呂良禾，張鴻齡①，陳宗聰，孫家君，孫麗娜②，王曉旭

(1.沈陽大學污染環(huán)境的生態(tài)修復與資源化技術教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110044；2.北京桑德環(huán)境工程有限公司，北京 100000)

表面活性劑強化油菜-微生物聯(lián)合修復滴滴涕污染農(nóng)田土壤研究

呂良禾1，張鴻齡1①，陳宗聰1，孫家君2，孫麗娜1②，王曉旭1

(1.沈陽大學污染環(huán)境的生態(tài)修復與資源化技術教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110044；2.北京桑德環(huán)境工程有限公司，北京 100000)

為了提高設施農(nóng)業(yè)滴滴涕(DDTs)污染土壤的修復效果，通過田間實驗研究不同濃度的混合化學表面活性劑(SDBS-TW80)和生物表面活性劑鼠李糖脂(RL)對油菜和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)聯(lián)合去除設施農(nóng)業(yè)土壤中DDTs的強化作用。結果表明，1個月后，單種油菜處理、接種降解菌和油菜-降解菌聯(lián)合處理土壤中DDTs降解率分別為12.0%、38.2%和43.1%，顯著高于對照處理。SDBS-TW80和RL均能不同程度地強化油菜-微生物對土壤中滴滴涕的去除效果。SDBS-TW80施加量為40 mg·kg-1時設施農(nóng)業(yè)土壤中滴滴涕降解率最高(56.5%)，RL施加量為5 mg·kg-1時降解率最高(65.7%)，RL比SDBS-TW80更有利于提高DDTs污染土壤的生物修復效果。此外，當RL施加量為5 mg·kg-1時對于毒性較強的p,p′-DDE也具有較好的降解效果，降解率高達69.5%。結果證實利用表面活性劑強化油菜聯(lián)合甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌現(xiàn)場修復DDTs污染土壤是可行的?？紤]到修復效率和毒害作用，實際應用中應優(yōu)先選用5 mg·kg-1RL組合。

滴滴涕；表面活性劑；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；油菜；污染農(nóng)田土壤

滴滴涕(dichloro diphenyl trichloroethane,DDT)是首批受控的持久性有機污染物(persistent organic pollutants,POPs)之一[1]。是我國最早大面積使用的農(nóng)藥之一,盡管從20世紀80年代初實行農(nóng)藥登記制度以來,就已停止生產(chǎn)和使用DDT、氯丹和七氯等農(nóng)藥,但由于其持久性、半揮發(fā)性和難生物降解性等特點,在各地土壤中DDTs的檢出率仍很高[2],造成的嚴重污染在短期內(nèi)仍然難以消除[3-4]。

微生物修復DDTs有機污染土壤是目前研究最多、應用也最為廣泛的一種生物修復方法[5-6]。但該方法也存在一些不利因素,如微生物對環(huán)境變化的響應比較強烈,環(huán)境條件的改變能極大影響微生物的修復效果;加入到修復現(xiàn)場中的微生物可能會與土著菌株競爭或難以適應環(huán)境從而導致現(xiàn)場作用結果與實驗結果有較大出入。植物修復亦是治理土壤污染經(jīng)濟、有效的途徑之一,因其具有成本低、無二次污染和適用于大面積場地修復等特點而備受關注。然而由于植物的生長周期較短,對氣候的依賴性較強且土壤中DDTs類污染物的生物利用性低等問題,植物修復的效率相對較低[7]。針對上述問題,在利用植物進行污染土壤修復的同時,向土壤中接種具有高效降解能力的專性降解菌,可以明顯提高DDTs的修復效果。同時，為解決DDTs極易被土壤固相吸附,從而導致生物利用率低的問題,常用表面活性劑增溶修復技術將DDTs從土壤顆粒上解吸附下來,增加DDTs的生物可利用性[8]。因此,采用化學強化植物-微生物聯(lián)合修復可有效提高滴滴涕污染土壤修復效果。

筆者在前期實驗[9]的基礎上,選用混合表面活性劑〔m(十二烷基苯磺酸鈉)∶m(吐溫80)=2∶3〕和生物表面活性劑鼠李糖脂(RL),對前期研究篩選出的DDTs高效降解菌甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)及經(jīng)濟作物油菜(Brassicacampestris)進行強化。已有的研究大多在實驗室進行[10],而田間應用表面活性劑強化植物-微生物修復的研究報道尚鮮見。由于設施農(nóng)業(yè)污染現(xiàn)場自然條件的復雜性和土壤環(huán)境的異質(zhì)性,結果與室內(nèi)實驗往往差異較大。因此,在實際污染農(nóng)田中開展研究,可以使研究結果更貼近修復工程實際情況,有利于修復技術的推廣示范。

