于曉玲 阮孟斌 王 斌 楊義伶 王樹昌彭 明

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 /農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?571101

木薯轉(zhuǎn)錄因子基因MeHDZ14的克隆與分析

于曉玲 阮孟斌 王 斌 楊義伶 王樹昌*彭 明*

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 /農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?571101

HD-Zip家族基因在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中起重要作用。為了研究MeHDZ14基因在非生物脅迫(尤其是干旱)應(yīng)答中的作用,選用對干旱信號反應(yīng)靈敏、相對耐旱的木薯品種“SC124”作為實(shí)驗(yàn)材料,利用RT-PCR克隆了MeHDZ14基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),MeHDZ14基因編碼的蛋白具有典型的HD-Zip保守結(jié)構(gòu)域。將該基因編碼的蛋白與GFP融合,亞細(xì)胞MeHDZ14:GFP重組蛋白定位于細(xì)胞核。同時,酵母Y187中的轉(zhuǎn)錄自激活試驗(yàn)結(jié)果也表明, MeHDZ14蛋白具有明顯轉(zhuǎn)錄自激活功能。推斷MeHDZ14是一個典型的HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子。MeHDZ14啟動子區(qū)具有多個ABA響應(yīng)元件ABRE(ABA response element)?；虿町惐磉_(dá)分析結(jié)果表明,MeHDZ14基因在葉片和根中的表達(dá)受干旱脅迫的誘導(dǎo),并對外源ABA具有明顯的響應(yīng)。因此,認(rèn)為MeHDZ14基因通過ABA依賴信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控木薯干旱響應(yīng)。此外,還發(fā)現(xiàn)MeHDZ14基因的編碼區(qū)雖然存在數(shù)個SNP,但表現(xiàn)出高度保守性,且在不同木薯品種中的表達(dá)對干旱脅迫均有明顯的響應(yīng),為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

木薯;MeHDZ14;結(jié)構(gòu)特性;表達(dá)分析

干旱是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的重要非生物脅迫因素,干旱脅迫引起植物體多種生理指標(biāo)的復(fù)雜變化,對植物體造成多方面的傷害。植物在長期的進(jìn)化過程中,逐漸演化生成感受或傳導(dǎo)干旱脅迫因子的信號系統(tǒng)及一系列生物反應(yīng)機(jī)制來應(yīng)對脅迫,以盡可能減小對機(jī)體的傷害[1]。植物從干旱信號的感知、傳遞,到抵御干旱的應(yīng)答過程中涉及一系列的抗逆相關(guān)基因/因子的表達(dá),包括功能基因和轉(zhuǎn)錄因子基因[2]。

由于轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)γ{迫因子反應(yīng)迅速,植物抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因被稱為早期干旱響應(yīng)基因[3]。研究表明,從低等的蕨類植物[4]及苔蘚植物[5],到高等被子植物擬南芥[6]、水稻[7]、玉米[8]、煙草[9]、番茄[10]、大麥[11]、大豆[12]、向日葵[13]、菊花[14]等物種中都分離到HD-Zip(homeodomain-leucine zipper)類轉(zhuǎn)錄因子,它們與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。研究表明[15],HD-Zip家族成員在植物抵抗逆境反應(yīng)中起重要作用,其中編碼大約35 kD的蛋白的HD-Zip I亞家族成員作用尤其明顯。HD-Zip I亞家族成員具有高度保守的HD結(jié)構(gòu)域,以及相似度較低的LZ區(qū)域[16],可作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物發(fā)育過程[13,17-18]。在應(yīng)對干旱等非生物脅迫環(huán)境條件變化時,HD-Zip I類蛋白在植物中參與的生理功能主要包括非生物脅迫反應(yīng)[19]、脫落酸(ABA)應(yīng)答途徑[20]、蔗糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[21]、去黃化反應(yīng)[22]、藍(lán)光感應(yīng)[23]、胚胎發(fā)生等[24]。

