宗華，秦杰，李紅春，朱立元

（廣東省深圳市第三人民醫(yī)院普外科，廣東 深圳 518000）

胃癌中高表達的CBX7對細(xì)胞遷移、侵襲的影響

宗華，秦杰，李紅春，朱立元

（廣東省深圳市第三人民醫(yī)院普外科，廣東 深圳 518000）

目的探究人胃癌組織中染色盒同源物7（CBX7）的表達及對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。方法收集2013年1月1日-2015年1月1日間于該院普通外科行手術(shù)切除的45例胃癌及對應(yīng)癌旁組織，免疫組織化學(xué)染色觀察CBX7蛋白表達，分析胃癌組織中CBX7蛋白表達高低與腫瘤臨床特征的關(guān)系。通過重組質(zhì)粒在胃癌SGC-7901細(xì)胞中過表達CBX7，經(jīng)Transwell小室實驗確定CBX7過表達對胃癌細(xì)胞遷移侵襲的作用。結(jié)果CBX7在胃癌組織中表達較癌旁組織下降（=3.517，=0.000），胃癌組織低表達CBX7與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.829，=0.022）及高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期，χ2=4.465，=0.047）相關(guān)。過表達CBX7對SGC-7901的遷移（=42.040，=0.000）及侵襲（=40.119，=0.000）具有顯著的削弱作用。結(jié)論CBX7在胃癌組織中表達降低，過表達CBX7能夠通過抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲發(fā)揮抗腫瘤作用。

CBX7；胃癌；遷移；侵襲

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性疾病，幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生的主要危險因素之一[1]。由于胃癌早期僅有腹痛、納差等非特異性表現(xiàn)，許多患者就診時已失去根治性手術(shù)機會。目前，生物靶向診斷及治療被認(rèn)為是改善胃癌患者預(yù)后的重要方法之一。

染色盒同源物7（chromobox homolog 7，CBX7）是黑腹果蠅的異染色質(zhì)蛋白在人類細(xì)胞中的同源物，定位于人染色體22q13.1上，共有6個外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)主要分布于細(xì)胞核的染色質(zhì)當(dāng)中，通過與染色質(zhì)的結(jié)合而發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能[2]。但CBX7在胃癌中的表達及其生物學(xué)功能尚不完全清楚。

本研究在胃癌組織中檢測了CBX7的表達，并探究CBX7表達與腫瘤臨床特征間的相關(guān)性。利用基因重組技術(shù)過表達胃癌SGC-7901細(xì)胞中的CBX7，檢測過表達CBX7后細(xì)胞遷移與侵襲的變化。旨在為CBX7成為胃癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物及治療靶點提供一定的研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料和試劑

本研究共收集在2013年1月1日-2015年1月1日行手術(shù)切除的胃癌及對應(yīng)癌旁組織45例。其中男性31例，女性14例；年齡在47～65歲之間，中位年齡53歲。所有入組患者均簽署研究知情同意書。切取組織標(biāo)本于4%多聚甲醛溶液中保存。Trizol試劑及轉(zhuǎn)染試劑均購自美國英威捷公司。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。CBX7正向引物（5'-CCTGCTTCCTGGTCAC TTTC-3'；反向引物5'-CAG GGAGCTGGCTCACTA CA-3'）及β-actin正向引物（5'-CTCCATCCTGGCC TCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGT TCC-3'）引物由北京天根生物科技有限公司合成。SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒由北京中杉金橋公司提供?；趐EX-1（pGCMV/MCS/EGFP/Neo）真核表達載體（貨號：C05001）的CBX7過表達質(zhì)粒由上海吉瑪生物科技有限公司合成提供，以空載體質(zhì)粒為對照質(zhì)粒。CBX7及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，人胃癌SGC-7901細(xì)胞由廣東省深圳市第三人民醫(yī)院實驗室保存，Transwell小室購自美國康寧公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋的組織切片首先脫蠟、水化，進而行高壓抗原修復(fù)。通過3%雙氧水H2O2滅活內(nèi)源性氧化物酶，10%血清封閉；以1×PBS溶液配制1∶100兔抗人CBX7抗體工作液充分覆蓋組織切片；4℃孵育一抗過夜，次日洗去多余一抗，并滴加相應(yīng)物種二抗工作液；洗凈多余二抗后用HRP-BIO復(fù)合物，反應(yīng)后使用DAB進行顯色。每張切片在×400放大下隨機選取10個視野觀察陽性表達細(xì)胞數(shù)量，按0分，<5%；1分，6%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%及4分，>75%的方法計分[3]。以每張切片的平均得分為最終得分。

