且向周圍擴展，由于莖部細胞逐漸解體，限制了水分的流動傳遞，造成植株萎蔫，直至死亡。所有接種無菌水的對照在接種點無任何變化，試管苗生長正常。各馬鈴薯品種對早疫病的抗病性見表3。由表3可知，接種后5 d，D5、D19、A1、C3表現(xiàn)為中抗（MR），D30表現(xiàn)為感?。⊿），B1表現(xiàn)為抗?。≧）。接種后10 d，D19、A1表現(xiàn)為中抗（MR），D5、D30、C3表現(xiàn)為感病（S），B1表現(xiàn)為抗病（R）。接種后15 d除B1表現(xiàn)為中抗（MR）外，其余品種均表現(xiàn)為感?。⊿）。由此可見，B1明顯優(yōu)于其他品種，具有較強的抗性。

3 討論

本試驗采用不同品種的脫毒試管苗作為試驗材料，人工接種孢子懸濁液直接侵染瓶內(nèi)試管苗，可觀測試管苗的感病情況，能排除田間環(huán)境干擾因素，縮短鑒定周期。試管苗接種法變量單一、反映更加直觀，能快速有效地進行生長及發(fā)病后癥狀觀察，為生產(chǎn)上選用抗病品種提供了依據(jù)，初步建立馬鈴薯試管苗抗早疫病評價體系，成為最經(jīng)濟有效且能快速應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的方法。

根據(jù)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種間抗病性存在明顯差異，接種濃度選用6個孢子囊/100倍視野，接種試管苗齡選擇在7～8葉期，接種后10 d調(diào)查并統(tǒng)計病情指數(shù)，即可準(zhǔn)確判斷供試品種的抗病性情況。接種早疫病菌后的試管苗一般葉部先發(fā)病，逐漸侵染至莖部，導(dǎo)致葉片萎蔫脫落。由此可以判斷是病原菌產(chǎn)生的分泌物毒性，致使植株感病萎蔫死亡。關(guān)于病原菌分泌物如何作用于植株，還有待進一步的探索。

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