馬云峰王湘慶張旭郎森陽

·論 著·

雷帕霉素對(duì)未成年癲癇模型大鼠的毒性作用☆

馬云峰*王湘慶△張旭△郎森陽△

目的利用戊四氮（pentylenetetrazol,PTZ）慢性點(diǎn)燃Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）模型觀察在點(diǎn)燃初期腹腔注射雷帕霉素（rapamycin,RAPA）能否抑制癲癇發(fā)生以及雷帕霉素在治療中的安全性。方法將6～8周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為雷帕霉素干預(yù)組PTZ+RAPA及其對(duì)照組PTZ+NS（normal saline）及NS組，觀察1周（w）、2周（w）、4周（w）、6周（w）共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每亞組12只，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量的變化、死亡率及癲癇發(fā)作情況。結(jié)果各組實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率：PTZ+RAPA組為22.9%，PTZ+NS組為10.4%,NS組為0%。PTZ+RAPA組與PTZ+NS組各個(gè)相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（1 w,2 w,4 w,6 w）體質(zhì)量差均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。6周時(shí)PTZ+RAPA組的點(diǎn)燃率為66.7%，PTZ+NS組的點(diǎn)燃率為58.3%，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。PTZ+RAPA組與PTZ+NS組相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（1 w，2 w，4 w，6 w）發(fā)作分值的兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論雷帕霉素未能減少或抑制未成年大鼠的癲癇發(fā)作，但能明顯降低未成年SD大鼠的體質(zhì)量，可能有一定的毒副作用。

雷帕霉素 癲癇 抗驚厥藥

癲癇患者發(fā)作時(shí)間的不確定性和大部分需要長期藥物治療給患者本人及家屬帶了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前癲癇的治療主要還是靠抗癲癇藥物，少數(shù)患者可以行根治或姑息性手術(shù)治療、迷走神經(jīng)電刺激、磁刺激等治療，尚無法預(yù)防性治療方法。目前大量研究表明mTOR信號(hào)通路參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展，在顳葉癲癇、結(jié)節(jié)性硬化、皮層發(fā)育不良及多種癲癇動(dòng)物模型中mTOR通路異常激活，mTOR抑制劑雷帕霉素（RAPA）已用于結(jié)節(jié)性硬化的治療[1]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中予以雷帕霉素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)不僅可控制減少癲癇發(fā)作，還可改善損傷后的病理改變，甚至能抑制癲癇的形成[2]。本研究利用戊四氮（PTZ）慢性點(diǎn)燃SD大鼠模型觀察在點(diǎn)燃初期腹腔注射雷帕霉素（RAPA）能否抑制癲癇發(fā)生以及雷帕霉素在治療中的安全性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象6～8周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠144只，體質(zhì)量180～220 g，由301醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 材料與方法SD大鼠隨機(jī)分為3組：干預(yù)組（PTZ+RAPA）、干預(yù)對(duì)照組（PTZ+NS）、空白組（NS）、每組有4個(gè)亞組，分為1 w、2 w、4 w、6 w 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每亞組12只。

