李 敏于太飛徐兆師張雙喜閔東紅陳 明馬有志柴守誠,*鄭煒君,*

1西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院 /旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所 /國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程 /農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室,北京 100081;3寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)作物研究所,寧夏永寧750105

大豆轉錄因子基因GmNF-YCa可提高轉基因擬南芥滲透脅迫的耐性

李 敏1,2于太飛1,2徐兆師2張雙喜3閔東紅1陳 明2馬有志2柴守誠1,*鄭煒君1,*

1西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院 /旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,陜西楊凌 712100;2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所 /國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程 /農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室,北京 100081;3寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)作物研究所,寧夏永寧750105

植物的核因子Y(NF-Y)是由3個亞基A、B和C組成,在響應非生物脅迫過程中起著重要的作用。本研究以大豆鐵豐8號為材料,建立大豆cDNA文庫,以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌,通過酵母雙雜交技術篩選大豆cDNA文庫,獲得了大豆NF-Y轉錄因子家族亞基C的一個成員,命名為GmNF-YCa。該基因全長為864 bp,編碼287個氨基酸,屬于NF-YC亞家族。GmNF-YCa分子量為31.6 kD,等電點為5.07親水性蛋白,具有一個跨膜結構域,無信號肽。序列分析表明,NF-YC亞家族具有很高的保守性。GmNF-YCa基因啟動子含有ARE、Box4、GATA-motif、Box I、ACE、ABRE和CAT-Box等脅迫和光響應元件。組織特異性分析表明,GmNF-YCa基因在種子萌發(fā)期表達量最高。實時定量結果表明,GmNF-YCa受蔗糖和甘露醇的誘導上調表達。使用農(nóng)桿菌介導法,將大豆GmNF-YCa基因導入擬南芥,并進行了功能分析。發(fā)芽率試驗分析表明,GmNF-YCa的轉基因提高了轉基因擬南芥萌發(fā)期對滲透脅迫的耐性;改良了在蔗糖和甘露醇處理下轉基因擬南芥的根系生長和側根發(fā)育。

大豆;核因子Y;表達模式;啟動子;滲透脅迫

病蟲害等生物脅迫以及旱鹽等非生物脅迫嚴重威脅著植物的生長,影響著作物的產(chǎn)量和品質[1-2]。由土壤水分缺失導致的滲透脅迫是其中主要脅迫之一。因此,研究潛在的滲透脅迫分子機制有助于了解植物適應逆境的機制,改善其產(chǎn)量和品質[3]。

植物在抵御環(huán)境脅迫的進化中形成許多分子機制,包括增強脅迫保護基因的表達。轉錄因子在調節(jié)脅迫響應的功能基因中起著重要作用[1-2]。核因子Y(NF-Y)轉錄因子家族就是其中之一。植物中的NF-Y家族是異源三聚體結構,分別由A、B、C亞基組成[4]。亞基NF-YA能夠與CCAAT結構域特異性結合[5]。NF-YB和NF-YC通過各自的組氨酸結構域形成緊密的二聚體。NF-Y通過二聚體與NF-YA互作來發(fā)揮其轉錄因子的作用[6]。NF-YA的氮末端和NF-YC的碳末端是由富含谷氨酰胺的疏水結構域構成,是NF-Y復合體的轉錄激活域[7]。

在動物中,NF-Y復合體已經(jīng)研究得較透徹。據(jù)報道,在動物體內NF-Y能夠激活發(fā)育相關的轉錄基因,尤其是在細胞周期間[4,8]。比如,NF-Y能夠控制有絲分裂細胞周期蛋白的激活[9-10]。另外,NF-Y在細胞增殖和早期發(fā)育中起著中心調控的作用。一項研究表明,轉基因鼠中NF-YA基因的失活導致發(fā)育早期發(fā)生胚致死現(xiàn)象[11]。與動物相比,NF-Y在植物中的研究甚少。動物體內,一個NF-Y亞基是由一個基因編碼的。而在植物體內,一個NF-Y亞基是由一個基因家族編碼的,每個家族是由8~35個基因組成。在擬南芥中,NF-Y是由10個NF-YA、10個NF-YB以及9個NF-YC編碼[12]。Stephenson等[13]通過計算分析整個DNA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),小麥中有37個基因家族編碼NF-Y(10個NF-YA、11個NF-YB和14個NF-YC)。植物基因組的一個顯著性特征是由整個基因組復制或單個基因串聯(lián)復制導致基因復制[14]。據(jù)報道,許多種類的基因,包括轉錄因子,超過90%的數(shù)量增多是由整個基因組復制的結果[15]。例如,AtNF-YB6可能是薔薇亞綱里的基因組按照一定的規(guī)律進化而來;MtNF-YB5可能是大豆基因組按照自然規(guī)律進化得到的[16]。

隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)NF-Y在植物中所起的作用越來越重要。研究表明,NF-Y家族中的一些基因在植物的各生長發(fā)育階段起著關鍵的作用。Kumimoto等[17]證明NF-Y與植物的開花有關,發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNF-YB2與其親緣關系極近的蛋白AtNFYB3通過激活開花調節(jié)因子的表達來控制花期,特別是在光誘導的條件下能夠促進植物開花。另外,在酵母中發(fā)現(xiàn)NF-YB亞基能夠直接與CCAAT-box中的開花軌跡T啟動子結合,進而控制植物開花時間。LEC1(LEAFY COTYLEDON 1)在擬南芥種子成熟的過程中起著重要的作用。Yamamoto等[18]發(fā)現(xiàn)擬南芥基因AtLEC1與NF-YC亞基結合后,通過與種子中的ABRE特異結合因子互作,激活下游基因轉錄,說明NF-Y也參與植物種子的生長和發(fā)育。Stephenson等[13]通過試驗驗證了小麥基因TaNF-YB3在幼苗和葉子中受光調節(jié)顯著,能夠上調與光合作用相關的基因。轉基因小麥中轉基因系的葉子葉綠素含量、光合作用速率和早期生長速率都有顯著增加,說明NF-Y與光合作用有關。據(jù)報道,NF-Y家族基因在提高抵御非生物脅迫能力方面也起著重要作用。Nelson等[19]通過對處理后的材料進行各脅迫相關參數(shù)的測量和計算,發(fā)現(xiàn)AtNF-YB1和ZmNF-YB2能夠提高轉基因植物對干旱的耐性,進而提高作物的產(chǎn)量。

大豆(Glycine max L.)是世界上種植面積最大的油料作物,為人類和動物提供脂肪酸和蛋白,對滲透脅迫比較敏感。本實驗室在之前的研究中,鑒定出7個大豆Di19基因[20],其中GmDi19-5受干旱、過氧化物、ABA等脅迫誘導上調,GmDi19-5啟動子在干旱、過氧化物、ABA等處理下能夠增加GUS的活性[21]。為了進一步研究GmDi19-5的功能,本實驗室以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫,得到了一些可能與其互作的候選蛋白基因,其中包括NF-Y家族成員,命名為GmNF-YCa。本文旨在研究GmNF-YCa對滲透脅迫的響應及其功能,為改良大豆抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆品種鐵豐8號由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所邱麗娟研究員提供。以鐵豐8號為材料建立大豆cDNA文庫。本實驗室在之前的研究中鑒定了7個大豆Di19基因,其中GmDi19-5對非生物脅迫響應比較明顯,以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫得到本文的GmNF-YCa基因。

1.2 植物材料的脅迫處理

將大豆鐵豐8號種植于蛭石中,在培養(yǎng)室(23℃, 16 h光照和8 h黑暗)中生長10 d至2片葉時進行滲透脅迫處理。在甘露醇(200 mmol L–1)和蔗糖(8%)處理0、1、3、6、12、24和48 h時取樣,迅速凍于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA的提取與表達模式分析