干旱脅迫或外施ABA可誘使某些擬南芥HD-Zip I基因出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)[20]。擬南芥ATHB-5和ATHB-6呈下調(diào)表達(dá)[25-27],進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)ATHB-6是通過調(diào)節(jié)絲氨酸磷酸酶基因(ABI1)的表達(dá),從而在ABA信號通道中起作用,最終起到耐受逆境(干旱等滲透脅迫)的效果[28]。Himmelbach等[29]分析發(fā)現(xiàn),ATHB6啟動子的活性隨著外源ABA濃度的升高而上升。這些證據(jù)說明ATHB-6基因在ABA通路中起重要作用。在干旱及鹽脅迫處理下, ATHB-13與其下游目標(biāo)基因表達(dá)量顯著升高[19]。在干旱脅迫或ABA處理?xiàng)l件下ATHB-7和ATHB-12基因上調(diào)表達(dá),同時ATHB-7的表達(dá)還受鹽脅迫和滲透脅迫誘導(dǎo)。CPHB6和CPHB7基因的表達(dá)受水分脅迫與ABA的響應(yīng)上調(diào),而CPHB3、CPHB4、CPHB5下調(diào)表達(dá)[30]。玉米HD-Zip I基因(Zmhdz10)受干旱、鹽和ABA的誘導(dǎo),可以通過ABA信號途徑來調(diào)節(jié)植物對干旱和鹽的耐受性[31]。向日葵Hahb4基因在干旱誘導(dǎo)啟動子的作用下,也可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐受干旱的能力[32]。

木薯是重要的糧食作物及新型能源作物,在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植,對熱帶地區(qū)間歇性干旱有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,是研究植物抗旱耐貧瘠的寶貴資源。關(guān)于木薯HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子家族的研究尚無報(bào)道。本研究從木薯中克隆得到一HD-Zip基因,命名為MeHDZ14,并分析了它的亞細(xì)胞定位/轉(zhuǎn)錄自激活活性,不同木薯品種/處理下該基因表達(dá)譜,及其抗逆功能,以期解析MeHDZ14與木薯耐干旱性狀的關(guān)系,驗(yàn)證其基因功能。該研究有助于從理論上了解HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在木薯中作用的分子機(jī)制,其對木薯發(fā)育的影響,對于遺傳育種工作有很好的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

利用已經(jīng)篩選到的對干旱信號反應(yīng)靈敏(葉片萎蔫)、表型明顯的耐旱品種SC124作為的試驗(yàn)材料[33-34],其他種質(zhì)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所種質(zhì)資源圃種植保存。

采用海南常見地表紅土與蛭石按1∶2比例混合,曬干后分裝于塑料花盆中,稱重(每盆3 kg)。每盆扦插1節(jié)木薯莖稈,充分澆水使土壤濕潤保持最大持水量。將木薯盆置防雨大棚中,每周2次澆灌以補(bǔ)給營養(yǎng),保證木薯植株正常生長約2個月,木薯株高約1 m左右時選取長勢相似的植株作為干旱處理的樣品。

1.2 宿主菌及載體

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物科技有限公司;根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌株,由中國熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室保存;Y187酵母菌株(帶有LacZ報(bào)告基因)購自Clontech公司。PCAMBIA 1300::GFP由本實(shí)驗(yàn)室改造保存;克隆載體pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司;pGBKT7載體購自Clontech公司。

1.3 各種酶及試劑

限制性內(nèi)切酶購自Fermentas;SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)、SpeedSTARTM HS DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司;RNA提取試劑盒購自Promega公司;植物基因組DNA提取試劑盒、氨芐霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cam)、利福平(Rif)、羧芐青霉素(Carb)、MOPS、IPTG等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 目標(biāo)基因的分離

根據(jù)植物HD-Zip蛋白保守結(jié)構(gòu)域,利用Blast方法在木薯基因組Pfam數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome. net/)中搜索相關(guān)序列,獲取具有HD、Zip和START結(jié)構(gòu)域的木薯HD-Zip基因序列;進(jìn)一步將其與木薯干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合分析獲得目標(biāo)基因。

