黃 燦張忠海吳淑勤張 丁李思思陳孝煊吳志新

(1.華中農業(yè)大學水產學院, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室淡水水產健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070; 2.中國水產科學研究院珠江水產研究所, 廣州 510380)

益生芽孢桿菌對草魚腸黏膜結構的保護作用

黃 燦1張忠海1吳淑勤2張 丁1李思思1陳孝煊1吳志新1

(1.華中農業(yè)大學水產學院, 農業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室淡水水產健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070; 2.中國水產科學研究院珠江水產研究所, 廣州 510380)

為了研究益生菌對草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸道黏膜結構的保護作用, 選取健康草魚隨機分成3組: ①對照組: 口灌無菌PBS 0.2 mL/尾后第2和第4天分別口灌無菌PBS 0.1 mL/尾; ②嗜水氣單胞菌組(Ah組):口灌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)菌液0.2 mL/尾(1.0×107cfu/mL)后第2和第4天分別口灌無菌PBS 0.1 mL/尾; ③枯草芽孢桿菌保護組(Ah+Bs組): 口灌嗜水氣單胞菌菌液0.2 mL/尾后第2和第4天分別口灌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌液0.1 mL/尾(1.0×107cfu/mL); 連續(xù)7d取中腸中部, 通過檢測草魚腸黏膜形態(tài)及腸上皮細胞微絲骨架的變化, 旨在研究益生枯草芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌造成的腸黏膜結構損傷的保護作用。結果表明: Ah組病變主要表現(xiàn)為腸道黏膜上皮細胞變性, 壞死, 大量脫落; 固有層出血、水腫變粗; 大量炎性細胞浸潤; 超微結構變化表現(xiàn)為緊密連接縫隙明顯變寬; 微絨毛萎縮變短, 稀疏, 排列紊亂; 線粒體可見明顯腫脹、嵴減少, 內質網(wǎng)明顯擴張; 腸上皮細胞中的微絲呈綠色霧狀, 微絲熒光強度逐漸減弱, 明顯低于對照組。與Ah組相比, Ah+Bs組上述病變有明顯改善, 腸道黏膜上皮細胞輕微脫落, 炎癥和出血等癥狀明顯減輕; 緊密連接縫隙明顯變窄; 微絨毛數(shù)量多且排列較整齊; 線粒體無明顯腫脹; 腸上皮細胞中的微絲熒光強度高于Ah組。結果說明益生芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌造成的腸黏膜結構損傷有一定的保護作用。

益生枯草芽孢桿菌; 嗜水氣單胞菌; 草魚; 腸黏膜; 微絲骨架

草魚在高密度集約化和工廠化養(yǎng)殖過程中, 經常遭受細菌、病毒和寄生蟲等病原的感染而引發(fā)各種各樣的疾病。在細菌引起的疾病中, 由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的細菌性腸炎是草魚養(yǎng)殖過程中最為常見的疾病之一[1]。目前對嗜水氣單胞菌引起的疾病多采用抗生素治療, 但抗生素大量使用帶來的藥物殘留和耐藥菌株等負面影響已引起了學術界和消費者的高度關注[2]。利用綠色環(huán)保的芽孢桿菌替代抗生素來防治疾病已在養(yǎng)殖業(yè)上得到應用, 芽孢桿菌能促進水生動物的生長[3], 提高水生動物的免疫功能[4], 還能維持水生動物腸道微生態(tài)的平衡[5]。腸道結構和功能正常是營養(yǎng)物質被消化吸收的前提, 研究表明, 芽孢桿菌可以促進動物腸道的生長發(fā)育, 提高腸壁厚度、腸黏膜高度以及腸絨毛密度等[6]?？莶菅挎邨U菌可提高草魚腸道皺襞高度以及微絨毛高度、寬度和密度[7];芽孢桿菌可使鯉前腸皺褶增多、隱窩加深, 微絨毛粗長而密集, 腸吸收面積增大[8]。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Ch9是分離自草魚的一株益生菌, 已證明對草魚的生長有良好的促進作用[9]。本實驗給感染嗜水氣單胞菌的草魚口灌一定劑量的枯草芽孢桿菌, 通過檢測草魚腸道結構及腸上皮細胞微絲骨架的變化, 旨在了解該益生菌對嗜水氣單胞菌造成的腸道損傷的修復作用, 探討益生菌對草魚腸道的保護機制, 以期為該益生菌在防控草魚腸道疾病的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

