孟凡麗

摘要：為了探討人參皂苷Rb3在降低血糖方面的分子調(diào)控機制，利用HepG2細(xì)胞為研究材料，系統(tǒng)分析了人參皂苷Rb3對肝糖異生關(guān)鍵酶PEPCK、G6Pase和轉(zhuǎn)錄因子FOXO1、HNF4α的影響。結(jié)果表明，人參皂苷Rb3可以顯著抑制HepG2細(xì)胞肝糖異生途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXO1、HNF4α蛋白表達(dá)，從而抑制PEPCK和G6Pase酶活性及糖異生作用，該作用能夠被AMPK抑制劑Compound C部分阻斷，推測人參皂苷Rb3抑制肝糖異生作用是通過激活A(yù)MPK信號通路實現(xiàn)。AMPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為重要的糖脂代謝靶點，在糖尿病及相關(guān)代謝類疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，為探討人參皂苷Rb3治療糖尿病的作用機制提供了新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：人參皂苷Rb3；HepG2細(xì)胞；肝糖異生

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2717-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.030

Abstract： In order to investigate the effects of ginsenoside Rb3 on reducing the molecular mechanism of blood glucose， using HepG2 cells as research material， the influence of ginsenoside Rb3 on gluconeogenesis key enzymes of PEPCK， G6Pase， and transcription factor of FOXO1 and HNF4α was analyzed. The results showed that ginsenoside Rb3 could significantly inhibit HepG2 cell expression of hepatic gluconeogenic pathway of nuclear transcription factor FOXO1， HNF4α， and inhibited activity and gluconeogenesis of PEPCK and G6Pase and the effect could be partially blocked Compound C which was AMPK inhibitor， speculated that ginsenoside Rb3 inhibited gluconeogenesis was through activation of AMPK signaling pathway to achieve. The AMPK signal transduction pathway as an important target for lipid metabolism， plays an important role in the regulation of diabetes and related metabolic diseases， which provides a new theoretical basis for the mechanism of ginsenoside Rb3 in the treatment of diabetes.

Key words： ginsenoside Rb3； HepG2 cells； hepatic gluconeogenesis

糖尿病是一種世界性的疾病，主要病因為患者體內(nèi)胰島素分泌的絕對或者相對不足而引發(fā)高血糖和尿糖[1]，長期高血糖還會導(dǎo)致心腦血管、腎、眼及神經(jīng)組織的病變，給患者造成很大危害。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病患者的數(shù)量呈快速上升趨勢。因此，開展糖尿病調(diào)控機制及防治方面的研究刻不容緩。糖尿病的治療方法很多，有胰島素治療、胰島移植、基因治療、口服降糖藥物、“運動治療”和“飲食治療”等輔助治療方法[2]。

口服降糖藥物包括3類[3]：即促進胰島素分泌類藥物、增加胰島素敏感性藥物和α-葡萄糖苷酶的抑制劑類藥物。

隨著中藥醫(yī)學(xué)的發(fā)展，源于中藥的降血糖藥物種類也不斷涌現(xiàn)，該類藥物除了具有降血糖作用外，兼具有降血脂及改善血液黏度等作用。人參皂苷Rb3，是人參二醇型皂苷的成分之一，具有多種生物活性，如抗抑郁藥[4]、抗細(xì)胞凋亡的影響[5]、抗氧化活性和微循環(huán)的改善[6]、降血糖[7，8]、抗肥胖[9]、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]、神經(jīng)保護作用[11]、心血管保護作用[12]等。前期研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb3能降低糖尿病小鼠血糖，增加血液中葡萄糖耐量和抗氧化，改善血脂紊亂，改善胰島素敏感性和耐藥性[8]。在前期研究的基礎(chǔ)上，從分子水平研究人參皂苷Rb3降血糖機理，進行人參皂苷Rb3對肝糖異生AMPK影響主要的PEPCK、G6Pase關(guān)鍵酶和FOXO1、HNF4α轉(zhuǎn)錄因子研究，為人參皂苷Rb3降血糖機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人參皂苷Rb3（純度≥98.%HPLC），上海士瑞化工實業(yè)有限公司產(chǎn)品；HepG2細(xì)胞系，中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；AICAR（AMPK激發(fā)劑）、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基，美國Sigma公司；PEPCK、G6Pase、FOXO1、HNF4α和二抗，Santa Cruz Biotechnology公司；二甲基亞砜（DMSO）、小牛血清白蛋白、蛋白酶抑制劑，cocktail Roche診斷所；MTT（噻唑藍(lán)），天津市魯鑫化工科技有限公司；Compound C（AMPK 選擇性抑制劑）、葡萄糖試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司；ECL試劑盒，廣州寶泰克生物有限公司；X-膠片，Eastman Kodak Company公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞系凍存管從液氮中取出于37 ℃水浴液化，然后轉(zhuǎn)移細(xì)胞至無菌的10 mL離心管中，加3 mL培養(yǎng)基并將細(xì)胞混勻，1 000 r/min離心 5 min收集下層細(xì)胞系，用含15%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日換液。復(fù)蘇后的細(xì)胞系改用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，當(dāng)有80%的細(xì)胞融合期時，加入0.25%胰蛋白酶處理，并按1∶3的比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT檢測

