馮翠平，張慶霞，趙 芳，李 忻，張 韞，潘曉玉?

（1.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

實(shí)驗(yàn)研究

RNA干擾沉默claudin-4基因表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

馮翠平1，張慶霞1，趙 芳1，李 忻2，張 韞2，潘曉玉1?

（1.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

目的：采用RNA干擾技術(shù)沉默claudin-4基因在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中的表達(dá)，探討claudin-4表達(dá)下調(diào)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖力和侵襲力的影響；比較RNA干擾前后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，探討claudin-4基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：設(shè)計(jì)靶向claudin-4的小干擾RNA （siRNA），轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa。采用CCK分析法檢測(cè)干擾前后細(xì)胞增殖能力的變化，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾前后細(xì)胞侵襲能力的變化。應(yīng)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析檢測(cè)RNA干擾前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。結(jié)果：claudin-4基因沉默可以顯著降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力 （P＜0.05）。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較claudin-4 siRNA干擾前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，共鑒定出5種差異蛋白質(zhì)。結(jié)論：claudin-4基因具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲的作用，這種作用可能通過(guò)改變差異蛋白的表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)。

子宮內(nèi)膜癌；claudin-4；小干擾RNA；蛋白質(zhì)組學(xué)

Author’s address Department of Obstetrics and Gynecology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個(gè)體化靶向治療的發(fā)展，從基因水平研究子宮內(nèi)膜癌的確切發(fā)病機(jī)制成為時(shí)下的熱點(diǎn)[1，2]。

緊密連接是正常上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是腫瘤增長(zhǎng)和侵潤(rùn)的屏障，緊密連接完整性的丟失直接影響癌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)攝取、細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵潤(rùn)。claudin是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)、維持緊密連接功能所必須的一類骨架蛋白，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，claudin-4在多種癌組織中表達(dá)異常。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：claudin-4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)顯著高于在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，為了探討claudin-4基因表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們采用RNA干擾和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究claudin-4在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa由北大人民醫(yī)院魏麗惠教授惠贈(zèng)，Ishikawa細(xì)胞呈claudin-4陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，實(shí)驗(yàn)前24h更換無(wú)酚紅培養(yǎng)基以避免潛在的性激素模擬效應(yīng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）的合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)人Claudin-4基因序列，選擇Claudin-4-homo-1762位點(diǎn)設(shè)計(jì)siRNA，序列信息5'UUACAGUGAUGAAUAGCUCTT 3'。轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine 2000產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)Real-time PCR、Western blot檢測(cè)，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＞75%。實(shí)驗(yàn)設(shè)立Mock組（M，只加入相同劑量轉(zhuǎn)染試劑組）；陰性對(duì)照組（N，加入相同劑量的轉(zhuǎn)染試劑及無(wú)關(guān)序列siRNA組）作為參照。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Ishikawa細(xì)胞的增殖能力

轉(zhuǎn)染前后Ishikawa細(xì)胞按3×105/孔接種于96孔板。分別于培養(yǎng)后24h、48h、72h和96h為檢測(cè)點(diǎn)。每次檢測(cè)前，在培養(yǎng)液中每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃溫箱孵育 2h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處吸光度值。吸光度代表細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力

將50mg/L Matrigel用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基按1：5比例稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，轉(zhuǎn)染48h后的各組細(xì)胞以3×104/孔接種至Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)72h后細(xì)胞結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察移至膜下層的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值，以穿膜細(xì)胞數(shù)的多少表示細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 claudin-4 siRNA干擾前后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖2 claudin-4 siRNA干擾前后細(xì)胞侵襲力的變化

