萬(wàn)雪貝李東旭徐 益徐建堂張力嵐張列梅林荔輝祁建民,*張立武,*

1福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院 /作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心,福建福州 350002

紅麻EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其多態(tài)性評(píng)價(jià)

萬(wàn)雪貝1,2李東旭1,2徐 益1,2徐建堂1張力嵐1,2張列梅1林荔輝1祁建民1,*張立武1,2,*

1福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院 /作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心,福建福州 350002

紅麻是最重要的自然纖維作物之一,然而SSR標(biāo)記的匱乏限制了其遺傳改良。本研究從紅麻90 175個(gè)EST序列中挑出含有轉(zhuǎn)錄因子的EST,開(kāi)發(fā)了94對(duì)SSR引物。以24份不同紅麻種質(zhì)資源的DNA為模板,利用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)多態(tài)性。結(jié)果表明,85對(duì)引物(占90.4%)至少在2個(gè)材料之間存在多態(tài)性,表明開(kāi)發(fā)的EST-SSR具有很好的多態(tài)性。其中,三核苷酸重復(fù)所占比例最多,重復(fù)基元AAT和ATG的多態(tài)性較高。聚類(lèi)分析表明,24份紅麻種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)變化在0.62~0.92之間,表現(xiàn)出豐富的遺傳基礎(chǔ)。這些結(jié)果不僅豐富了紅麻的分子標(biāo)記數(shù)量,而且為紅麻的遺傳分析提供資源。

紅麻;SSR;遺傳多樣性;標(biāo)記開(kāi)發(fā)

紅麻(Hibiscus cannabinus)又叫大麻槿,屬于錦葵科木槿屬一年生草本韌皮纖維作物。具有耐旱、耐鹽堿、抗逆性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)速度快、生物產(chǎn)量高、易栽培等特點(diǎn)[1-3]。紅麻主要是作為麻紡工業(yè)的原料,近年來(lái)在建材、可降解性塑料、吸污、飼料、造紙、地膜、麻油、藥用等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[4-6]。其主要種植地區(qū)為中國(guó)、泰國(guó)、印度、孟加拉國(guó)、越南、古巴、巴西、印度尼西亞、伊朗等[7]。

SSR(simple sequence repeat,簡(jiǎn)單重復(fù)序列),又稱微衛(wèi)星標(biāo)記,是由1~6個(gè)核苷酸組成的短序列串聯(lián)重復(fù)多次而組成的一段DNA。因?yàn)镾SR中重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)不同,所以擴(kuò)增的SSR序列長(zhǎng)度呈現(xiàn)出多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性較高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于基因定位、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定等領(lǐng)域,被認(rèn)為是十分有效的分子標(biāo)記之一[8-9]。根據(jù)序列來(lái)源,SSR標(biāo)記可以劃分為基因組 SSR和表達(dá)序列標(biāo)簽 SSR(EST-SSR, expressed sequence tags-SSR)。由于EST-SSR來(lái)源于轉(zhuǎn)錄區(qū)域,往往跟功能基因連鎖[10-11]。在真核生物中,存在著大量的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor),這些轉(zhuǎn)錄因子在植物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆等性狀中發(fā)揮著重要作用[10-11]。因而,基于轉(zhuǎn)錄因子開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記,在遺傳研究與分子標(biāo)記輔助育種中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

EST-SSR標(biāo)記已經(jīng)在小麥[12]、大豆[13]、甘藍(lán)[14]、花椰菜[15]、苧麻[16]等領(lǐng)域上有所應(yīng)用,如王慶彪等[14]篩選出20對(duì)核心EST-SSR引物構(gòu)建了中國(guó)50個(gè)甘藍(lán)代表品種的SSR指紋圖譜;劉晨晨等[16]利用21對(duì)EST-SSR引物評(píng)價(jià)了19個(gè)苧麻品種,表明ESTSSR在苧麻近緣種中具有很好的通用性。然而紅麻的分子標(biāo)記研究起步較晚,僅極少數(shù)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了有關(guān)工作。目前可查的紅麻SSR標(biāo)記是部分來(lái)源于陸地棉SSR[17]。由于缺乏可供利用的SSR標(biāo)記,一些紅麻遺傳育種研究者只能利用隨機(jī)多態(tài)性位點(diǎn)的分子標(biāo)記,如ISSR、RAPD等。徐偉[18]利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)紅麻7個(gè)常規(guī)栽培種和12個(gè)野生種及5個(gè)近緣種進(jìn)行了親緣關(guān)系研究。由于紅麻至今尚無(wú)參考基因組序列,因此很難大規(guī)模開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記。鑒于紅麻SSR數(shù)目多,還有大量的未被發(fā)現(xiàn),且EST-SSR具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的90 175個(gè)EST[19],選擇包含有轉(zhuǎn)錄因子的EST,開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記并鑒定其多態(tài)性,為紅麻的遺傳研究與分子標(biāo)記輔助育種提供資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于研究的24份紅麻種質(zhì)資源,由福建農(nóng)林大學(xué)麻類(lèi)遺傳育種與綜合利用研究室提供(表1),均于2015年5月1日種植于福建農(nóng)林大學(xué)洋中科教基地。