嗜水氣單胞菌Ah1菌株: 分離自細菌性敗血癥銀鯽, 可引起草魚、銀鯽、團頭魴、鰱等魚類細菌性敗血癥和腸炎。將Ah1接種于LB液體培養(yǎng)基, 28℃振蕩培養(yǎng)16—20h后離心收集, 用無菌的PBS調整菌懸液濃度為1.0×107cfu/mL備用。

枯草芽孢桿菌Ch9菌株: 分離自草魚腸道。將Ch9接種于LB液體培養(yǎng)基, 37℃振蕩培養(yǎng)24h后離心收集, 用無菌的PBS調整菌懸液濃度為1.0×107cfu/ mL備用。

以上菌株由華中農業(yè)大學水產學院水生動物醫(yī)學實驗室保存。

1.2 實驗魚及分組

實驗用草魚購于湖北省黃岡市百容水產良種有限公司, 平均體重為(70.0±5.0) g。暫養(yǎng)2周后開始實驗, 整個實驗期間保持微流水, 溶氧5—6 mg/L, pH約6.8, 每天投喂2次(10:00和16:00)海大707#草魚飼料。

實驗分3組, 分別為①對照組: 口灌無菌PBS 0.2 mL/尾后第2天、第4天分別口灌無菌PBS 0.1 mL/尾;②Ah組: 口灌嗜水氣單胞菌菌液0.2 mL/尾后第2天、第4天分別口灌無菌PBS 0.1 mL/尾; ③Ah+Bs組: 口灌嗜水氣單胞菌菌液0.2 mL/尾后第2和第4天分別口灌枯草芽孢桿菌菌液0.1 mL/尾; 每組設3個重復?？诠嗉毦膭┝繀⒖嘉墨I[9]和預實驗結果確定。實驗魚飼養(yǎng)于養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 每個缸容積300 L,每缸20尾魚。

1.3 取樣及切片觀察

每組于第2次口灌無菌PBS或枯草芽孢桿菌菌液前開始取樣, 連續(xù)取樣7d, 每次取樣6尾魚/組。實驗魚用魚寶麻醉后剖開腹腔, 剝離腸系膜, 取中腸中部, 用無菌PBS清洗殘余內容物后, 迅速將樣品放入對應的固定液中固定12—24h后將樣品修剪成需要大小, 更換新鮮固定液繼續(xù)固定。

石蠟切片按常規(guī)方法, 多聚甲醛固定, 乙醇梯度脫水, 二甲苯透明, 切片厚度為5 μm; HE染色, OLYMPUS顯微鏡下觀察、拍照。

超薄切片樣品用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定,乙醇梯度脫水, 丙酮與環(huán)氧樹脂滲透, 環(huán)氧樹脂包埋, EM UC7型(Leica)超薄切片機切片, 厚度為60—100 nm, 經鈾和鉛雙染色, Tecnai G220 TWIN型透射電鏡下觀察、拍照。

1.4 細胞骨架觀察

參照文獻[10]將石蠟切片經二甲苯、無水乙醇和蒸餾水脫蠟至水, 3% BSA室溫封閉30min, 鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)室溫孵育2h, DAPI染液避光室溫孵育10min, 切片用抗熒光淬滅封片劑封片。在OLYMPUS熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 益生芽孢桿菌對草魚腸黏膜結構的保護作用

對照組草魚在整個實驗期間未見發(fā)病癥狀, 腸黏膜結構完整, 上皮層的淋巴細胞數(shù)量適度; 絨毛排列整齊(圖 1A、1D)。

圖 1 枯草芽孢桿菌對草魚腸黏膜結構的影響(200×)Fig.1 Effects of B.subtilis on intestinal mucosal structure of C.idellus (200×)

Ah組在第1至第2天腸道黏膜上皮杯狀細胞增多, 固有層可見出血; 第3天腸道解剖可見發(fā)紅, 切片可見黏膜上皮細胞變性, 壞死、空泡化, 并可見脫落, 黏膜層內可見大量炎性細胞浸潤, 腸絨毛縮短變粗(圖 1B); 第5天魚體兩側、鰭基有輕度充血,解剖可見腸壁紅腫, 切片可見腸黏膜損傷程度大,腸道黏膜上皮細胞大量脫落, 杯狀細胞增多, 腸腔內可見較多脫落的上皮細胞碎片和黏液, 固有層出血、水腫, 黏膜層內見大量炎性細胞浸潤(圖 1E);第6天后上述病變有所好轉, 但仍可見黏膜上皮細胞脫落和炎癥。

