咸富榮+溫均皓+樊琛+徐旺燁+鄭煥芹

摘要：為探討Iss抗體對(duì)雞大腸埃希菌（Escherichia coli）血清抗性的抑制作用，將純化的Iss融合蛋白免疫雛雞而獲得抗血清，并對(duì)3株雞大腸埃希菌株O2、O78、CVCC1551進(jìn)行血清抗性抑制試驗(yàn)，分析Iss抗血清對(duì)雞大腸埃希菌血清抗性的抑制作用。結(jié)果表明，抗血清對(duì)O2、O78、CVCC1551等3株致病性-血清抗性，但iss基因氨基酸序列不同的大腸桿菌均產(chǎn)生抑制作用，且抑制作用的程度與抗血清含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：雞大腸埃希菌（Escherichia coli）；Iss抗血清；抑制作用

中圖分類號(hào)：S852.4；S831 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）14-2725-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.032

Abstract： To explore the inhibition of Iss antiserum to the Escherichia coli，the Iss fusion protein was purified and immuned to chickens. The serum resistances of 3 strains were detected after processed by antiserum and negative serum， the inhibition effect of Iss antiserum on E.coli serum resistance was examined. The results showed that Iss antiserum has the inhibition effect on the O2，O78 and CVCC1551，which were virulent-serum resistant stains，and the inhibition rate was related to content of antiserum.

Key words： avian Escherichia coli； Iss antiserum； inhibition

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）可引起人畜共患的細(xì)菌性傳染病，病型復(fù)雜，其中危害最大的是急性敗血型。大腸桿菌的毒力是由多種毒力因子共同作用的，包括黏附素、1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV質(zhì)粒、補(bǔ)體抗性、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞表面改變因子等[1-4]。血清抗性可能受莢膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白調(diào)節(jié)，在多數(shù)菌株中表現(xiàn)出與毒力相關(guān)。iss基因編碼的外膜蛋白可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上對(duì)補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合體敏感的位點(diǎn)，導(dǎo)致表面排斥，使菌體具有抗血清補(bǔ)體溶菌能力[5-7]。

若能抑制菌株的血清抗性（補(bǔ)體抗性），降低菌株在血液中的存活和增殖能力，可減緩大腸桿菌病的進(jìn)程，尤其是減少敗血癥的發(fā)生。本試驗(yàn)制備雞源Iss抗血清，并探討Iss抗血清對(duì)大腸埃希菌血清抗性的抑制作用，為大腸桿菌病的防制提供新的研究方向，并有利于食品安全的防控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 CVCC1551、O78購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；O2為北京發(fā)病雞場(chǎng)分離，經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定的強(qiáng)毒株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室170 mL/L甘油于-70 ℃凍存保存。其中CVCC1551、O2菌株iss基因序列一致，O78菌株核酸序列與O2的同源性99.4%，氨基酸序列同源性98%。

1.1.2 試劑 LB肉湯、麥康凱瓊脂、大腸桿菌大腸菌群測(cè)試片購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雛雞致死試驗(yàn) 將待測(cè)大腸桿菌分別劃板，挑取平板上的單菌落，將細(xì)菌置于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心，經(jīng)PBS洗2次，并用PBS溶液倍比稀釋。1日齡雛雞買回后適應(yīng)環(huán)境1 d，取0.2 mL稀釋液經(jīng)大腿肌肉注射2日齡雛雞，約108 CFU/只，每組5只。連續(xù)觀察7 d，每天計(jì)死亡數(shù)，并對(duì)死亡雛雞進(jìn)行剖檢，取心、血、肝、脾于麥康凱平板上劃線，檢測(cè)大腸埃希菌感染情況[2，5]。

1.2.2 雞源抗血清的制備 純化的Iss融合蛋白0.1 mg與弗氏佐劑1∶1乳化[3]。14日齡雛雞，皮下注射常規(guī)免疫。對(duì)照組注射PBS與弗氏佐劑乳化液[4]。四免7 d后加強(qiáng)免疫1次，5 d后取血，效價(jià)為1∶100，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前56 ℃ 30 min滅活補(bǔ)體[1，2，8]。

1.2.3 Iss抗血清對(duì)菌株血清抗性抑制作用的檢測(cè) 1∶100接菌于LB液體培養(yǎng)基中，按不同比例加入56 ℃ 30 min滅活雞抗血清及對(duì)照組陰性雞血清，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取1 mL菌液8 000 r/min離心，0.6 mol/L NaCl溶液洗2次。0.9%生理鹽水重懸混勻，倍比稀釋。0.1 mL菌液加入0.5 mL生理鹽水、0.4 mL新鮮血清混合，混合物于37 ℃溫育。分別于0、 2 h取樣，涂板計(jì)數(shù)，37 ℃培養(yǎng)18 h，計(jì)活菌數(shù)[1，3]。