采用MTT方法檢測人參皂苷Rb3處理24 h后的HepG2細(xì)胞活力。人參皂苷Rb3參試濃度包括0、3.125、6.25、12.5、25和50 μmol/L作用。MTT處理細(xì)胞一定時間后，棄上清液并加入DMSO溶液以溶解藍(lán)色結(jié)晶。利用酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度，計算細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率（%）=（處理組平均值OD/對照組平均值OD）×100。最后，確定對HepG2細(xì)胞無傷害的人參皂苷Rb3濃度，作為進行葡萄糖生成和糖異生試驗分析中的最佳給藥濃度。

1.4 葡萄糖生成檢測

參照前人報道的方法[13]進行試驗，設(shè)3個處理，即對照、濃度分別為12.5 μmol/L和25.0 μmol/L的人參皂苷Rb3，3個重復(fù)。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用24孔培養(yǎng)板每孔接種細(xì)胞懸液1 mL，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)（CO2濃度為5%），處理24 h后；換用葡萄糖生成緩沖溶液于37 ℃（5%CO2含量）培養(yǎng)4 h。最后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入EP管中，利用葡萄糖氧化酶法測定其中的葡萄糖濃度。

1.5 細(xì)胞試驗

當(dāng)HepG2細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，細(xì)胞接種于6 孔板（密度5×104個/mL，3 mL每孔），用DMEM溶液培養(yǎng)（10%胎牛血清）培養(yǎng)。12 h后，放入含有25.0 μmol/L人參皂苷Rb3、1.0 mmol/L AICAR、10 μmol/L Compound C、25.0 μmol/L人參皂苷Rb3+1.0 mmol/L AICAR、25.0 μmol/L人參皂苷Rb3+和10 μmol/L Compound C不同處理DMEM培養(yǎng)基中。孵育24 h后，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白和核蛋白。主要檢測細(xì)胞系中的下列蛋白表達(dá)水平，包括PEPCK、G6Pase、FOXO1 和 HNF4α。

1.6 蛋白含量分析

HepG2細(xì)胞細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA緩沖液處理，添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。用Bradford法測定蛋白（Bio-Rad蛋白檢測試劑盒）。掃描儀掃描X-膠片，利用Quantity One軟件對結(jié)果進行分析。以目的蛋白OD與內(nèi)參OD比值計算蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

運用方差分析，數(shù)據(jù)用Mean±SE表示，兩組間比較采用t檢驗分析，所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行分析，P<0.05被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷Rb3對HepG2細(xì)胞葡萄糖生成的影響

通過MTT法進行人參皂苷Rb3活性的檢測分析，結(jié)果如圖1所示。濃度為3.125、6.25、12.5、25 μmol/L人參皂苷Rb3給藥24 h后，對細(xì)胞產(chǎn)生少量劑量的殺傷；而50 μmol/L的Rb3可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的明顯傷害，表現(xiàn)出細(xì)胞的皺縮和凋亡現(xiàn)象。因此，合適的人參皂苷Rb3給藥濃度為12.5、25 μmol/L。