利用植物總RNA提取試劑盒(天根,北京)提取大豆樣品,用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)合成cDNA。以cDNA為模板,大豆Actin基因(上游引物5'-CAGAGAAAGTGC CCAAATCATGT-3',下游引物5'-TTGCATACAAGG AGAGAACAGCTT-3')作為內參,設計GmNF-YCa特異引物(上游引物5'-CGTGAATCTCGAACACAT AAGAG-3',下游引物5'-GGAAGAATTGATCGATG CAG-3'),以 SYBR Green染料法,在 Applied Biosystems 7500 Real-time PCR System上進行實時定量PCR。反應體總系為20 μL,含2×SuperReal Pre Mix Plus(含熒光染料)(天根,北京)10 μL,正向引物和反向引物各 0.6 μL,50×ROX Reference Dye?0.4 μL,RNase-free ddH2O 8.4 μL。所用程序為95℃預變性15 min,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s,并收集熒光信號,40個循環(huán),用2–??Ct法計算該基因表達量,整理并分析數(shù)據(jù)[21]。

1.4 GmNF-YCa的生物信息學分析

使用 SWISS-MODEL在線軟件(https://www. swissmodel.expasy.org/)預測GmNF-YCa蛋白的三級結構;根據(jù)GmNF-YCa的氨基酸序列,在NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)中Blast其同源序列,使用在線軟件 PHYRE2(http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/)及DNAMAN進行不同物種之間氨基酸同源比對;為進一步研究NF-YC進化關系,使用MEGA6軟件繪制系統(tǒng)樹;從大豆基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal. html)截取GmNF-YCa基因上游1300 bp作為啟動子。利用植物順式作用元件在線數(shù)據(jù)庫PLACE(http:// www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和 PlantCARE (plant cis-acting regulatory elements,http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析基因啟動子,預測順式作用元件。使用在線軟件The BAR and The Bio-Analytic Resource for Plant Biology(http:// bar.utoronto.ca/efpsoybean/)預測GmNF-YCa基因在大豆中的表達模式。

1.5 轉基因擬南芥轉化及純合株系的獲得

所用擬南芥為哥倫比亞型CK。參考Beehtold等[22]的方法對基因GmNF-YCa遺傳轉化擬南芥,將收獲的T0代擬南芥種于含有潮霉素(700 μL L–1)的MS培養(yǎng)基中,篩選、擴繁至T2代獲得轉基因株系和同一時期的CK擬南芥種子。選取長勢相同的,兩周齡的轉基因擬南芥和非擬南芥(CK)幼苗,提取RNA,反轉錄合成cDNA。使用GmNF-YCa基因特異性引物和大豆Actin基因,進行半定量RT-PCR,反應總體系為20 μL,含2×Taq PCR Start Mix with Loading Dye (天根,北京)10 μL,上游引物和下游引物1 μL,模板1 μL,ddH2O 7 μL;反應條件為95℃預變性3 min, 95℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán),72℃延伸10 min。選取表達量高的株系繼續(xù)篩選、繁殖至T3純合,用于下一步的表型分析實驗。

1.6 轉基因擬南芥在蔗糖和甘露醇處理下的功能分析

轉基因擬南芥株系和CK經(jīng)70%的酒精處理1 min后用水清洗3次;于0.7%NaClO靜置10 min,用水洗去NaClO,重復3次。將晾干的種子點于MS板上,MS板上分別添加4%、6%、8%的蔗糖和50、100和150 mmol L–1的甘露醇。其中,沒有添加任何處理的MS板作為對照。每個株系64粒種子,重復3次。低溫處理3 d后,放于23℃的培養(yǎng)箱中(16 h光照,8 h黑暗)。每隔12 h計數(shù)一次發(fā)芽率,直至MS板上種子全部發(fā)芽。同時將MS板上長至5 d的轉基因擬南芥和CK幼苗小心地轉移至添加不同濃度處理(4%、6%、8%的蔗糖和50、100和150 mmol L–1的甘露醇)的MS板上,垂直培養(yǎng)1周之后使用根系掃描儀(WINRHIZO proLA2400)分析其根長,并統(tǒng)計鮮重,試驗重復3次。用方差分析確定轉基因擬南芥和CK之間的表型差異。

2 結果與分析

2.1 GmNF-YCa基因的克隆

為了進一步研究GmDi19-5的功能,以pGBKT7-GmDi19-5為誘餌篩選大豆cDNA文庫(圖1),得到了一些可能與其互作的候選蛋白基因,包括GmNF-YCa。在大豆基因組數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn),大豆NF-YC家族有25個成員,其中GmNF-YCa編碼的氨基酸序列在第10~第70位氨基酸之間含有1個NF-YC基序,屬于NF-YC家族。