以木薯SC124基因組cDNA為模板,以包含開放閱讀框的引物(正向GATGAAGCAGAA-3￠;反向AGAAATCCCACCACT-3￠,其中下畫線部分依次為Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn),斜體部分為保護(hù)堿基)擴(kuò)增目標(biāo)基因。PCR體系含:PrimerSTAR緩沖液 (2×)25 μL、10 mmol L–1雙向引物各1μL、300 ngμL–1cDNA 2μL,以ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR程序?yàn)?98℃預(yù)變性1 min;98℃ 10 s;55℃ 15 s;72℃ 2 min;35個循環(huán)后72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,回收特異片段,與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli/DH5a感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)Amp抗性篩選后提取質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR及Bam H I和Nco I酶切鑒定,將鑒定為陽性克隆測序并與基因組所獲得的序列比對分析,命名為MeHDZ14基因。

啟動子克隆:根據(jù)JGI(http://www.phytozome. net/search.php)中收錄的MeHDZ基因DNA序列及其上游1500 bp的序列為參考,設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物(正向反向其中畫線部分分別為Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn),斜體部分為保護(hù)堿基),以木薯栽培品種 SC124基因組DNA為模板,對MeHDZ14基因區(qū)起始密碼子(ATG)前1500 bp序列進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。

1.5 基因序列的生物信息學(xué)分析

利用 NCBI的 Spidey(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/spidey/)和 Net-Gene2 V2.4(http://www.cbs.dtu. dk/services/NetGene-2/)分析基因結(jié)構(gòu)[35]。用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php?input=seq)[36]分析內(nèi)含子相位。以木薯野生型品種W14及其他8個常見栽培品種DNA為模板,以候選基因完整閱讀框兩側(cè)序列為引物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用作候選基因序列SNP多態(tài)性分析。

1.5.1 DNA序列對比分析 將所獲得的木薯MeHDZ14目標(biāo)基因的DNA序列與GenBank中的cDNA序列比對分析。

1.5.2 基因結(jié)構(gòu)分析 克隆來自不同木薯品種的MeHDZ14基因DNA序列,利用NCBI出具的Spidey (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spide/) 和 NetGene2 V2.4(http://cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)分析其基因結(jié)構(gòu);利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index. php)分析內(nèi)含子相位;利用DNAMAN v6.0軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5.3 木薯MeHDZ14蛋白分析 將克隆所得MeHDZ14基因序列翻譯成蛋白序列,用PeptideMass (http://web.expasy.org/cgi-bin/peptide_mass/peptidemass.pl)分析編碼氨基酸的理化性質(zhì);利用http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=i ndex進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測;使用WoLF PSORT軟件(http://www.genscript.com/tools/wolf-psort)預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位,設(shè)KNN為14。

1.5.4 啟動子分析 使用在線PLACE分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)預(yù)測分析MeHDZ14基因的啟動子元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.6 MeHDZ14基因轉(zhuǎn)錄活性及定位分析

將目標(biāo)基因的開放閱讀框插入pGBKT7載體相應(yīng)多克隆位點(diǎn),并轉(zhuǎn)化酵母Y187細(xì)胞。將帶有pGBKT7對照載體及鑒定為陽性的 pGBKTMeHDZ14載體的酵母菌液活化,將其濃度調(diào)整一致后,涂板(SD-Trp營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基+40mg mL–1X-Gal),30℃倒置培養(yǎng)3~5 d后,觀察酵母顯色情況。

對應(yīng)相應(yīng)酶切位點(diǎn),將MeHDZ14基因片段插入表達(dá)載體 pCAMBIA1300,構(gòu)建 CaMV35S:: MeHDZ14::GFP::NOS工程載體。采用凍融法將工程載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株。將LBA4404/ MeHDZ14菌株活化后,用一次性注射器吸取菌液,從煙草葉片背面壓送并滲透到葉片組織中,標(biāo)記,培養(yǎng)48 h;以pG1300::GFP對照載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌注射的煙草為對照,對煙草注射部位進(jìn)行壓片,于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光,激發(fā)光為488 nm和546 nm。

