張佳，黃漢，張斌，王志紅

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，遼寧 錦州 121002）

基礎(chǔ)研究·論著

姜黃素通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程對口腔鱗癌細胞株HN4侵襲轉(zhuǎn)移的影響*

張佳1，黃漢2，張斌2，王志紅1

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，遼寧 錦州 121002）

目的旨在探討姜黃素對口腔鱗癌細胞株HN4的增殖、侵襲和凋亡效應(yīng)及其分子機制。方法0～60μmol/L姜黃素作用于口腔鱗癌細胞株HN4，24 h后應(yīng)用MTT法檢測細胞的生長活性；劃痕實驗檢測細胞遷移作用；Transwell實驗測定對細胞的侵襲作用；流式細胞儀檢測細胞凋亡；Western blot測定P53、E-cadherin和Snail蛋白表達水平。結(jié)果MTT檢測結(jié)果顯示各濃度姜黃素對癌細胞生長有抑制，其中，20μmol/L姜黃素有明顯抑制。隨著姜黃素濃度的增加，對細胞凋亡有明顯作用。姜黃素處理后細胞周期生長阻滯于G0/G1期。Snail的蛋白表達量隨著姜黃素的濃度增加而減少。P53和E-cadherin的表達量隨著姜黃素的濃度增加而增加。結(jié)論姜黃素能顯著抑制口腔鱗癌細胞株HN4的體外生長，上調(diào)P53蛋白表達誘導(dǎo)細胞凋亡可能是其作用機制之一。

姜黃素；口腔鱗癌；凋亡

口腔癌為頭頸部最常見的惡性腫瘤，其治療方法以手術(shù)治療為主，治療后往往會使患者喪失許多重要的功能，包括面容改變、進食障礙、言語不清和吞咽困難等，極大地危害患者的生活質(zhì)量[1]。口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）為最常見的口腔癌，約占口腔惡性腫瘤的90%，每年大約有30萬例新增病例報道，近3年的報道顯示，其5年的生存率大約為50%[2]，使其防治逐漸成為研究熱點。

姜黃素（Curcumin）是姜黃的主要有效成分,姜黃是姜科植物的根莖[3]。作為一種傳統(tǒng)中藥，有許多方面的藥理特性，包括有抗炎、抗凝、抗阿爾茨海默病、抗病毒和抗腫瘤等[4]。姜黃素的抗腫瘤作用日益引起人們的重視，已成為研究腫瘤防治的研究熱點。本文旨在研究討論姜黃素誘導(dǎo)口腔鱗癌細胞HN4的增殖調(diào)亡及通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程抑制其侵襲作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口腔鱗癌細胞株HN4由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重點實驗室提供。

1.1.2 主要藥物改良型RPMI-1640培養(yǎng)基[Hy-Clone，賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司]；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技有限公司）；雙抗含100μg/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素（HyClone，美國）；胰酶（HyClone，美國）；姜黃素（Sigma）。

1.1.3 主要實驗設(shè)備及儀器超凈工作臺（SW-CJ-1F，北京凈化設(shè)備廠）；二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；倒置顯微鏡（Olympus,日本）；低速離心機（BYL-LDS-19A，北京醫(yī)用離心機廠）；EPICS XL型流式細胞儀（美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)口腔鱗癌細胞株HN4復(fù)蘇后，在改良型RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，內(nèi)含有10%小牛血清、100μg/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。加入5%CO2、37℃飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測細胞活性取對數(shù)生長期的口腔鱗癌細胞HN4，接種到96孔板中，每孔100μl培養(yǎng)基，將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，各孔加入姜黃素，使其濃度為0、5、10、20、30和60μmol/L，設(shè)置空白孔，孔內(nèi)只加PBS緩沖液，每組濃度設(shè)置4個副孔。

1.2.3 劃痕實驗先用記號筆在6孔板的背面畫標志線，細胞鋪板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待第2天細胞鋪滿，劃痕。用PBS洗細胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。拍照。Image J軟件進行結(jié)果分析。

1.2.4 Transwell實驗將凝膠鋪于培養(yǎng)小室濾膜上，每孔20μl，37℃過夜。在膜的另面涂上纖維黏連蛋白。把約1×105個/ml細胞200μl加入到小室內(nèi)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，擦去膜上層細胞，將膜取下。封片觀察。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡分別收集對照組、姜黃素組作用24 h的HN4細胞，離心管內(nèi)收細胞，離心，1 000 r/min，每次5 min，棄上清。用2 ml PBS清洗1次；離心。棄上清，依照凋亡試劑盒說明書操作，上機檢測。記錄所得數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowjo軟件處理分析。

1.2.6 siRNA轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細胞株HN4實驗分組：空白對照組、20μmol/L姜黃素處理組、P53-siRNA組、p53-siRNA和20μmol/L姜黃素處理組。將口腔鱗癌細胞株HN4調(diào)至5×104個，96孔板中鋪板。24 h細胞長至80%時，LipofectAMINE 2000進行轉(zhuǎn)染。36 h后提蛋白進行Western blot實驗。