圖1 GmDi19-5互作蛋白的篩選

2.2 GmNF-YCa基因的序列分析

對大豆基因組數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),GmNF-YCa基因包含864 bp的開放閱讀框(包括6個外顯子和5個內含子,外顯子和內含子交替分布),328 bp的5'非編碼區(qū),276 bp的3'非編碼區(qū);編碼287個氨基酸,分子量為31.6 kD,等電點為5.07。氨基酸序列分析表明,GmNF-YCa為親水性蛋白,在開放閱讀框內的前100個氨基酸中有一個跨膜結構域,無信號肽。用SWISS-MODEL在線軟件預測GmNF-YCa蛋白三級結構(圖2),為該蛋白三級結構的“飄帶模型”。建模所需的模板序列與目的序列的相似度達到60%,說明預測結果接近實際結果。因此,GmNF-YCa蛋白是由無數(shù)個如圖2所示的蛋白亞基按照一定的非共價鍵方式連接在一起,經(jīng)過各種修飾加工后具有其蛋白活性進而行使其調節(jié)功能。

圖2 GmNF-YCa蛋白的三級結構預測

以GmNF-YCa蛋白為探針搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,采用PHYRE2及DNAMAN進行氨基酸同源比對,對該蛋白的氨基酸序列進行同源性分析發(fā)現(xiàn)(圖3),該蛋白與紅豆、菜豆、金絲棗、蘋果、蔓花生及陸地棉的相似度高達99.0%,與苜蓿、百脈根、木豆、可可及克萊門柚的相似度達97.5%,而與核桃和木薯的相似性也達到了96.0%,說明NF-YC家族在進化過程中具有極高的保守性。進化樹分析顯示, GmNF-YCa與紅豆的親緣關系最近(圖4)。

圖3 物種間NF-YC保守域序列比對分析

2.3 GmNF-YCa啟動子序列分析

為了研究GmNF-YCa基因的調控機制,本研究對GmNF-YCa啟動子進行分析。采用在線分析工具PLACE和PlantCARE對GmNF-YCa的啟動子預測分析發(fā)現(xiàn)大量順式作用元件。其中,啟動子的基本的調控元件TATA-Box位于起始密碼子上游 –391 bp處,增強子CAAT-Box位于起始密碼子上游 –34、–322和–711 bp處;另外,該啟動子還包括多種發(fā)育和脅迫響應元件,如光響應元件ARE、Box 4、GATA-motif、Box I和ACE;ABA響應元件ABRE;與分生組織表達有關的CAT-Box元件;厭氧響應元件ACE等(圖5和表1)。表明GmNF-YCa基因可能參與了ABA等脅迫響應、光反應過程以及大豆的伸長生長過程。

圖4 GmNF-YCa基因在不同物種中的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 啟動子GmNF-YCa序列及預測的順勢作用元件

表1 啟動子GmNF-YCa序列中的順式作用元件及預測的功能Table 1 The cis-acting elements and predicted function of promoter GmNF-YCa

2.4 GmNF-YCa組織特異性及表達模式分析

將GmNF-YCa的初始基因ID輸?shù)皆诰€軟件The BAR and the Bio-Analytic Resource for Plant Biology的相應方框內,對GmNF-YCa進行組織特異性分析,結果表明(圖6),GmNF-YCa主要在根毛、根瘤、根、以及種子萌發(fā)期表達,其中在種子萌發(fā)期表達量最高,為41.28 TPM(transcripts per million);在根尖表達量最低,為12.50 TPM。這表明GmNF-YCa主要在根的部位以及萌發(fā)期表達,可能與根吸收外界營養(yǎng)、滲透脅迫有關,可能與根瘤的產(chǎn)生和生長有關。

圖6 GmNF-YCa基因在不同大豆組織中的表達量Fig.6 Expression levels of GmNF-YCa gene in different soybean tissuesTPM:transcripts per million.