將PTZ（Sigma公司）配成10 mg/mL。雷帕霉素（Santa Cruz公司）的配法[3]：25 mg雷帕霉素溶于1 mL 100%乙醇中-20℃保存，用時(shí)加24 mL 5%聚山梨醇酯80和聚乙二醇400混合物，配比是1：1（雷帕霉素濃度相當(dāng)于1 mg/mL）。PTZ+RAPA組大鼠每天早上八點(diǎn)腹腔注射戊四氮 （PTZ）35 mg/ kg，在腹腔注射戊四氮后半小時(shí)再腹腔注射雷帕霉素3 mg/kg（文獻(xiàn)中的用量在1～10 mg/kg之間），隔日1次；PTZ+NS組大鼠每天早上八點(diǎn)腹腔注射戊四氮（PTZ）35 mg/kg，在腹腔注射戊四氮后半小時(shí)再腹腔注射生理鹽水3 mL/kg，隔日1次；NS組相對(duì)應(yīng)地腹腔注射生理鹽水。每隔2 d稱1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥量。觀察時(shí)間為藥物注射后1 h。根據(jù)Racine分級(jí)[4]評(píng)價(jià)癲癇發(fā)作，在腹腔注射PTZ后連續(xù)出現(xiàn)Ⅲ級(jí)或Ⅲ級(jí)以上發(fā)作5次為點(diǎn)燃成功，點(diǎn)燃成功后停止注射PTZ。飼養(yǎng)條件：8AM/8PM亮暗周期，室溫下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。繪圖使用GraphPad Prism 5軟件。死亡率的比較用χ2檢驗(yàn)；同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組和對(duì)照組體質(zhì)量差的兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn) （檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)）。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組癲癇發(fā)作分值的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或轉(zhuǎn)置后單因素ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率PTZ+RAPA組死亡1 1只，死亡率為22.9%，PTZ+NS組死亡5只，死亡率10.4%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠處死前與入組時(shí)體質(zhì)量的變化（見圖1）

圖1 PTZ+RAPA組與PTZ+NS組各個(gè)相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)體重差均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），4周時(shí)間點(diǎn)時(shí)相差最大。*代表P＜0.05，**代表P＜0.001

2.3 雷帕霉素對(duì)癲癇發(fā)作的影響（見圖2）

圖2 PTZ+RAPA組與PTZ+NS組各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)應(yīng)發(fā)作分值的兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

3 討論

在實(shí)驗(yàn)過程中我們觀察到隔日腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg）會(huì)導(dǎo)致未成年大鼠體質(zhì)量的明顯下降，尤其是對(duì)初始體質(zhì)量小于300 g的大鼠影響顯著。雷帕霉素干預(yù)組SD大鼠的死亡率均高于對(duì)照組，隔日腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg）導(dǎo)致SD大鼠的死亡數(shù)明顯增加，死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異可能與每組大鼠例數(shù)少有關(guān)。在不同的環(huán)境下，雷帕霉素對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響有一定的矛盾，有時(shí)起到神經(jīng)保護(hù)的作用，有時(shí)能加劇細(xì)胞的死亡，具體機(jī)制尚不明確。文獻(xiàn)中雷帕霉素對(duì)SD大鼠的干預(yù)劑量一般在1～10 mg/kg之間，其毒性作用是否與劑量有關(guān)不明，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)干預(yù)劑量分組可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在紅藻氨酸癲癇動(dòng)物模型中也出現(xiàn)了這種矛盾現(xiàn)象，一種推測(cè)性解釋是紅藻氨酸誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作急性期mTOR活性增高，雷帕霉素抑制mTOR會(huì)導(dǎo)致正反饋性激活mTOR的下游效應(yīng)蛋白，如p-S6來補(bǔ)償對(duì)mTOR的直接抑制。無論機(jī)制怎樣，這些發(fā)現(xiàn)提示我們mTOR信號(hào)通路的復(fù)雜性，當(dāng)嘗試應(yīng)用mTOR抑制劑作為神經(jīng)保護(hù)和抗癲癇發(fā)生藥物時(shí)，這樣的治療可能會(huì)使病情惡化[5]。晚開始的雷帕霉素治療在減少癲癇活動(dòng)和細(xì)胞死亡方面是有效的，而提前終止雷帕霉素的治療并不會(huì)導(dǎo)致癲癇活動(dòng)和細(xì)胞死亡的增加[6]。目前雷帕霉素作為控制癲癇發(fā)作的藥物應(yīng)用于臨床主要是針對(duì)結(jié)節(jié)性硬化的患者，目前的臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，維持癲癇控制可能需要持續(xù)和長期mTOR抑制劑治療。mTOR抑制劑的長期應(yīng)用安全問題依然存在，主要在兒童群體[7-8]。正在進(jìn)行的二期和三期臨床研究將突出這種替代治療的選擇的效益和安全性[9]。