1.2.7 Western blot用0、5、10和20μmol/L濃度姜黃素處理口腔鱗癌細胞HN4 24 h后，提取蛋白，電泳，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)移到PVDF膜（美國MiLLipore公司）上，封閉后順序加一抗（1∶1 000）4℃過夜，二抗（1∶5 000）孵育1 h，進行雜交，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國MiLLipore公司）檢測雜交信號。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1姜黃素對口腔鱗癌細胞HN4增殖的影響

不同濃度的姜黃素作用下口腔鱗癌細胞HN4的光密度（OD）值見表1。隨著姜黃素濃度的增加，表現(xiàn)出對口腔鱗癌細胞HN4的抑制作用增強。

2.2 不同濃度姜黃素對口腔鱗癌HN4細胞的遷移作用

0、5、10和20μmol/L濃度的姜黃素對口腔鱗癌細胞HN4的侵襲作用見圖1，24 h后所得劃痕區(qū)面積分別為（3.64±0.37）、（4.83±0.47）、（5.17±0.63）和（8.02±0.06）μm2，5、10和20μmol/L濃度姜黃素的劃痕區(qū)面積與0μmol/L濃度姜黃素劃痕區(qū)面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=6.701、18.491和288.873，=0.021、0.018和0.000）。24 h后姜黃素表現(xiàn)出了抑制細胞侵襲的作用。

2.3 不同濃度姜黃素口腔鱗癌HN4細胞侵襲作用的影響

0、5、10和20μmol/L濃度的姜黃素口腔鱗癌HN4細胞穿膜細胞數(shù)分別為（166.62±10.05）、（125.50±11.90）、（90.85±22.02）和（63.88±8.90）個，5、10和20μmol/L濃度姜黃素的穿膜細胞數(shù)與0μmol/L濃度穿膜細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=36.859、103.142和397.808，=0.021、0.008和0.000）。結(jié)果顯示，姜黃素作用24 h后可以明顯抑制口腔鱗癌HN4細胞侵襲力，并且存在濃度依賴性。

2.4 姜黃素對口腔鱗癌細胞HN4周期及凋亡的影響

隨著姜黃素濃度的增加，對細胞周期的分布有明顯的作用，劑量5、10和20μmol/L的姜黃素組對細胞周期的影響尤為顯著。不同濃度的姜黃素作用于口腔鱗癌細胞HN4，細胞在G0/G1、S和G2/M期的比例見表2。實驗表明，姜黃素處理的細胞可觀察到細胞周期生長阻滯于G0/G1期。

不同濃度的姜黃素對口腔鱗癌細胞HN4凋亡的影響見圖2，流式細胞儀分析結(jié)果顯示，姜黃素處理細胞24 h后，隨著姜黃素濃度的增加，口腔鱗癌細胞HN4的凋亡比例明顯增加。

表1 不同濃度和不同時間姜黃素HN4細胞的OD值（=5s）

表1 不同濃度和不同時間姜黃素HN4細胞的OD值（=5s）

注：?與0μmol/L組相比，<0.05

姜黃素作用時間72 h 0μmol/L0.776±0.043 48 h0.414±0.0200.612±0.029 5μmol/L0.565±0.01924 h0.192±0.008?0.191±0.013 10μmol/L0.176±0.006?0.121±0.011?0.321±0.015?20μmol/L0.163±0.010?0.065±0.011?0.117±0.016?30μmol/L0.079±0.014?0.025±0.007?0.035±0.005?60μmol/L0.024±0.007?0.011±0.005?0.025±0.006?

表2 不同濃度姜黃素對口腔鱗癌細胞株HN4周期的影響（=3±s）

表2 不同濃度姜黃素對口腔鱗癌細胞株HN4周期的影響（=3±s）

注：?0μmol/L組相比，<0.05

姜黃素G0/G1SG2/M 0μmol/L41.78±2.1348.41±2.989.81±0.51 5μmol/L46.10±3.77?42.90±1.2711.00±1.29?10μmol/L51.04±2.58?39.06±3.15?9.90±0.74 20μmol/L61.97±1.67?31.89±1.09?6.14±1.49?