1.2 基因組DNA提取

采用改良的CTAB法提取24份試驗(yàn)材料的幼苗DNA[7]。

1.3 紅麻表達(dá)序列標(biāo)簽序列來(lái)源及SSR引物開(kāi)發(fā)

紅麻表達(dá)序列標(biāo)簽序列數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra),登錄號(hào)為SRP060459[19]。為了篩選具有潛在功能標(biāo)記的SSR,選擇包含有轉(zhuǎn)錄因子的EST,共1031條。根據(jù)SSR的重復(fù)次數(shù)進(jìn)行篩選:二核苷酸>6次,三核苷酸>4次,四核苷酸>3次,五核苷酸>2次。利用網(wǎng)上的SSRPrimer工具(http://hornbill.cspp.latrobe.edu. au/ssrdiscovery.html)搜索這些序列所包含的 SSR,共得到94對(duì)SSR引物,編號(hào)分別為HcES0001至HcES0094。這些引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR體系及電泳

PCR體系為10 μL,含2.0 μL DNA(50 ng μL–1)、0.5 μL引物(10 μmol μL–1)、3.75 μL 2×Taq Master Mix (試劑購(gòu)自上海進(jìn)岸生物科技有限公司)、3.75 μL dd H2O。用10 μL石蠟油覆蓋。

PCR程序?yàn)? min預(yù)變性94℃;94℃變性30 s, 60℃退火30 s,72℃延伸45 s,共10個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃;94℃變性30 s,55℃退火30 s, 72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min, 4℃保存。采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 讀帶與數(shù)據(jù)分析

利用本研究開(kāi)發(fā)的EST-SSR對(duì)供試材料進(jìn)行基因分型,利用PowerMarker V3.25軟件計(jì)算其多態(tài)性信 息 含 量 PIC (polymorphism information content)[10]?；诜羌訖?quán)平均數(shù)UPGMA(unweight pair-group method using arithmetic averages)方法計(jì)算遺傳相似性,利用NTSYSv2.10軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記分布頻率及重復(fù)基元種類(lèi)

選擇包含有轉(zhuǎn)錄因子的EST,總共開(kāi)發(fā)94對(duì)SSR引物,重復(fù)基元分為二至六核苷酸。其中三核苷酸重復(fù)所占比例最多,為62.7%,其次是二核苷酸重復(fù),占34.0%,四核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)所占比例較少,分別為2.1%和1.1%。

基于這些SSR引物,分析各重復(fù)基元種類(lèi)及分

布頻率(表2)。發(fā)現(xiàn)二核苷酸重復(fù)基元以AT和TA為主,三核苷酸重復(fù)基元以CAA、AAT、ATG和GCA為主。

表1 供試紅麻品種(系)的名稱及來(lái)源Table 1 Names and origins of tested kenaf varieties(lines)

表2 紅麻EST-SSR中不同重復(fù)類(lèi)型的分布Table 2 Frequencies of EST-SSR repeat types in kenaf

(續(xù)表2)

2.2 EST-SSR引物的多態(tài)性檢測(cè)

為了評(píng)估這些新開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性,以24份紅麻DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)(圖1和表3)。結(jié)果表明,85(90.4%)對(duì)引物得到清晰的PCR產(chǎn)物,且至少在2個(gè)材料間存在差異,表現(xiàn)出多態(tài)性。