1 材料與方法

1.1 設施農(nóng)業(yè)實驗區(qū)

農(nóng)業(yè)實驗區(qū)位于沈陽市沈北新區(qū)一處設施農(nóng)業(yè)大棚內(nèi)(42°05′02.62″ N,123°31′42.79″ E),經(jīng)測定土壤類型為粉砂質(zhì)黏土,黏粒、粉粒和砂粒的比例分別為26.11%、72.82%和1.07%,土壤基本理化性質(zhì):w(有機質(zhì))為54.37 g·kg-1,土壤容重1 220 kg·m-3,土壤含水率約60%,pH值7.17,陽離子交換量13.09 cmol·kg-1,w(p,p′-DDE)、w(p,p′-DDD)、w(o,p′-DDT)、w(p,p′-DDT)和w(DDTs)分別為13.19、3.37、4.04、29.85和50.45 μg·kg-1。

1.2 實驗材料

生物表面活性劑選用鼠李糖脂(RL,純度w約90%,購于湖州紫金生物科技有限公司),化學表面活性劑選用失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(TW80,購于國藥集團化學試劑有限公司)和十二烷基苯磺酸鈉(SDBS,購于國藥集團化學試劑有限公司)。p,p′-DDE,p,p′-DDD,o,p′-DDT,p,p′-DDT 標準樣品(100 μg·mL-1,購于百靈威試劑公司)。供試植物為油菜(購于沈陽農(nóng)業(yè)大學種子商店)。

1.3 實驗菌株及菌株培養(yǎng)

高效降解菌為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌,由課題組從DDTs污染農(nóng)田土壤中篩選、分離而來,分離方法參照FANG等[11]。實驗前,將保存于4 ℃斜面的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌接種在LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基)上,待菌長滿整個LB培養(yǎng)基表面后,將菌體刮下接種到無菌水中制成菌懸液,于 4 ℃條件下保存待用。取w=1%的菌懸液接入500 mL的LB培養(yǎng)基中，于160 r·min-1、30 ℃條件下培養(yǎng),定期用血球計數(shù)板計數(shù),待菌數(shù)(以CFU計)達109mL-1即可進行降解實驗。

1.4 實驗設計

共設置9種修復處理,實驗設計詳見表1,并設置空白對照,每個處理5次重復。

表1 實驗設計

Table 1 The experiment design

編號是否添加甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌油菜w(SDBS-TW80)/(mg·kg-1)w(RL)/(mg·kg-1)CK----Y-+--N+---Y+N++--H40++40-H100++100-H300++300-R5++-5R10++-10R20++-20

CK為空白處理；Y為僅添加油菜處理；N為僅添加甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處理；H為混合表面活性劑加油菜加甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處理；R為生物表面活性劑加油菜加甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處理。+為添加處理;-為未添加處理。

將各個處理劃分為1.0 m×1.0 m的修復單元,相鄰修復單元間隔約1.0 m,將500 mL菌液和表面活性劑溶液用手動噴霧器均勻噴施于田間各土壤樣方中,未接菌或表面活性劑的處理噴撒無菌水作對照,在0～40 cm深度范圍內(nèi)均勻混合,并保持樣方含水率w約 60%。其中，接種的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌菌液濃度(以CFU計)為1.0×109mL-1,生物表面活性劑選用RL,化學表面活性劑在前期實驗的基礎上選用陰-非離子混合表面活性劑SDBS-TW80。種植適量油菜,定期澆水,于實驗前1 d采用梅花取樣法采集土壤樣品,30 d后收割油菜地上部,并采用梅花取樣法采集土壤樣品,去除根莖、敗葉、碎石等雜物,待土壤樣品混勻、自然風干后,過0.3 mm孔徑篩低溫避光保存于密封袋中。