為了進一步解析滲透脅迫對GmNF-YCa基因表達的影響,對10 d的大豆幼苗進行蔗糖和甘露醇脅迫處理,進行實時熒光定量PCR檢測GmNF-YCa在滲透脅迫下的表達量。如圖7所示,蔗糖和甘露醇脅迫處理對GmNF-YCa基因表達量都有影響,但是表達方式不同。在蔗糖處理下,表達量開始逐漸上升到12 h時達到峰值,為處理前表達量的3倍,之后GmNF-YCa基因表達量隨著時間的增加逐漸下降;而在甘露醇處理下,GmNF-YCa基因表達量逐漸上升,至6 h時達最高值,表達量提高了2倍。這些數(shù)據(jù)表明,GmNF-YCa基因受蔗糖和甘露醇的誘導表達。

2.5 轉基因擬南芥檢測以及純合株系的獲得

本試驗使用半定量PCR對所有T2代株系的模板進行表達量檢測(圖8)。在內參Actin基因跑出條帶亮度幾乎相同的情況下,GmNF-YCa基因相對應的條帶亮度的大小表明該基因在擬南芥中表達量的高低。本實驗從6個株系中找到表達量比較高的3個株系1、3和6,為方便下一步發(fā)芽試驗,分別命名為35S::GmNFYCa-1、35S::GmNFYCa-2和35S:: GmNFYCa-3。

圖7 GmNF-YCa基因在滲透脅迫處理下的表達情況

圖8 GmNFYCa轉基因擬南芥株系的表達量檢測Fig.8 Expression level of GmNFYCa in transgenic Arabidopsis

2.6 GmNF-YCa在滲透脅迫下的發(fā)芽率

轉基因擬南芥植株與對照擬南芥植株的發(fā)芽率在不同濃度的蔗糖(4%、6%和8%)和甘露醇(50、100和150 mmol L–1)處理中存在明顯的差異。其中,在對照MS板上,GmNF-YCa轉基因與對照擬南芥在整個萌發(fā)過程中基本沒有明顯差異(圖9-A)。經(jīng)過處理的擬南芥的發(fā)芽時間比未處理的擬南芥的發(fā)芽時間要晚,但是同一濃度的脅迫處理下,轉基因擬南芥的發(fā)芽率始終高于CK(圖9-B和9-C),且隨著甘露醇和蔗糖處理的濃度的增加,顯著性升高。在4%、6%蔗糖和100 mmol L–1和150 mmol L–1甘露醇的處理下轉基因擬南芥的發(fā)芽率高于CK且已達到極顯著水平(圖9-D和圖9-E)。例如6%濃度的蔗糖處理下,轉基因擬南芥發(fā)芽率平均達到41.5%,而對照組發(fā)芽率平均為31%;100 mmol L–1甘露醇處理中,轉基因擬南芥發(fā)芽率90%左右,而對照只有60%左右。說明GmNF-YCa的轉基因提高了轉基因擬南芥萌發(fā)期對滲透脅迫的耐性。

圖9 轉基因擬南芥植株在蔗糖和甘露醇條件下的發(fā)芽率分析Fig.9 Germination rate of transgenic Arabidopsis lines in sucrose and mannitol treatments

2.7 轉基因擬南芥苗期在滲透脅迫下的表型

轉基因擬南芥在模擬滲透脅迫下的根長發(fā)育試驗表明,在正常MS培養(yǎng)基上,轉基因擬南芥根長與CK比較沒有明顯差別,而在不同濃度蔗糖和甘露醇處理的根長有明顯差異(圖10)。在各脅迫處理下,擬南芥根長小于未處理的擬南芥根長,但是同一個培養(yǎng)基上轉基因擬南芥的根長要高于CK(圖10-A, B),而有的已經(jīng)達到顯著水平(圖10-C,D)。其中,8%的蔗糖處理下的轉基因擬南芥根長平均為14.4 cm,而對照組擬南芥平均為10.4 cm;150 mmol L–1的甘露醇處理下轉基因擬南芥根長平均為15.2 cm,而對照組擬南芥的根長僅為10.0 cm(圖10-C,D)。以上結果表明在植物中GmNF-YCa基因的表達可以顯著提高轉基因擬南芥苗期的滲透脅迫耐性。