這些SSR引物的多態(tài)性信息含量(PIC)(表3)變化在0~0.88之間,平均值為0.514。根據(jù)Bostsein提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標(biāo)[21],即當(dāng)PIC>0.5時(shí),該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn);0.25

2.3 紅麻品種(系)遺傳多樣性分析

圖1 SSR引物HcES0037對(duì)紅麻24份品種(系)的擴(kuò)增結(jié)果

24份紅麻品種(系)具有豐富的遺傳基礎(chǔ),其遺傳相似系數(shù)變化在0.62~0.92之間,變異系數(shù)為39%。以遺傳相似系數(shù)0.77為分割線,可將24份材料劃分為3組(圖2)。其中,45K R2、83K、20215-2、阿聯(lián)紅麻、KS029、紅麻A37、福紅15、XK-9 K2聚為一組;6K、53 India S1、雜紅992選、福紅優(yōu)2號(hào)選、KS182、Ecerglades 41、閩紅3-1-2、紅B12/LDF選聚為一組;3K、KS006、57KSCS-11-06-1、福紅992、ID85、79K、福紅優(yōu)5號(hào)選、ZH-01聚為一組。分析各組的地理來(lái)源,可以看出,來(lái)自德國(guó)的57KSCS-11-06-1與來(lái)自埃及的阿聯(lián)紅麻被劃分為不同的兩組,表明這2個(gè)品種(系)遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),可能存在較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。這些結(jié)果為后續(xù)的紅麻雜交種的親本選配提供參考。

圖2 基于遺傳相似系數(shù)的24份紅麻品種(系)UPGMA樹(shù)狀圖

3 討論

3.1 紅麻EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

SSR標(biāo)記是一種廣泛應(yīng)用于遺傳研究與分子標(biāo)記輔助育種的標(biāo)記類(lèi)型[12-16]。與主要農(nóng)作物相比,紅麻的研究相對(duì)滯后。由于沒(méi)有可供利用的SSR標(biāo)記,一些紅麻遺傳育種研究者只能利用隨機(jī)多態(tài)性位點(diǎn)的分子標(biāo)記,如鄭海燕等[22]利用SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建紅麻品種(系)的指紋圖譜。相對(duì)于SRAP等標(biāo)記而言,SSR具有帶型簡(jiǎn)單,重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。為了利用SSR標(biāo)記,武耀龍[17]對(duì)棉花的SSR引物在紅麻上的通用性進(jìn)行了研究,64對(duì)棉花SSR引物中,57對(duì)引物擴(kuò)增出了條帶,通用性比例高達(dá)89%。但這是基于同為錦葵科的棉花序列開(kāi)發(fā)而來(lái),其多態(tài)性重復(fù)性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。而本研究基于紅麻EST序列開(kāi)發(fā)了94對(duì)SSR引物,并進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)85對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,占90.4%,其多態(tài)性比例較高,這不僅可以豐富紅麻分子標(biāo)記的數(shù)量,而且為剖析紅麻重要性狀的遺傳機(jī)制提供了資源。雖然兩者SSR多態(tài)性比例相當(dāng),但本研究是基于紅麻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的表達(dá)序列標(biāo)簽序列。與基于棉花序列開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記相比,本研究開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)不同的紅麻品種(系)將具有更好的通用性。

在這新開(kāi)發(fā)的SSR引物中,大部分SSR重復(fù)基元為二至六核苷酸。其中,三核苷酸重復(fù)基元所占比例最多,為62.7%。這和大部分植物基因組中三核苷酸重復(fù)的分布頻率較高的結(jié)果一致[23-24]。Hong等[23]分析白菜基因組中的SSR重復(fù)基元表明,三核苷酸重復(fù)基元序列比例為37.0%。Goff等[24]在水稻基因組中,發(fā)現(xiàn)三核苷酸重復(fù)基元序列比例為59.0%。繼而分析其重復(fù)基元,發(fā)現(xiàn)紅麻含有重復(fù)基元AAT和ATG的SSR引物,多態(tài)性較高。

3.2 EST-SSR標(biāo)記為紅麻的遺傳分析提供資源

通過(guò)多態(tài)性SSR引物的聚類(lèi)分析,可將24份紅麻種質(zhì)資源劃分為3組,表明這些標(biāo)記可用于紅麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。來(lái)自德國(guó)的57KSCS-11-06-1與來(lái)自埃及的阿聯(lián)紅麻被劃分至不同的兩組,表明這2個(gè)品種(系)具有明顯的遺傳差異。根據(jù)雜交種的親本選配的遺傳差異原則,這些紅麻品種(系)配制的雜交種可能具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。