Ah+Bs組在第1至第2天腸道黏膜上皮杯狀細胞增多, 固有層可見出血; 與Ah組相比, 第3和第5天腸道解剖可見輕度發(fā)紅, 切片可見黏膜上皮細胞脫落、炎癥等癥狀明顯減輕, 第3天腸絨毛的基部可見輕微脫落現(xiàn)象, 固有層有少量出血(圖 1C), 第5天腸絨毛的頂端和基部可見輕微脫落(1F); 與Ah組相比, 第7天黏膜上皮細胞脫落、炎癥等癥狀也有明顯改善。

2.2 益生芽孢桿菌對草魚腸上皮細胞緊密連接與超微結構的保護作用

在透射電鏡下, 腸上皮緊密連接結構為一條黑色的致密電子帶, 起始于上皮頂端, 從絨毛根部向基底層延伸。對照組緊密連接結構整齊, 中間沒有縫隙; 微絨毛密集且排列整齊, 可見微絨毛內有絲狀的微絲束, 微絲束向胞質內延伸(圖 2A); 腸上皮細胞核圓形或橢圓形, 核膜清晰; 胞漿內有較多的線粒體及內質網(wǎng)等, 線粒體為圓桿狀, 嵴清晰(圖 2D)。

Ah組(第4天)緊密連接結構嚴重受損, 縫隙明顯變寬; 微絨毛萎縮變短, 稀疏, 排列紊亂; 微絨毛內的微絲束不清晰(圖 2B); 腸上皮細胞核固縮, 體積變小有些甚至萎縮; 線粒體可見明顯腫脹、嵴減少, 內質網(wǎng)明顯擴張, 溶酶體增多(圖 2E); 出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。

Ah+Bs組(第4天)緊密連接結構損傷程度較小,縫隙明顯變窄; 微絨毛數(shù)量多且排列較整齊(圖 2C);線粒體數(shù)量增多, 結構完整, 無明顯腫脹(圖 2F)。

2.3 益生芽孢桿菌對腸上皮細胞微絲骨架的影響

在熒光顯微鏡下, 細胞核在紫外的激發(fā)下為藍光, 微絲則為綠光。對照組腸上皮細胞中的微絲發(fā)出均勻的綠色熒光, 且熒光強度比較強(圖 3A)。

Ah組部分腸上皮細胞中的微絲呈現(xiàn)綠色霧狀, 尤其是在腸上皮細胞紋狀緣處比較明顯, 微絲斑點分布于細胞核周圍, 第1至第4天腸上皮細胞中的微絲熒光強度逐漸減弱, 且第4天微絲熒光強度最弱, 明顯低于對照組(圖 3B); 第5天微絲熒光強度比第4天有所增強, 第6—7天微絲熒光強度較第5天略有減弱。

Ah+Bs組第1至第4天腸上皮細胞中的微絲熒光強度逐漸減弱, 第4天微絲熒光強度較Ah組略有增強(圖 3C), 第6至第7天微絲熒光強度逐漸增強,均高于Ah組。

圖 2 枯草芽孢桿菌對草魚腸上皮細胞超微結構的影響(5000×)Fig.2 Effects of B.subtilis on ultrastructure of intestinal epithelial cells of C.idellus (5000×)

圖 3 枯草桿菌對草魚腸上皮細胞微絲骨架的影響(200×)Fig.3 Effects of B.subtilis on microfilament of intestinal epithelial cells of C.idellus (200×)

3 討論

腸上皮的正常結構不僅是營養(yǎng)物質被充分消化吸收的基本保證, 也是發(fā)揮屏障功能和黏膜免疫反應的結構基礎[11,12]。本實驗給草魚口灌嗜水氣單胞菌后, 可見腸道有充血, 組織病理變化以腸上皮細胞變性、壞死, 出現(xiàn)不同程度的脫落現(xiàn)象為主,同時黏膜層內可見大量炎性細胞浸潤和出血現(xiàn)象,這與相關的報道相似[13—15]。

芽孢桿菌能促進水生動物腸道的生長發(fā)育, 提高水生動物腸壁厚度、腸黏膜高度, 促使腸黏膜皺褶增多, 陷窩變深, 微絨毛長且密集, 腸道的吸收面積加大[6]; 但言研究枯草芽孢桿菌JS01對熒光假單胞菌感染鯉消化系統(tǒng)的變化, 結果發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能改善感染鯉腸道發(fā)育, 腸總長、腸長指數(shù)和中腸皺褶高度顯著提高, 從而提高感染鯉的消化和吸收能力[16]。給新生仔豬分別口灌枯草芽孢桿菌菌液、豬源乳酸桿菌菌液及這兩種菌混合菌液, 并進行大腸埃希菌K88的攻毒實驗, 結果表明這兩種益生菌對腸道絨毛的發(fā)育起到了促進作用, 并能有效地拮抗大腸埃希菌K88對仔豬腸道上皮的損傷, 攻毒后的仔豬腸上皮形態(tài)結構基本正常, 沒有炎性細胞浸潤[17]。在本實驗中, 補充一定劑量的枯草芽孢桿菌后, 感染嗜水氣單胞菌的草魚腸黏膜損傷程度有較大改善, 黏膜上皮細胞脫落、炎癥和出血現(xiàn)象均有所減輕, 說明枯草芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌造成的腸黏膜結構損傷有一定的修復作用, 對維持腸道的正常形態(tài)起到了重要的作用。