3 討論

轉錄因子通過與啟動子的順式元件結合調節(jié)下游基因表達,對植物各生長階段以及逆境脅迫響應等具有重要作用[1-2]。本研究中GmNF-YCa屬于NF-YC亞家族。NF-YC亞家族在植物中是個龐大的家族,在進化中,保守域在各個物種、各個進化階段都高度保守,如本次試驗中與蘋果、核桃、克萊門柚等作物的相似度高達96%以上。

很多報道證明,NF-YC家族能夠受光照的調節(jié)而影響開花。在植物中第1個被發(fā)現(xiàn)并克隆出的基因為擬南芥AtNF-YC2,它是由光合作用基因AtpC通過酵母雙雜交技術篩庫得到的,說明兩者的互作與光照有關[23]。有試驗證實,NF-YC通過與CO特異性結合影響植物的開花,其中,CO能夠激活相關轉錄因子來控制植物開花[24]。NF-YC還能夠上調云杉花粉的生長[25]。5個小麥NF-YC基因(TaNFYC5、TaNF-YC8、TaNF-YC9、TaNF-YC11和TaNF-YC12)受光照的調節(jié),而TaNF-YC11與光合作用的基因共調節(jié)[26]。GmNF-YCa啟動子順式元件中光響應元件較多,預測GmNF-YCa的功能可能與光照和植物開花有關,但是具體的作用機制還要進一步探究。

圖10 轉基因GmNF-YCa擬南芥植株在蔗糖和甘露醇條件下的根長試驗分析Fig.10 Root primary length analysis under sucrose and mannitol conditions

滲透脅迫威脅著作物的生長和產(chǎn)量。NF-Y家族基因在滲透脅迫中起著極其重要的作用。大豆基因GmNF-YA3的轉基因擬南芥能夠提高抗旱能力,并且在ABA處理下通過激活ABA相關表達基因提高對ABA的脅迫響應能力[27]。白楊基因PdNF-YB7轉入擬南芥中也被發(fā)現(xiàn)具有抗旱能力[28]。通過逆境下相關參數(shù)如葉綠素的含量、氣孔開度、葉表溫度等的測量,轉基因ZmNF-YB2玉米在干旱的處理下能夠提高作物的產(chǎn)量[19]。微列陣分析顯示,擬南芥基因AtNF-YA5通過介導相關基因的表達能夠提高作物的抗旱能力[29]。而關于NF-YC亞家族的研究著重于生物鐘等方面,但抗逆相關的報道很少。一般情況下,NF-Y家族的3個亞家族都是結合為三聚體才能發(fā)揮其作用,而NF-YA、NFYB已經(jīng)報道在許多逆境中起著不同的作用。所以,NF-YC亞家族可能也與逆境脅迫相關。GmNF-YCa啟動子順式元件中含有在干旱和高鹽脅迫條件下能夠提高基因的表達的ABRE元件,可猜測其與干旱、高鹽等滲透脅迫有關。本試驗用不同濃度的蔗糖和甘露醇脅迫處理模擬滲透脅迫,轉基因GmNF-YCa擬南芥植株的忍受脅迫能力都比對照高(圖9和圖10),說明GmNFYCa參與滲透脅迫響應,而NF-YC亞家族在抗逆方面的作用仍需進一步研究。

4 結論

通過酵母雙雜交技術篩庫獲得了大豆GmDi19-5的互作候選蛋白基因GmNF-YCa,該基因轉化擬南芥后受蔗糖和甘露醇上調誘導表達;在甘露醇和蔗糖處理下,轉基因擬南芥比CK發(fā)芽率高、根長和側根伸長明顯。

[1]Xu Z S,Chen M,Li L C,Ma Y Z.Functions and application of the AP2/ERF transcription factor family in crop improvement.J Integr Plant Biol,2011,53:570–585

[2]Xu Z S,Chen M,Li L C,Ma Y Z.Functions of the ERF transcription factor family in plants.Botany,2008,86:969–977

[3]Mahajan S,Tuteja N.Cold,salinity and drought stresses:anoverview.Arch Biochem Biophys,2005,444:139–158

[4]Mantovani R.The molecular biology of the CCAAT-binding factor NF-Y.Gene,1999,239:15–27

[5]Xing Y,Fikes D J,Guarente L.Mutations in yeast HAP2/HAP3 define a hybrid CCAAT box-binding domain.EMBO J,1993,12: 4647–4655.