1.7 MeHDZ14基因表達(dá)譜分析

分別采集干旱處理各個時間點(diǎn)(停水8、10、12、14和20 d)的SC124的盆栽苗葉片、葉柄、根系組織,抽提木薯總RNA,–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?以50μmol L–1ABA溶液脅迫處理木薯葉片0、1、3和6 h,并分別設(shè)置對照組;取不同木薯品種(Q10/ I582/南植199(NZ199)/C3/SC5/Arg7/SC124/SC205/蛋黃木薯(DAN)/海南紅心(HN-hong)/新選 048 (X048))葉片組織,抽提其總RNA,并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

根據(jù)候選基因的序列設(shè)計(jì)引物(正向5￠-GGGAG GCAGCAGCTGTGAAT-3￠;反向5￠-CCAGGTTCCA TCATTCTCAT-3￠),選擇Actin1基因(正向5￠-GGGA GGCAGCAGCTGTGAAT-3￠;反向5￠-CCTCCTACG ACCCAATCTCA-3￠)為內(nèi)參,進(jìn)行不同處理間基因表達(dá)差異的定量分析。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq II(2×)10μL,10 mmol L–1引物各0.8μL,ROX Reference Dye(50×)0.4μL,cDNA 1μL,以ddH2O補(bǔ)足至20μL。用AB Applied Biosystems StepOne Plus儀器進(jìn)行PCR,程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s;40個循環(huán)。采用DDCt法定量分析。設(shè)3次試驗(yàn)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeHDZ14基因克隆與分析

MeHDZ14的ORF包含726 bp核苷酸的完整閱讀框,編碼蛋白包含241個氨基酸,等電點(diǎn)為4.75,分子量約27.41 kD;MeHDZ14編碼蛋白氨基酸在NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),其具有HD-ZIP家族的保守結(jié)構(gòu)域(圖1-A),其蛋白三維空間結(jié)構(gòu)(圖1-B)具有典型HD-Zip三螺旋結(jié)構(gòu)。Blastp結(jié)果MeHDZ14與野草莓屬(Fragaria vesca)HD-ZIP家族基因ATHB-7(NCBI序列號為XP_004306630.1)具有較高的同源性(76%)、與楊樹(Populus trichocarpa)HD-ZIP家族基因(NCBI序列號為XP_ 002320889.1)具有88%同源性。因此,MeHDZ14是屬于HD-Zip I亞家族成員。

圖1 MeHDZ14基因結(jié)構(gòu)分析

2.2 MeHDZ14轉(zhuǎn)錄因子活性分析

MeHDZ14屬于HD-Zip I亞家族成員,暗示著MeHDZ14可能作為一個轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中行使功能。蛋白定位預(yù)測分析顯示,MeHDZ14蛋白可能定位于細(xì)胞核。為了驗(yàn)證MeHDZ14的亞細(xì)胞定位,將目標(biāo)基因與GFP融合后(載體結(jié)構(gòu)如圖2-A所示),通過煙草葉片瞬時表達(dá)體系亞細(xì)胞定位分析(圖2-B)表明,MeHDZ14基因編碼蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。為驗(yàn)證目標(biāo)基因是否具備轉(zhuǎn)錄激活作用,以空白載體為陰性對照,將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,通過蛋白互作驗(yàn)證系統(tǒng)研究(圖2-C)表明,MeHDZ14基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠激活酵母Y187菌株中LacZ基因的表達(dá),在X-α-gal/–Trp平板上顯示藍(lán)色,說明MeHDZ14具備轉(zhuǎn)錄自激活功能。因此推斷MeHDZ14是轉(zhuǎn)錄因子。

2.3 MeHDZ14參與的干旱等脅迫響應(yīng)過程

采用在線軟件PLANTCARE分析MeHDZ14基因上游約1500 bp長的啟動子序列,預(yù)測該啟動子可能具有的結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析顯示(表1),啟動子區(qū)域含有68個TATA-box,24個CAAT-box,多個光信號響應(yīng)元件,以及ABA響應(yīng)元件ABRE,MYBH結(jié)合位點(diǎn)、乙烯響應(yīng)元件ERE、GA響應(yīng)元件GARE-motif、脅迫響應(yīng)相關(guān)元件TC-rich repeats。這些啟動子元件可能在響應(yīng)ABA以及非生物脅迫信號中發(fā)揮作用,從而調(diào)控MeHDZ14基因表達(dá)。

