陳榮國 孫強 曾懌 王書奎

1．南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南京市中醫(yī)院骨科，江蘇南京210001

2．南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院孫強(骨科 中心實驗室)，江蘇南京210006

3．南京市六合人民醫(yī)院骨三科，江蘇南京211500

椎間盤退變是導(dǎo)致腰椎間盤突出癥、頸椎病等臨床常見椎間盤退變性疾病的根本原因。椎間盤由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板三部分組成，其中，軟骨終板在營養(yǎng)運輸、調(diào)控椎間盤內(nèi)壓和穩(wěn)定椎間盤結(jié)構(gòu)等方面起著重要作用，軟骨終板退變會導(dǎo)致其營養(yǎng)運輸功能減退、椎間盤營養(yǎng)供給不足，減低椎間盤內(nèi)壓、破壞椎間盤整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而進一步促進椎間盤整體退變［1］。炎性因子在促進軟骨終板退變中扮演著重要角色，其中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是最主要的炎性因子之一，IL-1β作用于軟骨終板細胞，可刺激軟骨終板細胞產(chǎn)生和分泌金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，MMPs家族中的MMP-1能夠降解纖維膠原，MMP-3能夠分解和破壞細胞外基質(zhì)，以上物質(zhì)共同作用于軟骨終板細胞，抑制作為軟骨基質(zhì)的蛋白多糖和II型膠原的合成以及促進其分解，從而加速軟骨終板的退變。

雷公藤紅素是雷公藤片、雷公藤多甙片等制劑的有效成分之一，是一種具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，因其具有顯著的抗炎活性，而被廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等疾病的治療［2］，但是雷公藤能否抑制IL-1β對軟骨終板細胞的影響，目前尚缺乏相關(guān)研究報道。本研究主要擬通過體外培養(yǎng)小鼠軟骨終板細胞，探討雷公藤紅素能否抑制IL-1β介導(dǎo)的軟骨終板細胞退變及其可能的作用機制，為椎間盤退變的臨床治療研究提供一個新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

雷公藤紅素(Sigma公司，美國);重組人細胞因子IL-1β(Peprotech公司，美國);CCK-8試劑盒(凱基公司，中國);TRIzol(Invitrogen公司，美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green Mixture(TaKaRa公司，日本);小鼠MMP-1、MMP-3 ELISA試劑盒(上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，中國);96孔反應(yīng)板(ABI公司，美國);PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成 (蛋 白 多 糖:Forward Primer 5’-TGATGCTGTATTGGCTGCACC-3’ReversePrimer 5’-CTACATGGTTGTCAGGAATGTGT-3’;II型膠原:Forward Primer 5’-TGGACGATCAGGCGAAACC-3’ReversePrimer5‘-GCTGCGGATGCTCTCAATCT-3’);PCR反應(yīng)儀器為ABI 7500型PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞的分離、培養(yǎng):頸椎脫臼法將小鼠處死后，無菌條件下取下整個腰椎，解剖顯微鏡下剝離包裹軟骨組織的筋膜和肌肉顯露椎間盤，分離軟骨終板，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)數(shù)次沖洗后剪碎，再加入0.2%的II膠原酶3 mL，并移入消化瓶里，37℃恒溫消化3～4 h，待大部分細胞游離時，經(jīng)過濾、收集、離心、棄上清后加入完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、25 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素)，吹打、混勻制成單細胞懸液，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，48 h后更換培養(yǎng)液，將未貼壁的細胞團塊棄去，之后每48 h更換1次培養(yǎng)液，將該代細胞標記為P0代細胞，當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)細胞生長融合度達80%時傳代，取對數(shù)期生長的P2代細胞進行實驗。

1.2.2 雷公藤紅素對軟骨終板細胞增殖的影響:取無血清 DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco＇s modified eagle medium)稀釋細胞(2×103/mL)接種于96孔板，分別用含0、0.1、0.25、0.5、1.0 μmol/L 雷公藤紅素的無血清DMEM處理細胞24、48 h和72 h，然后分別加入每孔10 μL CCK-8試劑，孵育1.5 h后，以熒光分光光度儀檢測每孔吸光值。將細胞存活率＞70%的實驗組相對應(yīng)的雷公藤紅素濃度定為無細胞毒性濃度，用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3 雷公藤紅素對軟骨終板細胞MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響:將P2代細胞按2×105/孔接種于6孔板，實驗分組為:空白對照組(無血清DMEM培養(yǎng)基);IL-1β誘導(dǎo)組(IL-1β 5 ng/mL共同孵育2 h);雷公藤紅素干預(yù)組(經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后，再以雷公藤紅素共同孵育24 h)。ELISA法檢測細胞上清液中MMP-1、MMP-3的水平。

1.2.4 雷公藤紅素對軟骨終板細胞的蛋白多糖、II型膠原轉(zhuǎn)錄表達的影響:將P2代細胞按2×105/孔接種于6孔板，實驗分組為:空白對照組(無血清DMEM培養(yǎng)基);IL-1β誘導(dǎo)組(IL-1β 5模范ng/mL共同孵育2 h);雷公藤紅素干預(yù)組(經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后，再以雷公藤紅素共同孵育24 h)。提取總RNA，RT-qPCR法測定軟骨終板細胞蛋白多糖、II型膠原mRNA的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計分析均采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，采用獨立樣本t檢驗或方差分析比較各組各項觀察指標的統(tǒng)計差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素對軟骨終板細胞增殖的影響