[6]Romier C,Romier C,Cocchiarella F,Mantovani R,Moras D.The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y.J Biol Chem, 2003,278:1336–1345

[7]Coustry F,Maity S N,de Crombrugghe B.The transcriptional activity of the CCAAT binding factor CBF is mediated by two distinct activation domains,one in the CBF-B subunit and the other inthe CBF-C subunit.J Biol Chem,1996,271:14485–14491

[8]Hu Q,Lu J F,Luo R,Sen S.Inhibition of CBF/NF-Y mediated transcription activation arrestscellsatG(2)/M phaseand suppresses expression of genes activated at G(2)/M phase of the cell cycle.Nucl Acids Res,2006,34:6272–6285

[9]Korner K,Jér?me V,Schmidt T,Müller R.Cell cycle regulation of the murine cdc25B promoter-essential role for nuclear factor-Y and a proximal repressor element.J Biol Chem,2001,276: 9662–9669

[10]Gurtner A,Fuschi P,Magi F,Colussi C.NF-Y dependent epigenetic modifications discriminate between proliferating and postmitotic tissue.PLoS One,2008,3:e2407

[11]Bhattacharya A,Deng J M,Zhang Z,Behringer R.The B subunit of the CCAAT box binding transcription factor complex(CBF/ NF-Y)is essential for early mouse development and cell proliferation.Cancer Res,2003,63:8167–8172

[12]Edwards D,Murray J A H,Smith A G.Multiple genes encoding the conserved CCAAT-box transcription factor complex are expressed in Arabidopsis.Plant Physiol,1998,117:1015–1022

[13]Stephenson T J,McIntyre C L,Collet C,Xue G P.Genome-wide identification and expression analysis of the NF-Y family of transcription factors in Triticum aestivum.Plant Mol Biol,2007, 65:77–92

[14]Lawton-Rauh A.Evolutionary dynamics of duplicated genes in plants.Mol Phylogenet Evol,2003,29:396–409

[15]Maere S,De Bodt S,Raes J,Casneuf T,Van Montagu M,Kuiper M,Van de Peer Y.Modeling gene and genome duplications in eukaryotes.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:5454–5459

[16]Laloum T,Mita De S,Gamas P,Baudin M.CCAAT-box binding transcription factors in plants:Y so many?Trends Plant Sci,2013, 18:157–166

[17]Kumimoto R W,Adam L,Hymus G J,Repetti P P,Reuber T L.The nuclear factor Y subunits NF-YB2 and NF-YB3 play additive roles in the promotion of flowering by inductive long-day photoperiods inArabidopsis.Planta,2008,228:709–723

[18]Yamamoto A,Kagaya Y,Toyoshima R,Kagaya M,Takeda S. Arabidopsis NF-YB subunits LEC1 and LEC1-LIKE activate transcription by interacting with seed-specific ABRE-binding factors.Plant J,2009,58:843–856

[19]Nelson D E,Repetti P P,Adams T R,Creelman R A,Wu J.Plant nuclear factor Y(NF-Y)B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres.Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:16450–16455

[20]Feng Z J,Cui X Y,Chen M,Yang G X,Ma Y Z,He G Y,Xu Z S. The soybean GmDi19-5 interacts with GmLEA3.1 and increases sensitivity of transgenic plants to abiotic stresses.Front Plant Sci, 2015,6:179

[21]Wei M L,Pei L L,Liu J M,Min D H.Isolation and molecular characteristics analysis of soybean transcription factor gene GmMYB174.J Plant Genet Resour,2015,16:94–99

[22]Beehtold N,Ellis J,Pelletier G.In plant Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. Life Sci,1993,316:1194–1199

[23]Kusnetsov V,Landsberger M,Meurer J,Oelmüller R.The assembly of the CAAT-box binding complex at a photosynthesis gene promoter is regulated by light,cytokinin,and the stage of the plastids.J Biol Chem,1999,274:36009–36014

[24]Kumimoto R W,Zhang Y,Siefers N.BFH Iii.NF-YC3,NF-YC4 and NF-YC9 are required for CONSTANS-mediated,photoperioddependent flowering in Arabidopsis thaliana.Plant J,2010,63: 379–391