為了驗(yàn)證MeHDZ14轉(zhuǎn)錄因子在干旱等脅迫過程中的反應(yīng),采用半定量RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖3),MeHDZ14基因在木薯葉片與根系組織中的表達(dá)水平很低,隨干旱程度的加重MeHDZ14呈誘導(dǎo)上升表達(dá)趨勢。圖4顯示,50 μmol L–1ABA處理木薯葉片時,MeHDZ14基因表達(dá)差異明顯,因此選擇50 μmol L–1ABA濃度繼續(xù)進(jìn)行時間梯度試驗(yàn),隨著處理時間的延長,MeHDZ14基因受到誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào),在3 h時達(dá)到最高峰。

圖2 轉(zhuǎn)錄因子驗(yàn)證結(jié)果

表1 啟動子調(diào)控元件分析Table 1 cis-acting regulatory elements analysis of promoter sequence

圖3 干旱脅迫處理下MeHDZ14基因的表達(dá)分析

圖4 ABA處理下MeHDZ14基因的表達(dá)分析

2.4 不同品種間MeHDZ14的表達(dá)

為考證MeHDZ14基因在物種馴化過程中基因結(jié)構(gòu)是否產(chǎn)生變異,通過野生型品種W14和8個常規(guī)栽培品種的基因結(jié)構(gòu)比較分析圖5-A表明, MeHDZ14基因區(qū)DNA長度833 bp,CDS區(qū)長為726 bp,被1個107 bp的內(nèi)含子隔為2個外顯子。供測的9個木薯品種的基因區(qū)DNA序列為833 bp,長度一致,序列中沒有InDel變異。品種間基因區(qū)DNA序列總計(jì)有17個SNP,外顯子區(qū)有15個SNP,其中包括11個同義替換和4個非同義替換,序列一致性達(dá)99.75%。保守結(jié)構(gòu)域中有3個同義替換和2個非同義替換(圖5-B),MeHDZ14基因序列具有很高的保守性。

為研究MeHDZ14基因在不同類型木薯品種中的表達(dá)譜,本文結(jié)合課題組田間試驗(yàn)觀察,對常見的不同類型木薯品種MeHDZ14基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析,包括:(1)相對耐/抗旱的品種(相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表)Arg7(干旱反應(yīng)為落葉)、SC124(干旱反應(yīng)為葉片萎蔫)[33]、SC7(生物量相對較高);(2)相對高產(chǎn)、種植面積廣的SC5;(3)抗寒、耐貧瘠等綜合農(nóng)藝性狀良好的SC205;(4)氣孔密度相對較大的I582、海南紅心(HN-hong)、新選048(X048);(5)氣孔密度相對較低的蛋黃木薯(DAN);(6)富含多糖的Q10;(7)甜木薯品種南植199(NZ199);(8)遺傳轉(zhuǎn)化模式品種C3。MeHDZ14基因在供測試的11個木薯品種中(圖6-A),以Q10葉片中表達(dá)量最低,SC205葉片中表達(dá)量最高,是Q10中的40多倍。不同品種中MeHDZ14基因表達(dá)差異顯著。選擇表達(dá)量相對較低的I582、表達(dá)量相對較高的新選048(X048),以及耐旱品種SC124和Arg 7,在對照(停水0 d)、中度干旱(4 d)、重度干旱(10 d)時進(jìn)行基因表達(dá)差異分析(圖6-B),結(jié)果顯示,在不同的品種中,MeHDZ14基因雖然表達(dá)量存在顯著差異,但都隨著干旱程度的加強(qiáng)而表達(dá)量增加,且差異顯著。結(jié)合前期SC124品種在干旱脅迫下(圖3)及外施ABA下(圖4)的表達(dá)譜,推斷MeHDZ14基因是通過ABA依賴信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控木薯干旱響應(yīng)。