用PBS漂洗下層的HepG2細(xì)胞，然后用蛋白酶將細(xì)胞裂解，并提取蛋白，最后在蛋白定量的基礎(chǔ)上將測得的葡萄糖含量與提取的總蛋白含量相比，這個比值可以更為準(zhǔn)確地體現(xiàn)人參皂苷Rb3對HepG2細(xì)胞中葡萄糖生成能力的抑制效應(yīng)。結(jié)果（圖2）表明，兩個劑量的人參皂苷Rb3均對HepG2細(xì)胞系的糖異生具有一定的抑制效應(yīng)，特別是25 μmol/L的劑量可產(chǎn)生顯著的抑制作用（P<0.05）。

2.2 人參皂苷Rb3對HepG2細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase的影響

為了進一步證實人參皂苷Rb3對糖異生抑制作用的分子機制，分析了HepG2細(xì)胞中糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase的表達(dá)情況。結(jié)果（圖3、圖4）表明，與對照相比，人參皂苷Rb3、AMPK激活劑AICAR以及這兩者的聯(lián)合使用均可顯著抑制（P<0.05）PEPCK和G6pase的表達(dá)水平。而Compound C（AMPK的抑制劑）對PEPCK和G6pase的表達(dá)有上調(diào)的影響趨勢（P<0.05）；另外，人參皂苷Rb3與Compound C聯(lián)合使用后，PEPCK和G6Pase的表達(dá)水平也顯著低于對照組（P<0.05）；不過，單獨使用Compound C后細(xì)胞中的PEPCK和G6pase表達(dá)水平卻顯著高于單用人參皂苷Rb3的處理（P<0.05），說明人參皂苷Rb3對PEPCK及G6pase的抑制效應(yīng)可以部分被AMPK抑制劑Compound C所阻斷；綜合來看，人參皂苷Rb3的抑制肝糖異生效應(yīng)與其激活A(yù)MPK有關(guān)。

2.3 人參皂苷Rb3對HepG2細(xì)胞糖異生轉(zhuǎn)錄因子的影響

轉(zhuǎn)錄因子是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要因子，為深入探討人參皂苷Rb3對糖異生作用的分子機制，通過蛋白雜交試驗分析了轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和HNF4α（圖5、圖6）的表達(dá)特性。通過Western雜交對FOXO1表達(dá)水平的分析顯示，人參皂苷Rb3及AMPK的激活劑AICAR對轉(zhuǎn)錄因子FOXO1均具有表達(dá)抑制的效應(yīng)，二者聯(lián)用后對FOXO1的表達(dá)也有顯著的抑制效應(yīng)（P<0.05），不過其抑制效應(yīng)要顯著低于單獨使用兩種藥品時的效果，即人參皂苷Rb3和AICAR在抑制FOXO1的表達(dá)過程中未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)；雖然AMPK的激活劑AICAR并沒有增強人參皂苷Rb3對FOXO1表達(dá)的抑制效應(yīng)，但AMPK的抑制劑Compound C和人參皂苷Rb3聯(lián)用后FOXO1的表達(dá)水平卻顯著（P<0.05）高于人參皂苷Rb3的單獨使用，即Compound C減弱了Rb3對FOXO1抑制效應(yīng)的趨勢。

對轉(zhuǎn)錄因子HNF4α的表達(dá)水平分析顯示，人參皂苷Rb3和AICAR單用或聯(lián)合使用后均可顯著（P<0.05）抑制HNF4α的表達(dá)水平，且兩種藥劑聯(lián)用后HNF4α的表達(dá)水平顯著（P<0.05）低于人參皂苷Rb3單獨使用時的表達(dá)水平，但較AICAR單用時略高，而且AMPK的抑制劑Compound C具有顯著（P<0.05）減弱人參皂苷Rb3對HNF4α表達(dá)抑制的趨勢。