1.5 DDTs提取與測定

采用加速溶劑萃取法提取土壤中DDTs[12],將纖維濾膜放于萃取池底部,稱取5.00 g 待測土壤樣品與適量硅藻土均勻混合,置于萃取池中,而后用加速溶劑萃取儀(ASE30,美國Dionex公司)進行萃取。萃取條件:萃取劑為分析純，V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1,預熱平衡時間 5 min,靜態(tài)萃取時間5 min,壓力10 342.5 kPa,靜態(tài)萃取溫度 100 ℃,淋洗體積為萃取池體積的60%,100 s載氣(高純氮氣)吹脫,2次靜態(tài)萃取。收集萃取液并將其轉(zhuǎn)移至雞心瓶中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA,上海亞榮生化儀器有限公司)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,2.0 mL正己烷定容后移至聚四氟乙烯分液漏斗中。

樣品凈化參照GB/T 14550—2003《土壤中六六六和滴滴涕測定的氣相色譜法》[13],將 5.0 mL 濃硫酸加入分液漏斗中進行磺化,待靜置至上下液面分層后,棄去下層廢液,重復上述操作直至下層酸液無色。再取5.0 mLw=10%的NaCl 溶液進行洗脫,上述操作重復2次。最后，用無水硫酸鈉對樣品進行脫水處理,后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用1.0 mL 色譜純正己烷定容并轉(zhuǎn)移至氣相小瓶中,待測。

DDTs測定采用氣相色譜儀(CP-3800,美國Varian公司)檢測,用色譜純正己烷配制p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT標準樣品,制作20、40、60、80和100 ng·g-15個濃度的標準曲線,DDT根據(jù)標準物質(zhì)保留時間匹配確定,利用標準物質(zhì)的峰高計算 DDT 含量。土壤和植物樣品中DDT的加標回收率分別為89.2%～107.1% 和84.9%～110.6%。

土壤中DDTs降解率=1-修復后土壤中DDTs殘留量/修復土壤中DDTs殘留量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 7.5和SPSS 12.5軟件進行數(shù)據(jù)處理,采用單因素方差分析及多重比較(LSD)方法進行數(shù)據(jù)分析,差異顯著水平α為0.05。

2 結果與討論

2.1 油菜、高效降解菌對土壤中DDTs的降解效果

在田間實驗中,自然條件下DDTs極難降解(圖1),1個月后降解率僅為2.3%。單獨種植油菜處理,土壤中DDTs降解率達12.0%,比對照顯著提高。植物主要通過植物吸收、植物釋放根系分泌物降解污染物及植物強化根際微生物降解污染物等途徑對DDTs污染土壤進行修復。

CK、Y、N和Y+N處理的釋義見表1。同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間某指標差異顯著(P<0.05)。

該研究中油菜植物體內(nèi)未檢測到DDTs,表明油菜并非以吸收途徑降解設施土壤中DDTs,土壤中DDTs的損失可能是土壤中土著微生物參與降解DDTs的結果。也有報道指出,植物釋放到根際區(qū)的有機分泌物和酶能有效降解農(nóng)藥及其他有機物[14]。一方面，根系釋放的分泌物增加了土壤陽離子交換容量且競爭土壤中DDTs污染物的結合位點,使得結合于土壤的DDTs減少；另一方面，根際釋放的分泌物具有表面活性劑作用,可降低DDTs的界面表面張力,增加其在土壤間隙水中的溶解度。但由于設施農(nóng)業(yè)土壤的現(xiàn)實性和復雜性[15],單獨使用油菜的降解效果并不顯著。

GLICK等[16]研究指出,DDT降解菌在實驗室純培養(yǎng)條件下可以達到高效降解有機污染物的效果,但無法在實際應用中達到同樣的效果。實驗室中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對DDTs的去除率高于60%。田間實驗中,單獨添加甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和油菜-甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的處理,菌株對土壤DDTs的去除率僅為38.2%和43.1%。這可能是由于設施農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境比較復雜,DDTs在土中的水溶性較低,導致生物可利用率較低,微生物在代謝DDTs時缺少碳源和營養(yǎng)物質(zhì),導致DDTs難以生物降解。

為了提高DDTs的降解率,選用表面活性劑強化油菜和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的降解作用,以期達到較好的修復效果。