圖5 MeHDZ14基因在不同木薯品種中的核酸差異分析

圖6 不同品種木薯葉片中MeHDZ14基因的表達(dá)

3 討論

HD-Zip是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,在植物發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中扮演著重要的角色。目前已經(jīng)從多個物種中分離得到HD-Zip基因,然而在抗逆性良好的木薯中還沒有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從木薯中克隆得到一個HD-Zip I家族成員基因MeHDZ14,該基因含有HD-Zip家族保守結(jié)構(gòu)域和空間結(jié)構(gòu),這與其他物種[16]的報(bào)道一致。同源性分析表明,它與擬南芥ATHB-7基因親緣關(guān)系最近。8個測試木薯品種間的MeHDZ14蛋白氨基酸序列一致性為99.75%,共有4個非同義替換,未發(fā)現(xiàn)野生種特有的氨基酸變異,其中這4個氨基酸變異均與極性有關(guān)。暗示MeHDZ14蛋白在進(jìn)化上具有高度保守性。木薯MeHDZ14蛋白定位與細(xì)胞核中,具有轉(zhuǎn)錄自激活能力,推測它是作為轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長過程的,這與已有的報(bào)道是相同的[15]。

木薯MeHDZ14在植物組織中表達(dá)量很低,受干旱或外施ABA誘導(dǎo)表達(dá),且對ABA反應(yīng)靈敏,這與MeHDZ14同源基因ATHB-7的表達(dá)情況一致[37],推測其功能可能也具有相似性。擬南芥ATHB-7基因是依賴ABA途徑參與植物響應(yīng)干旱應(yīng)答的[37]。另外,ATHB-7還通過誘導(dǎo)PP2C基因的表達(dá)及下調(diào)ABA受體基因PYL/PYR的表達(dá)來反饋調(diào)節(jié)ABA信號途徑[38]。那么,MeHDZ14基因在木薯干旱應(yīng)答反應(yīng)中如何發(fā)揮作用,這值得我們繼續(xù)探討。MeHDZ14基因在不同木薯品種中的相對表達(dá)量不同,在SC205品種中的表達(dá)量最高,這可能與它抗逆、高產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)。同時,不同木薯品種中MeHDZ14基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式相同,都是隨干旱程度的加深基因表達(dá)呈增強(qiáng)趨勢。總之,MeHDZ14基因參與植物響應(yīng)干旱的應(yīng)答反應(yīng)過程。

植物激素可能是抗逆基因表達(dá)的啟動因素,其中ABA與非生物脅迫緊密關(guān)聯(lián)[39]。植物接收到逆境信號后,體內(nèi)ABA快速累積,進(jìn)而啟動級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致氣孔關(guān)閉等一系列植物應(yīng)答反應(yīng)[40-41]。木薯MeHDZ14基因在逆境信號物質(zhì)ABA施加后很快響應(yīng)被誘導(dǎo)表達(dá),在3 h表達(dá)水平最高,為對照的10倍。這表明MeHDZ14基因的表達(dá)是與植物體內(nèi)ABA的積累相關(guān)聯(lián)的。

植物體內(nèi)啟動子的驅(qū)動活性是下游基因是否表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)度的重要影響因子,它含有的順式作用元件的數(shù)量、種類及彼此的排列等都是影響下游基因表達(dá)的因素。MeHDZ14基因啟動子區(qū)含有豐富的TATA-box(RNA聚合酶II結(jié)合位點(diǎn))和CAAT-box (增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率)等啟動子基本元件;含有大量的光響應(yīng)元件,可能與MeHDZ14基因參與植物光調(diào)控下的生長相關(guān);生物/非生物脅迫相關(guān)的ABA響應(yīng)元件、MYBH結(jié)合位點(diǎn)及乙烯響應(yīng)元件ERE、以及脅迫響應(yīng)相關(guān)元件TC-rich repeats的存在,暗示著MeHDZ14基因與木薯耐/抗逆境脅迫相關(guān)。未研究結(jié)果顯示,在干旱及外施ABA的作用下,木薯葉片MeHDZ14基因表達(dá)量顯著上調(diào),這與該基因啟動子區(qū)存在的順式作用元件相一致。所以,MeHDZ14轉(zhuǎn)錄因子很可能參與了ABA介導(dǎo)的干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng),是依賴ABA信號響應(yīng)干旱途徑中的重要一員,在木薯耐/抗干旱反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