圖3 claudin-4 siRNA干擾前后蛋白質(zhì)表達(dá)差異圖

1.2.4 雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析

收集約1×107的Ishikawa細(xì)胞，溶于400μl含1%蛋白酶抑制劑的樣品裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%DTT）中。將1mg蛋白與水化上樣液 （終濃度：7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、50 mmol/L DTT、0.5%pH 3～10 IPG緩沖液以及痕量溴酚藍(lán)）混勻，上樣總體積為450μl。選用固相pH梯度干膠條（IPG，24cm，pH 3～10 NL）在等電聚焦儀上等電聚焦。第二向凝膠電泳通過(guò)Ettan DALT six垂直平板電泳系統(tǒng)進(jìn)行。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠經(jīng)Image-Scanner Model PowerLook 2100XL掃描儀成像后，利用Image-Master 2D Platinum分析軟件對(duì)獲取的圖像進(jìn)行蛋白點(diǎn)檢測(cè)、配對(duì)和統(tǒng)計(jì)分析。差異2倍和P＜0.05的蛋白點(diǎn)認(rèn)為差異顯著。將差異顯著的蛋白點(diǎn)經(jīng)切膠、提取，進(jìn)行MALDI-TOF/TOF MS分析，經(jīng)MASCOT檢索，確定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Ishikawa細(xì)胞claudin-4 siRNA干擾前后細(xì)胞增殖力的檢測(cè)

Mock組、陰性對(duì)照組、claudin-4 siRNA干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。各時(shí)間點(diǎn)Mock組與陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖力無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與其它2組比較，claudin-4 siRNA干擾組在 24h、48h、72h和96h細(xì)胞增殖力均顯著下降（P＜0.05）。

2.2 Ishikawa細(xì)胞claudin-4 siRNA干擾前后細(xì)胞侵襲力的檢測(cè)

Mock組、陰性對(duì)照組、claudin-4 siRNA干擾組細(xì)胞培養(yǎng)48h時(shí)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為 （215±18）、（200±16）和（60±7）個(gè)。Mock組與陰性對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與其它2組比較，claudin-4 siRNA干擾組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞侵襲力顯著下降（P＜0.05）（圖2）。

2.3 差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

與未干擾組相比，claudin-4 siRNA干擾組出現(xiàn)5種蛋白表達(dá)差異（圖3）。其中，泛素特異性蛋白酶 7 （ubiquitin specific processing protease 7，USP7） 和 酰 基 蛋 白 硫 酯 酶 1 （acyl protein thioesterase 1，APT1）表達(dá)升高，而LASP-1（LIM and SH3 domain protein 1，LASP-1）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29 （endoplasmic reticulum protein 29，ERP29）和過(guò)氧化還原酶5（peroxiredoxin5，PRDX5）蛋白表達(dá)降低。

3 討論

3.1 claudin-4與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的關(guān)系

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，claudin-4在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌及多種腫瘤細(xì)胞系中均呈升高的表達(dá)[3]，提示claudin-4的異常表達(dá)可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，claudin-4在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)顯著高于在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[4]，由此推測(cè)，claudin-4的異常升高表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病相關(guān)。為了進(jìn)一步探討claudin-4與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系，我們對(duì)高表達(dá) claudin-4的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)孕激素處理Ishikawa細(xì)胞后，Ishikawa細(xì)胞中claudin-4的表達(dá)明顯降低[5]；以Ishikawa細(xì)胞制備子宮內(nèi)膜癌動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)順鉑化療后移植瘤中claudin-4的表達(dá)亦顯著降低[6]。上述研究結(jié)果可以推論與正常子宮內(nèi)膜相比，claudin-4在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)顯著升高，claudin-4的過(guò)度表達(dá)可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后，為了進(jìn)一步探討claudin-4與子宮內(nèi)膜癌惡性行為的關(guān)系，我們對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa進(jìn)行了深入的研究。當(dāng)采用RNA干擾技術(shù)沉默claudin-4的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Ishikawa細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力均顯著降低。表明claudin-4基因的表達(dá)參與了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Hwang等[7]研究發(fā)現(xiàn)claudin-4基因可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Agarwal等[8]研究發(fā)現(xiàn)claudin-4在原發(fā)性卵巢癌中呈顯著高表達(dá)，其升高表達(dá)的程度與卵巢癌組織分級(jí)和臨床分期呈正相關(guān)。將claudin-4的野生型基因轉(zhuǎn)染正常卵巢上皮細(xì)胞系，可以導(dǎo)致細(xì)胞侵襲力和細(xì)胞遷移力增加；用RNA干擾技術(shù)沉默claudin-4在卵巢癌細(xì)胞系的表達(dá)，細(xì)胞的侵襲力顯著下降。claudin-4基因在多種腫瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)出與本研究類似的作用，說(shuō)明claudin-4的升高表達(dá)可以顯著增加細(xì)胞的侵襲力。但是，在Michl等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，將SUIT-2胰腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)claudin-4會(huì)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的侵襲力和細(xì)胞增殖力下降。這種生物學(xué)行為的差異，可能是由于claudin-4屬于高度細(xì)胞學(xué)依賴，不同細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境決定了其組織功能間的差異表達(dá)。