1.2.2 qRT-PCR檢測按試劑說明書采用氯仿-苯酚抽提法提取SGC-7901細(xì)胞總RNA。定量500 ng細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄說明書配置逆轉(zhuǎn)錄體系，采用42℃孵育15 min后95℃孵育30 min之步驟合成cDNA。取2μl cDNA為模板，按說明書配制qPCR反應(yīng)體系，使用Bio-Rad Real-time PCR擴增儀進行PCR擴增CBX7及β-actin。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞在含10%FBS的1×DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2、3代。按過夜增殖至愈合度達70%之密度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×PBS溶液充分洗滌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分組：CBX7組加入2 500 ng/孔CBX7質(zhì)粒及5μl轉(zhuǎn)染試劑；對照組加入2 500 ng/孔陰性對照質(zhì)粒及5μl轉(zhuǎn)染試劑。添加DMEM培養(yǎng)液至終體積2 ml/孔。6 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 Western blot檢測提取轉(zhuǎn)染72 h后的SGC-7901細(xì)胞總蛋白。垂直電泳分離蛋白后以70V恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；以1∶1 000稀釋的CBX7抗體及β-actin抗體4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，ECL法發(fā)光觀察蛋白表達。

1.2.5 Transwell小室檢測按1∶8比例采用DMEM培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠后，100μl/孔包被Transwell小室膜的上室面制成包膠小室來檢測細(xì)胞侵襲；采用未包膠小室來檢測細(xì)胞遷移。取轉(zhuǎn)染72 h后的SGC-7901細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×105個/ml，上層小室每室加入250μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽擦凈上室面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室面細(xì)胞，Giemsa染液染色。100倍光鏡下隨機選擇10個視野計數(shù)下室面的細(xì)胞個數(shù)。以每個小室的平均細(xì)胞數(shù)為最終計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，配對檢驗分析CBX7在患者標(biāo)本中的表達，成組檢驗分析其余計量資料。χ2檢驗分析計數(shù)資料。<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中CBX7的表達

通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)CBX7蛋白主要定位于胃癌細(xì)胞及正常胃腺細(xì)胞的細(xì)胞核中（見圖1），以胃癌組織中CBX7免疫組織化學(xué)染色評分的均值為界，45例胃癌組織可劃分為CBX7低表達組（=33）及高表達組（=12）。對兩類組織中CBX7免疫組織化學(xué)評分進行統(tǒng)計學(xué)分析表明胃癌組織中CBX7蛋白的表達低于癌旁組織（1.24±0.31）vs（3.52±0.47），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=3.517，=0.000）。

2.2 CBX7在胃癌的臨床意義

針對不同CBX7表達量的兩組患者進行統(tǒng)計分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.829，=0.022）及高TNM分期（III+IV期，χ2=4.465，=0.047）等顯示腫瘤惡性程度較高的病理特征較多出現(xiàn)在CBX7低表達的胃癌組織中。見附表。