3 討論

肝癌細(xì)胞系HepG2是來源于人的肝細(xì)胞系，該類細(xì)胞具有正常肝細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，常用于肝臟糖異生的體外生物學(xué)功能研究。HepG2細(xì)胞的葡萄糖合成量來反映糖異生情況及其對2型糖尿病治療的作用。因此，利用HepG2細(xì)胞系常作為篩選糖尿病治療的藥物載體，是目前應(yīng)用的比較廣泛的降血糖效應(yīng)研究手段[14]。

AMPK是細(xì)胞和系統(tǒng)的能量平衡調(diào)節(jié)因子，被缺氧、低糖和營養(yǎng)不足代謝產(chǎn)物激活[15]，在骨骼肌、肝臟和脂肪組織激活A(yù)MPK可以提高代謝、改善胰島素敏感性，并可能有利于糖尿病的治療[16]。AMPK是一個有吸引力的藥物靶點，在全身能量平衡的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵的作用。肝臟AMPK的激活導(dǎo)致增加脂肪酸氧化，同時抑制肝葡萄糖生產(chǎn)以及脂肪和膽固醇的合成[17]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK對于肝糖異生過程中幾個關(guān)鍵酶（例如PEPCK和G6Pase）的表達(dá)具有調(diào)劑作用[8]；轉(zhuǎn)錄因子CREB、HNF4α和FOXO1是AMPK調(diào)節(jié)通路上的關(guān)鍵調(diào)控因子，而AMPK可使TORC2（一種調(diào)控CREB活性的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白）發(fā)生磷酸化，從而抑制CREB的表達(dá)。AMPK還可通過對SHP、HNF4α和FOXO1的調(diào)控進而發(fā)揮來實現(xiàn)抑制糖異生的作用，這對于降低血糖均具有積極意義。

為了系統(tǒng)分析人參皂苷Rb3對AMPK的調(diào)控機制，本研究中使用了AMPK的抑制劑Compound C和激活劑AICAR，增加了正負(fù)對照組及處理的組合，試驗處理設(shè)置更為系統(tǒng)科學(xué)[18]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb3和AMPK的激活劑AICAR對HepG2細(xì)胞中的AMPK均具有活性作用，同時對于糖異生途徑中的關(guān)鍵限速酶PEPCK和G6Pase具有顯著的抑制作用，這可能是人參皂苷抑制肝糖異生的原因所在。另外，研究還發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb3與AICAR聯(lián)合使用后對PEPCK的抑制作用顯著增強，表現(xiàn)出較強的協(xié)同效應(yīng)。AMPK抑制劑Compound C可以有效阻斷人參皂苷Rb3對PEPCK和G6Pase的抑制作用，說明AMPK是人參皂苷Rb3作用的重要靶位點。另外，對糖異生途徑中兩個關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子FOXO1及HNF4α的表達(dá)水平分析顯示，人參皂苷Rb3對其表達(dá)均具有顯著的抑制效應(yīng)，而且抑制作用可以被AMPK抑制劑Compound C部分阻斷，推斷人參皂苷Rb3對這兩個轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用可能與AMPK的激活有關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制FOXO1的表達(dá)水平方面，人參皂苷Rb3和AICAR并未表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)（圖5）；在調(diào)控HNF4α蛋白的表達(dá)過程中，兩種藥品的聯(lián)合使用也表現(xiàn)出減弱了AICAR對HNF4α抑制作用的趨勢（圖6）；由此推斷，人參皂苷Rb3和AICAR在調(diào)控上述轉(zhuǎn)錄因子的過程中存在一定的相互干擾。這些結(jié)果表明，人參皂苷Rb3可以顯著抑制HepG2細(xì)胞肝糖異生途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXO1、HNF4α蛋白表達(dá)，從而抑制PEPCK和G6Pase酶活性及糖異生，該作用能夠被AMPK抑制劑Compound C部分阻斷，推測人參皂苷Rb3抑制肝糖異生作用是通過激活A(yù)MPK信號通路實現(xiàn)。AMPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為重要的糖脂代謝靶點，在糖尿病及相關(guān)代謝類疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，為探討人參皂苷Rb3治療糖尿病的作用機制提供了新的理論依據(jù)。

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