劉強(qiáng)等[25]發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)基因的超量表達(dá)來(lái)激活植物多個(gè)抗逆功能基因的表達(dá),從而提高植物的抗逆性。因此,基于轉(zhuǎn)錄因子基因開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記是具有潛在的功能標(biāo)記。本研究開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記基于紅麻轉(zhuǎn)錄因子序列,是潛在的功能標(biāo)記,但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。在未來(lái)的紅麻分子標(biāo)記輔助育種或指紋圖譜構(gòu)建等遺傳研究中,研究人員可以優(yōu)先考慮使用這些SSR引物。

4 結(jié)論

利用紅麻含有轉(zhuǎn)錄因子的EST開(kāi)發(fā)出94對(duì)SSR引物,這些SSR標(biāo)記具有較好的多態(tài)性和穩(wěn)定性,是潛在的功能標(biāo)記。(AAT)n和(ATG)n三核苷酸重復(fù)基元多態(tài)性高,可作為紅麻SSR引物設(shè)計(jì)的首選。24份紅麻種質(zhì)資源可劃分為3組,表現(xiàn)出豐富的遺傳基礎(chǔ)。

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Development and Polymorphism Evaluation of EST-SSR Markers in Kenaf

WAN Xue-Bei1,2,LI Dong-Xu1,2,XU Yi1,2,XU Jian-Tang1,ZHANG Li-Lan1,2,ZHANG Lie-Mei1,LIN Li-Hui1,QI Jian-Min1,*,and ZHANG Li-Wu1,2,*

1College of Crop Science/Key Laboratory for Genetics,Breeding and Multiple Utilization of Crops of Ministry of Education/Fujian Key Laboratory for Crop Breeding by Design,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2Center for Genomics and Biotechnology,Haixia Institute of Science and Technology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China

Kenaf is one of the most important crops for natural fber production.However,the lack of SSR markers has resulted in a large gap in kenaf genetic improvement.In this study,94 SSR primers were developed on the basis of the sequences containing transcription factors from 90 175 expressed sequence tags(ESTs)in kenaf.A total of 24 kenaf accessions were used to evaluate the polymorphism of these developed SSRs using 9%polyacrylamide gel electrophoresis.Eighty-five SSR primers(90.4%)were successfully amplified and presented the polymorphism between at least two accessions,indicating their high rate of polymorphism.Among them,AAT and ATG were the dominant repeat motifs.Cluster analysis showed that the genetic similarity coefficient varied from 0.62 to 0.92,indicating an abundant genetic basis among these accessions.These developed EST-SSRs not only enrich molecular markers,but also enhance the resource for genetic analysis in kenaf.

Kenaf(Hibiscus cannabinus);Simple sequence repeat;Genetic diversity;Marker development

(

):2016-07-04;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-05-08.

10.3724/SP.J.1006.2017.01170

本研究由福建農(nóng)林大學(xué)杰出青年科研基金項(xiàng)目(xjq201401),國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-19-E06),農(nóng)業(yè)部東南黃紅麻實(shí)驗(yàn)觀測(cè)站(農(nóng)科教發(fā)2011),福建省科技廳對(duì)外合作項(xiàng)目(2015I0001)和福建省麻類(lèi)種質(zhì)資源共享平臺(tái)項(xiàng)目(2010N2002)資助。

This study was supported by the Distinguished Young Research Fund in Fujian Agriculture and Forestry University(xjq201401),the China Agriculture Research System(CARS-19-E06),the Experiment Station of Jute and Kenaf in Southeast China(Nongkejiaofa 2011),Foreign Cooperation Project of Science and Technology Department in Fujian,China(2015I0001),and Construction of Germplasm Resources Platform for Bast Fiber Crops in Fujian,China(2010N2002).

*通訊作者(Corresponding authors):祁建民,E-mail:qijm863@163.com,Tel:0591-87644898;張立武,E-mail:lwzhang@fafu.edu.cn

聯(lián)系方式:E-mail:524073779@qq.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170508.1006.004.html