李 林，李 迪，徐 騰，劉 睿，任金威，陳啟賀，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

海參膠原低聚肽對糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的促進作用

李 林，李 迪，徐 騰，劉 睿，任金威，陳啟賀，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

目的：觀察海參膠原低聚肽是否具有促進db/db 2型糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的作用。 方法：取90只10w齡的db/db小鼠分為5組，包括模型對照組乳清蛋白組和3個海參膠原肽組(從低到高分別為0.25、0.50、1.00 g/kg·BW)，每組18只。另設(shè)一組同周齡、性別的db/m小鼠18只作為正常對照組。模型對照組和正常對照組使用溶劑(蒸餾水)灌胃。進行背部切口手術(shù)后開始干預(yù)，分別于術(shù)后第4、7、14d分批處死動物，每組每次處死6只。術(shù)后觀察不同時期傷口愈合情況，測定血清生化指標(biāo)、皮膚切口抗張力強度以及進行皮膚組織HE染色。結(jié)果：與模型對照組相比，海參膠原肽劑量組小鼠血清IL-8水平降低，IL-10水平升高，NO水平升高，傷口抗張力強度提升，傷口愈合較好。結(jié)論：海參膠原低聚肽能夠改善糖尿病小鼠術(shù)后營養(yǎng)狀況，促進傷口愈合。

海參膠原低聚肽；糖尿??；傷口愈合

糖尿病人傷口愈合緩慢是糖尿病的一種常見并發(fā)癥[1]。在臨床中，糖尿病患者由于傷口愈合困難，從而使其發(fā)生潰瘍、感染甚至壞疽和截肢[2]。尋找促進糖尿病人傷口愈合的方法對于改善術(shù)后糖尿病人的生活質(zhì)量，減少并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的作用。海參肽具有多種生物活性功能[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，海參膠原肽能夠促進正常大鼠傷口膠原蛋白合成從而促進傷口愈合[4]。本研究擬建立糖尿病小鼠傷口模型，觀察海參膠原低聚肽對糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

海參膠原低聚肽：淡黃色粉末，利用生物酶解技術(shù)從海參中提取、制備的小分子生物活性肽。經(jīng)高效液相色譜純化后，用質(zhì)譜儀對其分子質(zhì)量分布進行分析可知，其相對分子質(zhì)量小于1 000的占89.44%，游離氨基酸含量占7.496%，其中精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸含量較多。實驗樣品由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.2 實驗動物

SPF級雄性db/db型糖尿病小鼠以及與之周齡、性別匹配的同窩出生的非糖尿病健康db/m小鼠，10w齡，由常州卡文斯實驗動物公司提供。

清潔級動物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度21～23℃，相對濕度50%～60%，動物分籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。

1.3 主要儀器和試劑

高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)；PCLAB-UE生物醫(yī)學(xué)信號采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；力換能器(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)；CK40-SL倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；小鼠IL-8、IL-10(ELISA)檢測試劑盒、小鼠NO檢測試劑盒(北京泰格諾克科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物創(chuàng)傷模型的建立 小鼠經(jīng)過4%水合氯醛麻醉后，進行背部脫毛。常規(guī)皮膚消毒，于背部兩側(cè)分別切一個長1.5cm的縱向切口。切口切開肌肉，深達腹腔。然后模擬臨床手術(shù)過程逐層縫合肌肉與皮膚。術(shù)后涂抹2%碘伏消毒，并注射青霉素G鈉(1 000 IU/g·BW)防止感染。術(shù)后禁食6h，保持正常飲水。手術(shù)當(dāng)天記為第0d。

1.4.2 實驗動物分組 db/db小鼠90只，每組18只，隨機分為5組。包括模型對照組、乳清蛋白組(0.50 g/kg·BW)和海參膠原低聚肽劑量組(從低到高分別為0.25、0.50、1.00 g/kg·BW)。同時設(shè)立1組正常對照組，為18只同窩出生的非糖尿病db/m小鼠。正常對照組和模型對照組用等體積溶劑(蒸餾水)進行灌胃。于手術(shù)當(dāng)天開始灌胃進行干預(yù)，海參肽3個劑量組每天灌胃給予海參肽水溶液，乳清蛋白組給予乳清蛋白水溶液，正常對照組和模型對照組每天灌胃給予同體積的蒸餾水。灌胃量為0.1 mL/10g，每日1次。乳清蛋白水溶液和海參肽水溶液均用蒸餾水配置。分別于術(shù)后第4、7、14d分批處死小鼠，每組每次處死6只。

1.4.3 傷口愈合的評價

傷口愈合的組織病理學(xué)觀察：各組小鼠于第4、7、14d處死時取左側(cè)全層皮膚組織，組織切口距傷口邊緣0.5 cm，用甲醛固定用于做石蠟切片進行HE染色。