在本實驗中, 感染嗜水氣單胞菌的草魚腸道超微結構變化為緊密連接縫隙明顯變寬, 微絨毛萎縮變短、稀疏、排列紊亂, 線粒體可見明顯腫脹、嵴減少, 內質網(wǎng)明顯擴張等, 這些病理變化與該菌感染香魚后的病理變化相似[18]。有研究表明, 乳桿菌能抑制致病性大腸桿菌對小鼠腸上皮細胞的損傷,維持腸上皮細胞結構完整和細胞間連接正常, 減輕微絨毛水腫現(xiàn)象, 細胞器無明顯異常[19]; 患有結腸炎的大鼠經金雙歧益生菌治療后, 其腸上皮細胞的破壞得到很大恢復, 緊密連接結構及排列有明顯改善[20]; 植物乳桿菌能改善急性胰腺炎引起的大鼠腸黏膜損傷, 維持腸上皮緊密連接結構的正常, 減少微絨毛的脫失[21]。本實驗也得到了相似的結果, 給草魚口灌枯草芽孢桿菌后, 緊密連接縫隙明顯變窄,微絨毛數(shù)量多且排列較整齊, 表明枯草芽孢桿菌能有效地修復緊密連接結構和微絨毛形態(tài)。

微絲由肌動蛋白分子螺旋狀聚合成, 正常生理狀態(tài)下微絲在細胞質中成束狀平行排列或疏散呈網(wǎng)狀分布, 在細胞變形運動、肌肉收縮、有絲分裂、胞內物質運輸?shù)然顒又杏兄夭豢缮俚淖饔肹22]。病原菌侵入時通常將細胞骨架作為主要的攻擊目標, 尤其利用微絲做為跳板入侵宿主細胞并進行擴散和繁殖[23]。有研究報道, 嗜水氣單胞菌對宿主細胞的侵襲過程首先是細菌通過其表面的黏附素與細胞表面受體發(fā)生作用, 接著就觸發(fā)細胞中微絲微管的重排等一系列信號轉導級聯(lián)反應, 從而使細菌進入細胞內繁殖并產生胞外產物, 損害細胞[24]。在沙門氏菌與宿主細胞的接觸面, 微絲會進行重排,從而使細胞膜發(fā)生皺縮, 有利于吞噬外面的細菌[25,26]。在本實驗中嗜水氣單胞菌感染后的腸上皮細胞中的微絲也發(fā)生了不同程度的解聚, 與上述結果類似。同時, 枯草芽孢桿菌能拮抗鼠傷寒沙門氏菌和產腸毒素大腸桿菌對Caco-2細胞中微絲的重排[27];乳酸菌可減輕侵襲性大腸桿菌感染Caco-2細胞后的TJ結構受損, F-actin的表達明顯增多[28]; 乳桿菌能夠抑制致病性大腸桿菌引起的腸上皮細胞微絲骨架的重排, 少量微絲骨架F-actin呈點狀分布[19]。在本實驗中枯草芽孢桿菌能抑制嗜水氣單胞菌對腸上皮細胞中微絲的破壞, Ah+Bs組腸上皮細胞中的微絲熒光強度較Ah組有所增強, 說明枯草芽孢桿菌對嗜水氣單胞菌造成的腸上皮細胞中微絲的解聚起到了一定的修復作用。