2.3 過表達CBX7抑制SGC-7901細(xì)胞遷移及侵襲

圖1 CBX7在胃癌及癌旁組織中的表達（×400）

圖2 過表達CBX7對SGC-7901遷移及侵襲的影響

向SGC-7901細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染入重組CBX7過表達質(zhì)粒后，過表達CBX7后胃癌細(xì)胞內(nèi)CBX7 mRNA（=37.028，=0.000，見圖2A）和蛋白（=39.156，=0.000，見圖2B）的表達都明顯提高。過表達CBX7后采用Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn)CBX7組遷移細(xì)胞數(shù)量（74.201±5.592 vs 35.374±5.217），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=42.040，=0.000），侵襲細(xì)胞數(shù)量（38.188±7.171 vs 16.224±3.113），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=40.119，=0.000），說明CBX7對細(xì)胞遷移及侵襲能力具有負(fù)向調(diào)控作用（見圖2C）。

附表CBX7表達與GC患者臨床病理特征的關(guān)系例

3 討論

CBX7屬于多梳蛋白家族，其在哺乳動物大腦、心臟、腎臟及骨骼肌中均有表達以維持正常組織的生長發(fā)育[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CBX7在腫瘤中具有多種生物學(xué)功能，可以通過下調(diào)INK4α/ARF信號通路而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5]，作為MIR-9[6]及MIR-375[7]等多種microRNA的靶基因而對細(xì)胞侵襲發(fā)揮調(diào)控作用，還能夠促進腫瘤干細(xì)胞增殖和自我更新[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，CBX7低表達于胃癌組織中。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期也較多的出現(xiàn)在CBX7低表達患者中，提示CBX7可能通過下調(diào)胃癌細(xì)胞侵襲而促進腫瘤發(fā)展。陳敏等[9]在甲狀腺乳頭樣癌中的研究也表明CBX7在腫瘤中的表達下調(diào)，說明CBX7的異常表達可能對腫瘤早期診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究通過基因重組技術(shù)提高了胃癌SGC-7901細(xì)胞中CBX7的表達，同時SGC-7901細(xì)胞的遷移及侵襲在過表達CBX7后也明顯下調(diào)。上皮細(xì)胞間質(zhì)化改變是影響細(xì)胞遷移及侵襲能力的重要機制之一[10]，KARAMITOPOULOU等[11]在胰腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，在組織學(xué)分化越差的胰腺癌組織中CBX7表達量越低，在胰腺癌細(xì)胞中過表達CBX7也可以提高E-cadherin的表達。預(yù)后分析還提示，低CBX7表達的胰腺癌患者生存期明顯縮短。

綜上所述，CBX7的低表達在人類惡性腫瘤中具有一定的普遍性，且CBX7能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，是一種潛在的生物治療靶點。

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（張蕾編輯）

CBX7 expression in human gastric cancer and its role in cell migration and invasion

Hua Zong,Jie Qin,Hong-chun Li,Li-yuan Zhu
(Department of General Surgery,the Third People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518000,China)

ObjectiveTo study the expression of chromobox homolog 7(CBX7)in human gastric carcinoma and its role in cell migration and invasion.MethodsImmunohistochemical method was applied to detect the expression of CBX7 in gastric cancer and matched tumor-adjacent tissues of 45 patients.The correlations between CBX7 expression and clinical features were analyzed by Pearson chi-square test.Recombinant CBX7 plasmid was used to over-express CBX7 in SGC-7901 cells.The effect of CBX7 on cell migration and invasion was measured by Transwell assay.ResultsThe expression of CBX7 was significantly down-regulated in the gastric cancer tissues,and the low expression of CBX7 was associated with lymphatic metastasis and advanced TNM stage(stageⅢandⅣ)(<0.05).Over-expression of CBX7 inhibited the migration and invasion of SGC-7901 cells(<0.05).ConclusionsCBX7 expression is decreased in gastric cancer tissues.Up-regulation of CBX7 expression could play an anti-cancer role through inhibition of cell migration and invasion.

CBX7;gastric cancer;migration;invasion

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.008

1005-8982（2017）16-0040-04

R735.2；

A

2016-11-21