以不同濃度的雷公藤紅素分別處理軟骨終板細胞24、48 h 及72 h，0.1 μmol/L 和 0.25 μmol/L 的雷公藤紅素在各個時間點對軟骨終板細胞增殖無明顯抑制作用。但雷公藤紅素1.0 μmol/L在24 h、0.5 μmol/L在48 h能明顯抑制細胞增殖，表明大劑量雷公藤紅素對軟骨終板細胞有一定毒性作用。因此，本實驗選用0.25 μmol/L作為進一步研究用劑量，以保證雷公藤紅素對細胞增殖的影響最小(圖1)。

2.2 雷公藤紅素對軟骨終板細胞MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響

以5 ng/mL的 IL-1β刺激 2 h，再經(jīng)過 0.25 μmol/L雷公藤紅素干預(yù)24 h后，以ELISA法檢測MMP-1和MMP-3的蛋白表達水平(圖2)。結(jié)果顯示，MMP-1、MMP-3經(jīng)過IL-1β刺激后明顯升高，當(dāng)雷公藤紅素干預(yù)后，其水平明顯下調(diào)，與空白對照組無明顯差異。

2.3 雷公藤紅素對軟骨終板細胞的蛋白多糖、II型膠原轉(zhuǎn)錄表達的影響

圖1 不同濃度雷公藤紅素對軟骨終板細胞增殖的影響Fig．1 Effects of different concentrations of celastrol on the proliferation of chondrocytes of the endplate

圖2 雷公藤紅素對MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001Fig．2 Effects of celastrol on the protein expression levels of MMP-1 and MMP-3(*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001)

以5 ng/mL的 IL-1β刺激 2 h，再經(jīng)過 0.25 μmol/L雷公藤紅素干預(yù)24 h后，以RT-qPCR檢測蛋白多糖、II型膠原mRNA表達水平(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白多糖、II型膠原mRNA的表達隨著IL-1β的刺激被顯著抑制，當(dāng)雷公藤紅素干預(yù)24 h后，其mRNA水平明顯被逆轉(zhuǎn)。

3 討論

椎間盤是由纖維環(huán)、髓核和軟骨終板構(gòu)成。軟骨終板是椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，也是椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝產(chǎn)物排泄的重要通道，具有維持椎間盤正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)、緩沖外界壓力負荷的作用，因此，椎間盤軟骨終板的退變是椎間盤退變的始發(fā)階段，與多種復(fù)雜因素密切相關(guān)。

圖3 雷公藤紅素對蛋白多糖和II型膠原的mRNA水平的影響(＊＊＊P ＜0.001)Fig．3 Effects of celastrol on the mRNA expression levels of proteoglycan and type II collagen(＊＊＊P ＜0.001)

IL-1β是由破骨細胞、軟骨細胞等多種細胞分泌，退變軟骨細胞IL-1β異常高表達［3］。IL-1β可通過促進MMPs和一氧化氮的合成來加速細胞退變，同時也可通過其他炎性介質(zhì)來影響椎間盤細胞的繼發(fā)性病理改變［4］。蛋白多糖和II型膠原是構(gòu)成軟骨終板細胞基質(zhì)的主要成分。當(dāng)軟骨終板細胞發(fā)生退變后，二者表達降低，影響其細胞功能［5］。金屬蛋白酶(MMPs)主要參與細胞基質(zhì)的代謝過程。先前的研究［6］顯示，IL-1β在誘導(dǎo)正常軟骨終板細胞后，細胞蛋白多糖、II膠原表達水平減少，MMP-1及MMP-3的表達相應(yīng)增多。本研究結(jié)果表明，在原代培養(yǎng)小鼠軟骨終板細胞中，IL-1β可促進其細胞的MMP-1及MMP-3表達升高，并抑制蛋白多糖、II膠原表達水平，這與上述研究結(jié)果相一致。

雷公藤紅素來源于中藥雷公藤的根皮之中，是雷公藤的一個單體小分子化合物。眾多研究揭示雷公藤紅素具有抗癌、抗炎、免疫抑制、抑制血管生成、誘導(dǎo)細胞凋亡等作用［7］。先前研究［8］表明，雷公藤紅素可通過抑制NF-κB p65蛋白表達、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)及 IL-1β mRNA表達，從而對大鼠結(jié)腸炎具有保護作用。有學(xué)者［9］通過研究雷公藤紅素對小鼠的免疫抑制作用及對細胞因子IL-6 mRNA表達的影響，得出的結(jié)論為雷公藤紅素在一定程度上能抑制小鼠的免疫功能，能抑制炎癥細胞因子IL-6基因的過度表達。有實驗證實雷公藤紅素對膠原性關(guān)節(jié)炎有治療作用［10］。另一研究［11］顯示，在 IL-1β 刺激體外培養(yǎng)的人關(guān)節(jié)軟骨細胞后，雷公藤紅素能夠明顯抑制金屬蛋白酶、誘導(dǎo)性一氧化氮等的產(chǎn)生和分泌，在一定程度上阻止關(guān)節(jié)軟骨的退變。而軟骨終板細胞是軟骨細胞的一類，其表型與關(guān)節(jié)軟骨類似，因此，本研究通過體外培養(yǎng)原代軟骨終板細胞以探討雷公藤紅素對IL-1β介導(dǎo)的軟骨終板細胞退變的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可逆轉(zhuǎn)IL-1β對軟骨終板細胞的效應(yīng)，抑制MMP-1及MMP-3表達水平，并促進蛋白多糖、II膠原表達水平，這表明雷公藤紅素可有效抑制IL-1β介導(dǎo)的軟骨終板細胞退變。

綜上所述，本研究證實了雷公藤紅素可以有效抑制IL-1β對軟骨終板細胞的影響，可能在IL-β介導(dǎo)的椎間盤軟骨終板退變中發(fā)揮阻斷作用，為治療椎間盤退變性疾病提供新的方法和思路。