3.2 claudin-4表達(dá)異常對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

claudin-4基因沉默可以顯著降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，可能的機(jī)制為：claudin-4 siRNA通過(guò)結(jié)合目的DNA，在轉(zhuǎn)錄水平影響 claudin-4基因表達(dá)；claudin-4 siRNA與mRNA競(jìng)爭(zhēng)影響其翻譯過(guò)程，進(jìn)而影響其下游與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制了claudin-4基因的表達(dá)。為了了解其潛在的作用機(jī)理，我們對(duì)claudin-4 siRNA前后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)RNA干擾后USP7和APT1蛋白表達(dá)升高，而LASPl、ERP29和PRDX5蛋白表達(dá)降低。

USP7是泛素特異性修飾酶家族的成員之一，是P53底物特異性去泛素化蛋白酶，USP7能使P53免于降解，穩(wěn)定或者修復(fù)細(xì)胞內(nèi)P53表達(dá)水平，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[10]。APT1是具有硫酯酶活性和磷脂酶活性的酶。一方面，APT1通過(guò)其硫酯酶活性參與蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)中起著非常重要的作用。另一方面，APT1還通過(guò)其磷脂酶活性調(diào)節(jié)溶血磷脂水平，在細(xì)胞增殖以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[11]。LASPl蛋白是一種細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中特殊的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在多種上皮組織呈差異性表達(dá)。已有文獻(xiàn)證實(shí)LASP-1在肝癌和腎癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并和腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。ERP29是位于真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可溶性蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)表達(dá)顯著增強(qiáng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。PRDX5是過(guò)氧化物酶家族蛋白的一種，主要定位于線粒體，能保護(hù)線粒體DNA免受過(guò)氧化氫的損傷，PRDX5通過(guò)控制活性氧水平負(fù)性調(diào)控氧化應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[14]?？梢?jiàn)，claudin-4 siRNA后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移信號(hào)水平均產(chǎn)生影響，造成抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的蛋白USP7和APT1表達(dá)升高，而增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的蛋白 LASP-1、ERP29和PRDX5表達(dá)降低。由于claudin-4的表達(dá)受多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，RNA干擾Ishikawa細(xì)胞后具體引起了哪種信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變尚需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，claudin-4是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)促進(jìn)因素，參與了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。隨著對(duì)claudin-4研究的不斷深入，將對(duì)探討子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制、治療和判斷預(yù)后產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義。

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Effects of silencing claudin-4 gene expression by RNA interference on biological behavior of endometrial cancer cell

//
FENG Cui-ping，ZHANG Qing-xia，ZHAO Fang，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Jun，31（3）：167-170

Objective：To detect the efficacy of downgrading claudin-4 expression on cell proliferation and invasion of Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell line in response to silence claudin-4 gene expression by RNA interference technique.To compare the difference of protein expression and to discuss the effect of claudin-4 gene on the pathogenesis of endometrial cancer.M ethods：Small interfering RNA (siRNA)was designed to target claudin-4 and transfected into human endometrial cancer cells-Ishikawa cells. The proliferation and invasion capability of Ishikawa cells before and after the interference were evaluated by CCK and transwell analysis.The difference of protein expression was also detected before and after the interference by 2D gel and mass spectrometry.Results：Effective knockdown of claudin-4 suppressed the proliferation and reduced the invasion capability of Ishikawa cells.Further proteomics analysis revealed that USP7 and APT1 were up-regulated while LASP1，ERP29 and PRDX5 were down-regulated by silence of claudin-4.Conclusion：Knockdown of claudin-4 suppressed cell proliferation and reduced the invasion capability of Ishikawa cells by down-regulation of key proteins involved in cell proliferation and invasion.

endometrial carcinoma；claudin-4；small interfering RNA；proteomics

R737.3

A

1001-002592017）03-0167-04

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.03.011

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)30901599）

1* 本文通訊作者。

馮翠平（1976-），女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

2017-03-17

2017-04-19