微絲的解聚與重組和微絨毛的形態(tài)、腸上皮細胞間的緊密連接之間存在著結構和功能的關系。微絲的活動能促使一定量的胞質進出于微絨毛而有利于對物質的吸收[29]。在本實驗中, 感染草魚腸上皮細胞紋狀緣處的微絲呈現(xiàn)綠色霧狀尤為明顯, 這與透射電鏡圖中看到的嗜水氣單胞菌引起微絨毛中的微絲結構不清晰甚至消失的結果是一致的。由于失去內部支撐和定型的骨架, 大量指狀的微絨毛可能因此松馳呈萎縮狀或空泡狀, 也可能是細胞在病原菌作用下發(fā)生水腫引起, 或者是兩者共同作用的結果[30]。緊密連接(TJ)是腸上皮細胞間主要的連接方式, 能夠維持上皮細胞極性及調節(jié)腸屏障的通透性。TJ膜內部分與肌動蛋白絲和肌球蛋白組成的近連接環(huán)直接相連[31,32]。近連接環(huán)能夠控制細胞膜的收縮, 肌球蛋白的收縮可以對緊密連接膜內部分產生離心性的牽引, 進而調節(jié)緊密連接的滲透性[33]。在本實驗中, 感染嗜水氣單胞菌的草魚腸上皮細胞中的微絲熒光強度逐漸減弱, 而口灌枯草芽孢桿菌后腸上皮細胞中的微絲熒光強度有所增強, 這與透射電鏡圖中看到的腸上皮細胞間緊密連接縫隙的變化結果相符。

綜上所述, 在感染嗜水氣單胞菌后, 草魚腸道黏膜形態(tài)和腸上皮細胞微絲骨架會遭到一定程度的損傷, 口灌一定劑量枯草芽孢桿菌后, 腸黏膜損傷程度有較大改善, 說明枯草芽孢桿菌可修復嗜水氣單胞菌造成的腸黏膜結構損傷, 對維持腸道的正常形態(tài)與功能起到了重要的作用。

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THE PROTECTIVE EFFECT OF PROBIOTIC BACILLUS ON THE INTESTINAL MUCOSAL STRUCTURE OF CTENOPHARYNGODON IDELLUS

HUANG Can1, ZHANG Zhong-Hai1, WU Shu-Qin2, ZHANG Ding1, LI Si-Si1, CHEN Xiao-Xuan1and WU Zhi-Xin1
(1.Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Hubei Provincial Engineering Laboratory for Pond Aquaculture, Fisheries College of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2.Pearl River Fisheries Research Institute, CAFS, Guangzhou 510380, China)

To study the protective effect of probiotics on the intestinal mucosal structure of C.idellus, the protective role of Bacillus subtilis on the intestinal mucosal structure damage by Aeromonas hydrophila infection in C.idellus were randomly divided into three groups: ① The control group: each fish was firstly orally administrated with 0.2 mL of aseptic phosphate buffer solution, and then orally administrated with 0.1 mL of aseptic Phosphate Buffer solution at day 2 and 4; ② The Ah group: each fish was firstly orally administrated with 0.2 mL of isotonic saline suspension containing A.hydrophila (1.0×107cfu/mL), and then orally administrated with 0.1 mL of aseptic phosphate buffer solution at day 2 and 4; ③ The Ah+Bs group: each fish was firstly orally administrated with 0.2 mL of isotonic saline suspension containing A.hydrophila, and then orally administrated with 0.1 mL of isotonic saline suspension containing B.subtilis (1.0×107cfu/mL) at day 2 and 4.Middle portion of midgut were collected every day for 7 days to observe intestinal mucous morphology and microfilament cytoskeleton of epithelial cells of C.idellus.The results showed that the pathological characters in the Ah group mainly included degeneration, necrosis and shedding of the intestinal epithelial cells, hemorrhage, edema and thicker of the lamina propria.A large number of inflammatory cells were infiltrated and gap of TJ widened obviously.Microvilli became short, sparse and disorder.Mitochondria became obviously swollen and crest reduced, and endoplasmic reticulum expanded.Microfilament of intestinal epithelial cells appeared green vaporous, and the fluorescence intensity of microfilament gradually weakened, which were significantly lower than that in the control group.The B.subtilis reduced damages of intestinal mucosal, including intestinal mucosa slightly shed; hemorrhage and inflammation phenomenon significantly reduced; Gap of TJ obviously narrowed; the number of microvilli increased; the microvilli arranged regularly; mitochondria had no obvious swelling.The fluorescence intensity of microfilament in the Ah+Bs group was higher than that in the Ah group.The results indicated that B.subtilis reduce the structural damage of intestinal mucosal by A.hydrophila infection.

Probiotic Bacillus subtilis; Aeromonas hydrophila; Ctenopharyngodon idellus; Intestinal mucosal; Microfilament cytoskeleton

S963.73

A

1000-3207(2017)04-0774-07

10.7541/2017.96

2016-07-25;

2016-11-26

國家自然科學基金(31472310)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31472310)]

黃燦(1991—), 女, 湖北黃岡人; 碩士研究生; 主要研究方向為魚類病理與免疫。E-mail: 15927649685@163.com

吳志新(1962—), 女, 湖北武漢人; 教授; 主要從事魚類病理與免疫。E-mail: wuzhixin@mail.hzau.edu.cn