傷口的抗?jié)q強度測試：各組小鼠于第4、7、14d處死時取右側(cè)傷口皮膚，以傷口處為中線，寬0.5 cm，距傷口兩側(cè)各0.5 cm為長的長方形皮膚，去除皮下脂肪組織。將皮膚短邊的一頭連接到張力感受器，另一端連接到可以通過旋鈕微調(diào)距離的裝置上。緩慢調(diào)動旋鈕拉伸皮膚，通過多功能生物信號采集系統(tǒng)記錄皮膚斷開時的張力大小。通過測微尺測量皮膚的厚度計算橫截面積，張力除以橫截面積即為皮膚的抗張強度。

血清生化指標(biāo)檢測：小鼠摘眼球采血后靜置30min，于4℃ 3 000r/min的條件下離心20min，取上層血清保存待用。用試劑盒測定血清中IL-8、IL-10、NO的水平，按照試劑盒說明書操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 術(shù)后小鼠傷口愈合組織病理學(xué)觀察結(jié)果

由圖1可見，術(shù)后第7d，正常對照組傷口表面完整性較好，創(chuàng)面毛細血管密集，成纖維細胞較多。模型對照組傷口表面完整性較差，瘢痕組織較多，炎性細胞浸潤明顯，毛細血管形成較少。乳清蛋白組傷口創(chuàng)面毛細血管較少且有大量炎性細胞浸潤。海參肽干預(yù)后可見毛細血管形成增多，瘢痕組織明顯減少，成纖維細胞聚集，且炎性細胞明顯低于模型對照組。

由圖2可見，術(shù)后第14d，正常對照組傷口表面愈合較好，表面平整，瘢痕組織小，少見炎性細胞浸潤，毛細血管密集，成纖維細胞較多。模型對照組傷口仍有大量瘢痕組織，伴隨大量炎性細胞浸潤，毛細血管和成纖維細胞均較少。乳清蛋白組瘢痕組織較多，毛細血管少。海參肽干預(yù)組瘢痕組織明顯減少，皮膚表面完整性較好，毛細血管較多，炎性細胞浸潤明顯較少且伴有較多的成纖維細胞。

圖1 術(shù)后第7d小鼠傷口愈合組織學(xué)觀察情況(40×)A：正常對照組 B：模型對照組 C：乳清蛋白組 D：海參肽低劑量組 E：海參肽中劑量組 F：海參肽高劑量組

圖2 術(shù)后第14d小鼠傷口愈合組織學(xué)觀察情況(40×)A：正常對照組 B：模型對照組 C：乳清蛋白組 D：海參肽低劑量組 E：海參肽中劑量組 F：海參肽高劑量組

2.2 術(shù)后各組小鼠傷口張力強度

如表1所示，術(shù)后第7d，與正常對照組相比，模型對照組、乳清蛋白組、海參肽3個劑量組傷口張力強度均明顯較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型對照組相比，乳清蛋白組傷口張力強度無顯著升高，海參肽3個劑量組傷口張力強度均明顯較高，其中海參肽中、高劑量組傷口張力強度增高更為顯著；與乳清蛋白組相比，海參肽3個劑量組傷口張力強度均明顯較高，其中海參肽中、高劑量組傷口張力強度增高更為顯著。術(shù)后第14d，與正常對照組相比，模型對照組、乳清蛋白組、海參肽3個劑量組傷口張力強度均明顯較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型對照組相比，乳清蛋白組傷口張力強度無顯著升高，海參肽中、高劑量組傷口張力強度均明顯較高，其中海參肽中劑量組傷口張力強度增高更為顯著；與乳清蛋白組相比，海參肽中、高劑量組傷口張力強度均明顯較高。

表1 術(shù)后第7、14d各組小鼠傷口張力強度

注：*與正常對照組相比P<0.05、**與正常對照組相比P<0.01；#與模型對照組相比P<0.05、##與模型對照組相比P<0.01；△與乳清蛋白組相比P<0.05；△△與乳清蛋白組相比P<0.01。

2.3 小鼠血清中白細胞介素8、10水平

由表2、表3發(fā)現(xiàn)，在同一時期里，各劑量組IL-8含量與模型對照組相比均有降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣在同一時期里，各個劑量組IL-10含量與模型對照組相比均有顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 術(shù)后第4、7、14d各組小鼠血清白細胞介素8水平

表3 術(shù)后第4、7、14d各組小鼠血清白細胞介素10水平

注：*與正常對照組相比P<0.05、**與正常對照組相比P<0.01；#與模型對照組相比P<0.05、##與模型對照組相比P<0.01；△與乳清蛋白組相比P<0.05、△△與乳清蛋白組相比P<0.01。