我們本研究最終的目的是要明確在腦損傷急性期雷帕霉素干預(yù)能否抑制癲癇的發(fā)生。遺憾的是我們發(fā)現(xiàn)在該模型中，點(diǎn)燃初始即給予隔日腹腔注射雷帕霉素（3 mg/kg）不能減少和抑制實(shí)驗(yàn)大鼠的癲癇發(fā)作。既往大多數(shù)研究在獲得性癲癇動(dòng)物模型神經(jīng)損傷之前或之后即刻通過藥物抑制mTOR通路，可防止動(dòng)物大腦的病理改變和產(chǎn)生自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作。但在我們實(shí)驗(yàn)中4周時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組反而較對(duì)照組發(fā)作分值高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究者采用匹羅卡品（pilocarpine）誘發(fā)10 d SD大鼠的癇性發(fā)作，模擬人類新生兒癲癇，可引起mTOR信號(hào)通路的異常激活，雷帕霉素（0.3 mg/kg）可顯著抑制此種激活，使其固復(fù)至正常水平；未成年期癇性發(fā)作可引起苔蔡纖維發(fā)芽，雷帕霉素可緩解此種病理狀況[10]。本研究未發(fā)現(xiàn)雷帕霉素控制癲癇的作用，可能與所用動(dòng)物模型、雷帕霉素劑量有關(guān)。

經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道大腦對(duì)神經(jīng)損傷包括致癇劑的癲癇易感性是年齡依賴的，恰當(dāng)?shù)胤从沉舜竽X興奮性的整體差異。癲癇易感性發(fā)生發(fā)展的潛在分子和細(xì)胞機(jī)制仍不明確。因?yàn)閙TOR通路調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的生長、突觸可塑性和細(xì)胞生存，從而影響大腦發(fā)育。不成熟大腦暴露在mTOR抑制劑雷帕霉素肯能會(huì)引起神經(jīng)損傷后癲癇易感性的改變。有研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑雷帕霉素在未成熟大鼠（3～4周）匹魯卡品動(dòng)物模型中引起癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度增加，包括延長總發(fā)作持續(xù)時(shí)間和減少癲癇的發(fā)作的潛伏期。雷帕霉素也降低了戊四氮（PTZ）誘發(fā)陣發(fā)性發(fā)作所必需的最小劑量。

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Toxic effect of rapamycin in a young rat model of pentylenetetrazole-induced Kindling epilepsy.

MAYunfeng,WANG Xiangqing,ZHANG xu,LANG Senyang.Department of neurology,Liangxiang teaching hospital of Capital Medical University,Beijing 100242,China.Tel:010-81356022

ObjectiveTo examine the effectiveness and safty of intraperitoneal injection of rapamycin on epileptogenesis in a rat model of pentylenetetrazole-induced kindling epilepsy.MethodThe Sprague Dawley rats at 6-8 weeks old were randomly divided into group PTZ+RAPA and group PTZ+NS.The body weight,mortality and seizures were recorded at 1,4 and 6 weeks after treatment.Mossy fiber sprouting in the hippocampal CA3 area and DG area was examined by Tim staining.Results1.The rats mortality was 22.9%in PTZ+RAPA and 10.4%in PTZ+ NS.Weight alteration was statistically significant between PTZ+RAPA and PTZ+NS at the corresponding time points (P＜0.001);3.The kindling rate was 66.7%in PTZ+RAPA and 58.3%in PTZ+NS at 6 weeks and the difference was statistical significant between these two groups(P＞0.05).There was no statistical significance in the seizure scores between PTZ+RAPA and PTZ+NS(P＞0.05).4.The scores of mossy fiber sprouting in hippocampal CA3 and DG areas was higher in PTZ+NS than in PTZ+RAPA (P＜0.05).ConclusionRapamycin cannot reduce or curb epileptic seizures in young rats.It can obviously reduce the weight of the young SD rats which may be associated with its side effects.

Rapamycin Epilepsy Anti-convulsion drug

R742.1

A

2016-12-20）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.007

☆國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81271438）

* 首都醫(yī)科大學(xué)良鄉(xiāng)教學(xué)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（北京102400）△解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科