2.2 混合表面活性劑強化油菜-微生物降解土壤中DDTs的效果

2.2.1 對土壤中DDTs總量的影響

在田間實驗中,不同施加量SDBS-TW80強化油菜-甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對農(nóng)田土壤DDTs的降解情況見圖2。當添加SDBS-TW80對植物-微生物進行強化后,DDTs降解率顯著提升,在SDBS-TW80施加量為40 mg·kg-1時,降解率達最高(56.5%),提升效果顯著。一方面，因為植物生長時,根系為微生物的繁殖提供了最佳場所。微生物的繁殖又增強了其對DDTs的降解,減輕了DDTs對植物的毒性,使植物有更加優(yōu)越的生長空間,增強了植物根系旺盛的代謝活動,這樣的植物-微生物聯(lián)合體系能促進有機污染物的快速降解、礦化。另一方面，DDTs溶解度低，水溶性差,在土壤環(huán)境中極易吸附于土壤顆粒、土壤有機質(zhì)上,表面活性劑可以增溶土壤中的DDTs,將DDTs從土壤中淋洗出來,并提高其生物可降解性,促進生物降解。

隨著SDBS-TW80施加量的增加,DDTs降解率反呈降低趨勢。當SDBS-TW80施加量為100和300 mg·kg-1時,土壤中DDTs降解率分別為52.0%和45.0%。原因可能是作為化學表面活性劑,高濃度SDBS-TW80具有一定毒性,隨著SDBS-TW80施加量的升高,毒性亦增大,抑制了菌株的生長與降解活性。肖鵬飛等[17]研究TW60和SDS強化白腐真菌降解DDTs的結果中也出現(xiàn)了類似情況。

CK、Y、N、Y+N、H40、H100和H300處理的釋義見表1。同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間某指標差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 對土壤中DDTs不同衍生物的影響

不同施加量鼠李糖脂強化油菜-降解菌去除設施土壤中p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT 的效果如圖3所示。自然狀態(tài)下,土壤中DDT的4種衍生物降解率極低。在添加表面活性劑后,各個處理p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT降解率顯著升高。其中，當SDBS-TW80施加量為40 mg·kg-1時,p,p′-DDE、o,p′-DDT和p,p′-DDT降解率達到最高,分別為53.4%、56.8%和56.0%。而后，隨著SDBS-TW80施加量的增高而降低。當SDBS-TW80施加量為300 mg·kg-1時,土壤中p,p′-DDE、p,p′-DDT、p,p′-DDD和o,p′-DDT 降解率均呈下降趨勢,與單獨施加降解菌甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的效果相近,表明此時表面活性劑對植物-微生物聯(lián)合修復的強化效果已不明顯,可能是由于SDBS-TW80具有一定毒性,其濃度升高，毒性增大，導致菌株的生長和降解活性受到抑制,使降解率不增反減。因此,當SDBS-TW80施加量為40 mg·kg-1時其對油菜-甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的強化效果更為明顯。

p,p′-DDD降解率在表面活性劑濃度為100 mg·kg-1時更高,可能是由于p,p′-DDD的產(chǎn)生有2種途徑：其一，可以在好氧條件下由p,p′-DDT降解轉(zhuǎn)化為p,p′-DDE,再由p,p′-DDE轉(zhuǎn)化為p,p′-DDD;其二，可以在厭氧條件下直接通過土壤中微生物降解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生p,p′-DDD,所以p,p′-DDD來源相對復雜[18]。當SDBS-TW80施加量為100 mg·kg-1時，毒害作用增大,抑制甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的生長,導致其厭氧反應增多,p,p′-DDD降解率也隨之提高,這與趙炳梓等[19]的研究結果相符。

CK、Y、N、Y+N、H40、H100和H300處理的釋義見表1。

2.3 生物表面活性劑強化油菜-微生物降解農(nóng)田土壤中DDTs的效果

2.3.1 對土壤中DDTs總量的影響

CK、Y、N、Y+N、R5、R10和R20處理的釋義見表1。同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間某指標差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 對土壤中DDTs各衍生物的影響

不同施加量RL強化油菜-降解菌去除設施土壤中p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT、p,p′-DDT的效果如圖5所示。對照組中,各衍生物自然降解率均不高于2%,單獨種植植物或施用微生物降解菌對DDTs進行修復,DDT各衍生物降解率不顯著。施加了RL強化后,各處理對土壤中不同衍生物DDT的降解率顯著增加,p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT降解率較對照衍生物別提高了67.9%、49.9%、40.2%和62.7%。表明RL的增溶作用可以有效提升滴滴涕在水相中的表觀溶解度,增大甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的親水性、促進油菜的菌根效應。