2.4 小鼠血清中一氧化氮(NO)檢測結(jié)果

術(shù)后第14d，與正常對照組相比，模型對照組、乳清蛋白組、海參肽3個劑量組小鼠血清NO濃度均明顯較低(P<0.01)；與模型對照組相比，海參肽3個劑量組小鼠血清NO濃度均明顯較高血清NO濃度均明顯較高(P<0.05)；與乳清蛋白組相比，海參肽低、中劑量組小鼠血清NO濃度均明顯較高(P<0.01)(圖3)。

圖3 術(shù)后第14d各組小鼠血清NO水平 注：*與正常對照組相比P<0.05、**與正常對照組相比P<0.01；#與模型對照組相比P<0.05、##與模型對照組相比P<0.01；△與乳清蛋白組相比P<0.05、△△與乳清蛋白組相比P<0.01。

3 討論與結(jié)論

db/db小鼠是自發(fā)性糖尿病模型小鼠，屬2型糖尿病模型。小鼠在1個月時開始貪食及發(fā)胖，繼而發(fā)生嚴重的糖尿病癥狀[5]。相比于手動誘發(fā)糖尿病的小鼠，該模型鼠不存在人為誘導(dǎo)因素的干擾，糖尿病的產(chǎn)生與臨床患者更為相似[6]，因此實驗結(jié)果更為可靠。由于db/db小鼠純合子不育，需要用雜合子來交配繁殖，故引入m基因來保持小鼠的糖尿病表型[7]。純合子的db/db小鼠保持糖尿病表型，而雜合子的db/m小鼠為非糖尿病。本實驗采用db/m小鼠作為正常對照，以對比正常的非糖尿病小鼠與糖尿病小鼠之間的差異。對照組中另設(shè)一組乳清蛋白組，意為提供與中劑量組同濃度蛋白質(zhì)，排除額外攝入營養(yǎng)物質(zhì)帶來的影響，說明干預(yù)效果是由海參膠原低聚肽產(chǎn)生。

傷口愈合包括凝血期、炎癥期、增殖期與塑性期，這四個時期之間沒有明顯的界限[8]。在正常傷口愈合的過程中，炎癥反應(yīng)迅速發(fā)生并持續(xù)3d左右，然而在糖尿病患者的傷口愈合過程中，炎癥反應(yīng)的持續(xù)時間明顯延長并影響傷口的正常愈合[9]。本實驗對各組小鼠皮膚切口進行病理觀察，與模型對照組相比，各劑量組明顯可見炎性細胞浸潤的減少，提示海參膠原低聚肽對于糖尿病小鼠傷口愈合過程中的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。有研究表明，炎性相關(guān)因子IL-8增加可能延長炎癥期引起糖尿病傷口愈合障礙[10]。同時，對于抗炎因子IL-10，也有報道其調(diào)節(jié)成纖維細胞再生，促進組織修復(fù)[11]。本實驗對小鼠IL-8和IL-10進行了檢測，結(jié)果相對于模型對照組，顯示各劑量組IL-8水平降低而IL-10水平升高。說明海參膠原低聚肽的干預(yù)，避免了慢性傷口愈合過程的炎癥反應(yīng)過度延長，從而對糖尿病傷口的愈合有著一定的促進作用。創(chuàng)傷修復(fù)過程中毛細血管的再生能夠為創(chuàng)傷部位組織提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，促進肉芽組織的形成。本研究通過對db/db 2型糖尿病小鼠傷口皮膚組織進行HE染色發(fā)現(xiàn)，3個海參肽劑量組的小鼠傷口處微血管的形成相對于模型對照組顯著增加。

傷口重塑以及瘢痕的形成主要受膠原的影響[12-13]。本實驗病理檢測顯示，3個劑量組小鼠傷口處成纖維細胞明顯多于模型對照組。通過傷口抗張強度測試也發(fā)現(xiàn)中劑量和高劑量組小鼠傷口抗張力強度顯著高于模型對照組，說明海參肽中、高劑量組小鼠傷口愈合程度顯著優(yōu)于模型對照組。除了分泌膠原酶以外，成纖維細胞還會分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[14-15]。VEGF可以影響血管的新生和血管通透性的增加，刺激內(nèi)皮細胞遷移通過細胞外基質(zhì)，從而改善傷口愈合過程中的血管形成[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，對db/db小鼠進行VEGF的局部治療可以通過促進局部血管生成改善傷口處的新生血管生成情況[17]。由此可以推測VEGF或者刺激其產(chǎn)生的藥物可用于促進慢性傷口愈合的組織修復(fù)。目前已經(jīng)證明NO可以增加VEGF的表達從而刺激新生血管的形成[18]，并且NO是促進VEGF表達的最為有效的因子[19]。本實驗各個劑量組NO水平均顯著高于模型對照組，因此，可以推測海參膠原低聚肽可能促進糖尿病小鼠NO水平升高，從而促進新生血管的形成，進而改善慢性傷口的愈合。