試驗(yàn)組：Δlg=lg（2h）-lg（0h）；

對(duì)照組：Δlg=lg（2h）-lg（0h）；

抑制作用：ΔΔlg=Δlg（試驗(yàn)組）-Δlg（對(duì)照組）

以ΔΔlg的值為判定依據(jù)。若ΔΔlg<0，則說明Iss抗血清對(duì)菌株血清抗性有抑制作用；若ΔΔlg≥0，則說明Iss抗血清對(duì)菌株血清抗性無抑制作用[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株致病力結(jié)果

由表1可見，O2、O78、CVCC1551三株菌株雛雞致死率均為100%，屬于致病性菌株，且3株菌株血清抗性較強(qiáng)[6]屬血清抗性菌株。由此可知，3株菌株為致死性-血清抗性菌株。

2.2 抗血清對(duì)菌株血清抗性的抑制作用

56 ℃ 30 min滅活的雞抗血清及對(duì)照組陰性雞血清分別按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000加入菌液，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。收獲菌體，加入新鮮雞血清檢測(cè)試驗(yàn)組及對(duì)照組菌體血清抗性的差值ΔΔlg，結(jié)果見圖1。由圖1可見，當(dāng)抗血清及陰性血清含量降低時(shí)，O2菌株ΔΔlg值增大，即抗Iss抗血清對(duì)細(xì)菌血清抗性的抑制作用越弱?？寡寮瓣幮匝寮尤氡壤秊?∶10 000時(shí)，O2菌株ΔΔlg值為正值，說明此時(shí)抗血清對(duì)O2菌株的血清抗性已無明顯抑制作用；加入比例為1∶10時(shí)，抗血清對(duì)菌株的血清抗性抑制作用最強(qiáng)，但此時(shí)抗性組的平板上菌落數(shù)過少，不利于控制誤差。因此選擇1∶10、1∶100比例進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

按1∶10、1∶100加入抗血清及陰性血清，檢測(cè)抗血清對(duì)菌株O78、CVCC1551的抑制作用（表2）。如表2所示，抗血清含量增加時(shí)，對(duì)菌株血清抗性抑制作用也增強(qiáng)。CVCC1551在加入1∶10抗血清時(shí)仍未顯示抑制作用。但增加抗血清比例至1∶5時(shí)，抗血清顯示出對(duì)菌株血清抗性的抑制作用，ΔΔlg值為 -0.017?？寡鍖?duì)O2菌株血清抗性的抑制作用最強(qiáng)，其次為O78菌株，對(duì)CVCC1551的抑制作用最弱，并且此抑制作用隨抗血清含量增加而增強(qiáng)。

3 討論

根據(jù)抗血清對(duì)菌株血清抗性的抑制作用試驗(yàn)，在3株致病性菌株中，Iss抗血清對(duì)菌株血清抗性的抑制作用存在明顯差異。抗血清對(duì)O2菌株血清抗性的抑制作用最強(qiáng)，其次為O78菌株，對(duì)CVCC1551的抑制作用最弱。菌株O78與其他2株菌株的氨基酸序列有差異，抑制作用居中，顯示Iss抗血清對(duì)Iss氨基酸序列不同的菌株都可產(chǎn)生血清抗性的抑制作用。iss基因是高度保守的[9，10]，通常高度保守的基因在功能上也是較為重要的，并且具有制備亞單位疫苗，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生免疫保護(hù)的潛力。本試驗(yàn)中Iss抗血清在抑制雞大腸埃希氏菌的增殖中發(fā)揮了作用，但其作用機(jī)制還不清楚?？赡苁窃诩?xì)菌血清增殖的過程中減少了Iss蛋白的表達(dá)，因此降低了菌株的血清抗性。iss基因是編碼大腸桿菌補(bǔ)體抗性的基因，iss基因編碼的外膜蛋白可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上的對(duì)補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合體敏感的位點(diǎn)，導(dǎo)致表面排斥，使菌株具有抗血清補(bǔ)體的融菌能力[5-7，9]。Iss抗血清對(duì)大腸埃希氏菌血清抗性的抑制作用越強(qiáng)，則表現(xiàn)為菌株的活菌數(shù)越少，ΔΔlg越小。試驗(yàn)表明，Iss抗血清的含量越大，對(duì)菌株血清抗性的抑制作用越強(qiáng)。樊琛等[5]在探究雞源致病性大腸桿菌iss基因的原核表達(dá)中證實(shí)Iss抗血清可抑制雞大腸埃希氏菌的血清抗性。但沒有檢測(cè)抗血清含量對(duì)此抑制作用的影響；也沒有檢測(cè)Iss抗血清對(duì)Iss氨基酸序列不同的菌株，在血清抗性的抑制作用上是否有選擇性。本試驗(yàn)證實(shí)抗血清含量增高，抑制作用增強(qiáng)，且抑制作用對(duì)Iss氨基酸序列不同的菌株未顯示特殊的選擇性或?qū)Ｒ恍浴?/p>

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