添加RL的處理中,DDTs各衍生物的降解率隨RL濃度的變化而呈現(xiàn)出一定的規(guī)律,其降解率從高到低依次為p,p′-DDE、p,p′-DDT、p,p′-DDD和o,p′-DDT。p,p′-DDE、p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT均可對人體產(chǎn)生毒害作用,且毒性最強的是環(huán)境激素類物質(zhì)p,p′-DDE[23],因此p,p′-DDE的去除是DDTs修復工程中的一項重要指標。不同濃度的RL處理中p,p′-DDE的降解率均高于p,p′-DDD、o,p′-DDT和p,p′-DDT,表明RL強化植物-微生物修復對毒性最強的p,p′-DDE修復效果較好。

CK、Y、N、Y+N、R5、R10和R20處理的釋義見表1。直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間某指標差異顯著(P<0.05)。

3 結論

(1)在BS-TW80施加量為40 mg·kg-1時,SDBS-TW80強化油菜-降解菌聯(lián)合去除設施農(nóng)田土壤中DDTs效果最好,DDTs降解率高達56.5%。而后，隨著SDBS-TW80施加量的增加呈下降趨勢。

(2)在RL施加量為5 mg·kg-1時,其對油菜聯(lián)合甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌降解DDTs增溶作用最強,DDTs降解率高達65.7%,而后，降解率隨RL施加量的增高而降低,表現(xiàn)為增溶作用隨RL施加量的增高而降低。

(3)添加不同濃度SDBS-TW80和RL均能不同程度地促進DDTs各衍生物p,p′-DDE,p,p′-DDD、o,p′-DDT 和p,p′-DDT的降解,且降解率隨著SDBS-TW80和RL濃度的升高出現(xiàn)降低現(xiàn)象,BS-TW80和RL施加量分別為40和5 mg·kg-1時對毒性最強的p,p′-DDE降解效果較好。

(4)在表面活性劑強化油菜-微生物的修復中,SDBS-TW80降解效果在施加量為40 mg·kg-1時達到最高,為56.5%;RL在施加量為5 mg·kg-1時達到最高,為65.7%,RL的降解效果明顯優(yōu)于SDBS-TW80。化學表面活性劑SDBS-TW80對自然環(huán)境的毒性遠高于生物表面活性劑RL,而且易導致二次污染。因此,在設施農(nóng)業(yè)土壤修復中,使用生物表面活性劑RL強化植物-微生物對DDTs進行修復較為合適。

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(責任編輯： 陳 昕)

Surfactants Strengthen Cole-Microorganism for the Remediation of DDTs Contaminated Farmland Soils.

LüLiang-he1，ZHANGHong-ling1，CHENZong-cong1，SUNJia-jun2，SUNLi-na1，WANGXiao-xu1

(1.Key Laboratory of Regional Environment and Eco-remediation(Shenyang University)， Ministry of Education， Shenyang 110044， China;2.Beijing Sander Environmental Engineering Co. Ltd.， Beijing 100000， China)

In order to improve the remedial effects of DDTs contaminated soils in facility agriculture,a field experiment was conducted to enhance different concentrations of SDBS-TW80 and RL for bioremediation of DDTs contaminated soils by combining with cole andBacillusmethylotrophicus. The results show that the degradation rate of DDTs in soils by cole, degrading and cole-microorganism bacteria after one month were 12.0%, 38.2% and 43.1%, respectively, which was significantly higher than that in control treatment. SDBS-TW80 and RL could enhance the degradation rate of DDTs contaminated farmland soils byBacillusmethylotrophicusand cole. The highest degration rates of DDTs in farmland soils were 56.5% and 65.7%, respectively, when the concentration of SDBS-TW80 and RL was applied at 40 and 5 mg·kg-1, respectively. RL showed higher degradation activity of DDTs than SDBS-TW80. Moreover, highest degradation rate ofp,p′-DDE (the most toxic component) was about 69.5%, when the concentration of RL was applied at 5 mg·kg-1. The results confirmed the workability of surfactants augmented remediation of DDT-contaminated soil by cole andBacillusmethylotrophicus. Considering the remediation efficiency and toxicity, RL was the best choice in practical application.

DDTs; surfactant;Bacillusmethylotrophicus; cole; contaminated farmland soil

2016-08-11

沈陽市科技計劃(F14-133-9-00);國家重點基礎研究計劃(2014CB441106);遼寧省青年學者成長計劃(LJQ2014134)

X53

A

1673-4831(2017)08-0755-07

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.08.012

呂良禾(1991—),男,遼寧沈陽人,碩士生,主要從事土壤有機污染修復研究。E-mail: 1435277042@qq.com

① 通信作者E-mail: zhl19792002@163.com

② 共同通信作者E-mail: Sln629@163.com