本研究通過建立db/db 2型糖尿病小鼠術(shù)后傷口模型，設(shè)立蒸餾水以及乳清蛋白干預(yù)作為對照組，探討海參膠原低聚肽對于糖尿病小鼠術(shù)后傷口愈合的促進作用，結(jié)果提示，海參膠原低聚肽能夠促進糖尿病小鼠手術(shù)后傷口的NO生成和新生血管形成，減少炎癥反應(yīng)并且增強傷口抗張力強度，說明海參膠原低聚肽能夠促進糖尿病人傷口愈合。◇

[1]SALAZAR J J，ENNIS W J，KOH T J.Diabetes medications：Impact on inflammation and wound healing[J].Diabetes Complications，2016，30(4)：746-752

[2]Greenhalgh DG.Wound healing and diabetes mellitus[J].Clin.Plast.Surg，2003，30(1)：37-45.

[3]趙芹.海參膠原蛋白多肽抗氧化活性的研究[D]. 中國海洋大學(xué)，2008.

[4]梁銳，張召鋒，趙明，等.海洋膠原肽對剖宮產(chǎn)大鼠傷口愈合促進作用[J].中國公共衛(wèi)生，2010，26(9)：1144-1145.

[5]吳靜，王華旻，李晶，等.db/db小鼠的實驗室應(yīng)用[J].生理科學(xué)進展，2013，44(1)：12-18.

[6]劉芳，楊華，周文江，等.誘發(fā)性2型糖尿病小鼠模型與自發(fā)性db/db 小鼠特性的比較[J].中國實驗動物學(xué)報，2014，10(6)：54-59.

[7]唐慧青，陳立新，梁磊，等.型糖尿病模型-小鼠的生物學(xué)特性研究[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2011，31(1)：62-65.

[8]鐵璐等.糖尿病傷口愈合的分子機制[J].生理科學(xué)進展，2010，41(6)：407-412.

[9]Zhang，Z，et al..Oral administration of skin gelatin isolated from Chum salmon (Oncorhynchus keta)enhances wound healing in diabetic rats.[J].Marine Drugs，2011，9(5)：696-711.

[10]SINGH K，et al.Increased expression of TLR9 associated with pro-inflammatory S100A8 and IL-8 in diabetic wounds could lead to unresolved inflammation in type 2 diabetes mellitus (T2DM)cases with impaired wound healing[J].Journal of Diabetes and its Complications，2016，30(1)：99-108.

[11]BALAJI S，WANG X，KING A，et al.Interleukin-10-mediated regenerative postnatal tissue repair is dependent on regulation of hyaluronan metabolismvia fibroblast-specific STAT3 signaling[J].The FASEB Journal，2017，31(3)：868-881.

[12]王益民，韋?？?，劉敏.成纖維細胞與創(chuàng)傷修復(fù)的研究進展[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2000，14(2)：126-128.

[13]LI J，CHEN J，KIRSNER R.Pathophysiology of acute wound healing[J].Clinics in Dermatology，2007，25(1)：9-18.

[14]BITTO A，et al.Simvastatin enhances VEGF production and ameliorates impaired wound healing in experimental diabetes[J].Pharmacol Res，2008，57(2)：159-169.

[15]CHA J，KWAK T，BUTMARC J，et al.Fibroblasts from non-healing human chronic wounds show decreased expression of beta ig-h3，a TGF-beta inducible protein[J].J Dermatol Sci，2008，50(1)：15-23.

[16]Santos S C，et al.VEGF and VEGFR-2 (KDR)internalization is required for endothelial recovery during wound healing[J].Exp Cell Res，2007，313(8)：1561-1574.

[17]RD Galiano，OM Tepper，CR Pelo，et al..Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells[J].American Journal of Pathology，2004，164(6)：1935-1947.

[18]B Romanasouza，AP Nascimento，A Montealtocosta.Propranolol improves cutaneous wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats[J].European Journal of Pharmacology，2009，611(1)：77-84.

[19]MB Witte，T Kiyama，A Barbul.Nitric oxide enhances experimental wound healing in diabetes[J].British Journal of Surgery，2002，89(12)：1594-1601.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effect of Sea Cucumber Collagen Oligopeptide in Diabetic Wound Healing

LI Lin，LI Di，XU Teng，LIU Rui，REN Jin-wei，CHEN Qi-he，LI Yong

(School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China)

sea cucumber oligopeptide;diabetes mellitus;wound healing

國家自然科學(xué)基金(項目編號：81573138)。

李林(1991— )，男，碩士，研究方向：肽營養(yǎng)學(xué)。

李勇(1957— )，男，教授，研究方向：肽營養(yǎng)學(xué)。