[25]YuY L,Li Y Z,Huang G X,Meng Z D,Zhang D,Wei J,Yan K, Zheng C C,Zhang LY.PwHAP5,a CCAAT-binding transcription factor,interacts with PwFKBP12 and plays a role in pollen tube growth orientation in Picea wilsonii.J Exp Bot,2011,62: 4805–4817

[26]Stephenson T J,McIntyre L C,Collet C,Xue G P.TaNF-YC11, one of thelight-upregulated NF-YC members in Triticum aestivum,is co-regulated with photosynthesis-related genes. Funct Integr Genom,2010,10:265–276

[27]Ni Z,Hu Z,Jiang Q,Zhang H.GmNFYA3,a target gene of miR169,is a positive regulator of plant tolerance to drought stress.Plant Mol Biol,2013,82:113–129

[28]Han X,Tang S,An Y,Zheng D C.Overexpression of the poplar NF-YB7 transcription factor confers drought tolerance,improves water-use efficiency in Arabidopsis.J Exp Bot,2013,64: 4589–4601

[29]Li W X,Oono Y,Zhu J,He X J,Wu J M.TheArabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally, post transcriptionally to promote drought resistance.Plant Cell,2008, 2:2238–2251

Soybean Transcription Factor Gene GmNF-YCa Enhances Osmotic Stress Tolerance of Transgenic Arabidopsis

LI Min1,2,YU Tai-Fei1,2,XU Zhao-Shi2,ZHANG Shuang-Xi3,MIN Dong-Hong1,CHEN Ming2,MA You-Zhi2,CHAI Shou-Cheng1,*,and ZHENG Wei-Jun1,*

1College of Agronomy,Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,Yangling 712100,China;2Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops,Ministry of Agriculture,Beijing 100081,China;3Institute of Crop Science, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Yongning 750105,China

Biotic stresses,like plant diseases and insect pests,and abiotic stresses,such as drought and salt,heavily threaten plant growth and influence crop yield and quality.Osmotic stress resulting from water deficiency in the soil is one of major hurdles. Nuclear Factor Y(NF-Y)is a heterotrimeric protein,consisting of NF-YA,NF-YB,and NF-YC in plant.NF-Y plays significant roles in the pathway responding to osmotic stresses in plants.We acquired a gene GmNF-YCa,a member of regulatory subunit NF-YC family in soybean(Glycine max L.),by screening a soybean cDNA library using yeast two-hybrid system.The full sequence of GmNF-YCa is 864 bp,encoding 287 amino acids and having a NF-YC motif,belonging to NF-YC subfamily. GmNF-YCa is a hydrophilic protein with a molecular weight of 31.6 kD and isoelectric point of 5.07,and containing a transmembrane domain and no any signal peptides.Sequence analysis showed that NF-YC subfamily was highly conserved among various species.Promoters of GmNF-YCa contained various abiotic stresses and light responsive elements,such as ARE, Box 4,GATA-motif,Box I,ACE,ABRE,and CAT-Box.According to tissue-specific analysis,GmNF-YCa had the highestexpression level in germination stage.Quantitative real-time PCR suggested that GmNF-YCa was induced by sucrose stress and mannitol treatment.GmNF-YCa was transformated to Arabidopsis successfully by Agrobacterium-mediated method and the overexpressed Arabidopsis was prepared for the function characterization analysis.Overexpression of GmNF-YCa could improve tolerance of transgenic Arabidopsis to osmotic stress in the germination stage,and enhance root development with more lateral roots in sucrose and mannitol treatments.

Soybean;Nuclear Factor Y;Expression pattern;Promoter;Osmotic stress

(

):2016-12-20;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網(wǎng)絡出版日期):2017-05-11.

10.3724/SP.J.1006.2017.01161

本研究由國家轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800916B)和國家自然科學基金項目(31371620)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops(2014ZX0800916B)and the National Natural Science Foundation of China(31371620).

*通訊作者(Corresponding authors):鄭煒君,E-mail:zhengweijun@nwsuaf.edu.cn;柴守誠,E-mail:chaishoucheng@126.com

聯(lián)系方式:E-mail:13664207046@163.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170511.1152.002.html