木薯MeHDZ14基因在不同木薯品種序列比對中有4個非同義替換,未發(fā)現(xiàn)野生種特有的氨基酸變異,其中這4個氨基酸變異均與極性有關(guān),在進(jìn)化上具有高度保守性。MeHDZ14蛋白序列有典型的HD-Zip I亞家族的保守結(jié)構(gòu)域(HD結(jié)構(gòu)域和LZ區(qū)域),定位于細(xì)胞核內(nèi),具備轉(zhuǎn)錄自激活功能,是一個轉(zhuǎn)錄因子。在外施ABA和干旱脅迫下MeHDZ14基因響應(yīng)迅速,雖然在不同品種中表達(dá)量有差異,但在脅迫信號下的表達(dá)模式一致,呈上升趨勢。MeHDZ14基因在木薯逆境脅迫應(yīng)答中可能發(fā)揮著重要作用。

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Cloning and Analysis of the Transcription Factor Gene MeHDZ14 in Cassava

YU Xiao-Ling,RUAN Meng-Bin,WANG Bin,YANG Yi-Ling,WANG Shu-Chang*,and PENG Ming*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Science/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Haikou 571101,China

HD-Zip family genes play important roles in plant growth and stress response.To reveal the role of MeHDZ14 gene in abiotic stresses(e.g.drought)in cassava,we cloned MeHDZ14 gene by using RT-PCR from cassava cultivar SC124,which was relatively more resistant to drought stress.Bioinformatics methods were used to analyze its structural characteristics,and semi-quantitative RT-PCR/qRT-PCR was used to explore its expression patterns in response to abiotic stresses in different plant tissues and varieties.MeHDZ14 has a 726 bp open reading frame,encoding 241 amino acids,and contains the typical HD and ZIP domain.Blastp analysis showed that MeHDZ14 has close genetic relationship with ATHB-7,which is a member of the family I HD-Zip gene.Yeast and subcellular localization test showed that the MeHDZ14 gene is a transcription factor and specifically expresses in the nucleus.Genetic structural variation analysis revealed a total of four mis-sense mutations in eight tested varieties. However,amino acid mutations were not found between wild and cultivated cassavas.This indicates the MeHDZ14 proteins are highly conserved.Semi-quantitative RT PCR analysis revealed that MeHDZ14 was specifically expressed in petioles,and induced by drought stress in root and leaf,suggesting that MeHDZ14 plays an important role in the early drought stage.Analysis by qRT-PCR showed that MeHDZ14 gene had different expression levels in different cassava varieties,but the same mode under drought stress and ABA treatment.These data indicate that MeHDZ14 is a member of the ABA pathway responding to drought. Our results showed that MeHDZ14 plays an important role in the molecular pathways of cassava drought resistance,underlining its potential in genetic improvement of cassava drought tolerance.

Cassava;MeHDZ14;Structure characteristics;Expression analysis

(

):2016-12-09;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-05-11.

10.3724/SP.J.1006.2017.01181

本研究由國際科技合作與交流項(xiàng)目(31561143012,2013DFA32020)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501378)資助。

This study was supported by the International Science&Technology Cooperation Program of China(31561143012,2013DFA32020)and the National Natural Science Foundation of China(31501378).

*通訊作者(Corresponding authors):王樹昌,E-mail:wangshuchang2001@163.com;彭明,E-mail:pengming@itbb.org.cn

聯(lián)系方式:E-mail:yuxiaoling@itbb.org.cn

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170511.1152.008.html