圖1 不同濃度姜黃素對口腔鱗癌細胞HN4遷移的影響

圖2 不同濃度姜黃素對口腔鱗癌細胞株HN4凋亡的影響

2.5 姜黃素對P53、E-cadherin、Snail和β-actin表達量的影響

按照0、5、10和20μmol/L的濃度給藥后24 h，Western blot結(jié)果表明，P53和E-cadherin的蛋白表達量隨著姜黃素的濃度增加而增加，Snail蛋白的表達量逐漸減少。見圖3。

2.6 P53-siRNA轉(zhuǎn)染口腔鱗狀細胞HN4對P53、E-cadherin和Snail蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，姜黃素組與空白對照組比較E-cadherin表達是增加的，與以上實驗相符。P53-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中P53表達降低，而加入姜黃素后，E-cadherin的表達反而減少。見圖4。

圖3 姜黃素處理后的口腔鱗癌細胞HN4細胞中P53、E-cadherin和Snail蛋白表達情況

圖4 siRNA轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細胞HN4細胞中P53、E-cadherin和Snail蛋白表達情況

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是口腔常見惡性腫瘤之一，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。在我國，姜黃素廣泛應(yīng)用于不同的臨床治療中，也有大量文獻表明姜黃素通過不同的機制參與抑制多腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，影響細胞周期，從而促進細胞凋亡，減少腫瘤細胞的數(shù)目。本文研究表明：姜黃素能降低口腔鱗癌細胞株HN4的生長，并且此作用與姜黃素的劑量以及作用時間相關(guān)。姜黃素抑制口腔鱗癌細胞株HN4的生長與E-cadherin和P53蛋白的上調(diào)以及Snail蛋白的表達量減小相關(guān)，為今后進一步探討姜黃素抗口腔鱗癌細胞的增值與侵襲的機制研究提供實驗依據(jù)。

本實驗研究表明，姜黃素處理的細胞可觀察到，隨著姜黃素濃度的增加，G0/G1期細胞比例不過上升，而G2/M期細胞不過減少，S期細胞變化不大，說明細胞周期生長停滯于G0/G1期。這一結(jié)果與其他研究相符，都顯示姜黃素對細胞周期的影響，表現(xiàn)為不一致的阻滯作用。陳教文等[5]研究表明姜黃素抑制口腔舌癌細胞SCC-4的增殖和轉(zhuǎn)移，其機制可能是使基因表達水平降低，從而使細胞停留在細胞周期的M期，達到抗口腔鱗癌細胞增殖的作用。

P53是一種腫瘤抑制蛋白，調(diào)節(jié)各種各樣的基因的表達，參與細胞凋亡、生長抑制、抑制細胞周期進程、分化和加速DNA修復(fù)、基因毒性和細胞應(yīng)急后的衰老。有研究表明姜黃素誘導(dǎo)MCF-7細胞的凋亡伴隨著P53基因表達的上調(diào)，并進一步應(yīng)用P53基因缺陷型MDAH041細胞以及P53低表達及高表達TR9-7細胞進行研究，提出姜黃素誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡依賴于P53基因相關(guān)途徑[6]。提出姜黃素誘導(dǎo)基底細胞癌凋亡與P53相關(guān)信號途徑有關(guān)。

EMT是指上皮性的細胞，包括正常上皮和腫瘤上皮，表現(xiàn)出間質(zhì)細胞的特性，獲得了遷徙、運動能力，在胚胎發(fā)育和器官纖維化過程中有重要作用[7]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤EMT過程中，上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）等表達下調(diào)，間質(zhì)標志物波形蛋白、N型鈣黏蛋白（N-cadherin）等表達上調(diào)，表現(xiàn)為上皮源性的腫瘤細胞失去細胞極性，細胞間的連接變得疏松，胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重組。這一系列的改變導(dǎo)致腫瘤細胞的黏附能力下降，遷移運動能力增加，使得腫瘤細胞更易于離開原有位置，發(fā)生轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致腫瘤患者死亡[8]。近年來的研究表明，姜黃素能夠抑制多種惡性腫瘤的增殖，遷移和浸潤，包括頭頸部腫瘤[9-10]。大量實驗表明，EMT過程表現(xiàn)為上皮源性的腫瘤細胞腫瘤細胞的黏附能力下降，遷移運動能力增加，通過調(diào)節(jié)Twist和Snail的表達水平實現(xiàn)的。本次研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠誘導(dǎo)E-cadherin的表達調(diào)解EMT過程，抑制腫瘤的侵襲作用。

在姜黃素處理的HN4細胞中，E-cadherin和P53具有相同的變化趨勢。在P53-siRNA轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示，姜黃素組與空白對照組比較E-cadherin表達是增加的，P53-siRNA轉(zhuǎn)染細胞中P53表達降低，而加入姜黃素后，E-cadherin的表達反而減小。說明P53與E-cadherin的表達相關(guān)，P53可能在腫瘤細胞EMT過程中起到重要作用。KIM[11]和WU等[12]的研究表明，P53不僅在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，同時參與調(diào)解EMT重要過程。

在口腔腫瘤方向的眾多研究中表明，姜黃素抗癌機制不僅表現(xiàn)于抑制腫瘤細胞的增殖，還包括抗腫瘤周圍血管新生、抗氧化等作用[13]?？谇击[癌的發(fā)生、發(fā)展過程較為復(fù)雜，包括了多種基因參與調(diào)控。姜黃素抑制腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用較明確，機制較為復(fù)雜，值得廣泛研究，為口腔鱗癌的臨床治療及藥物研究提供參考。

[1]ZEIGHAMIAN V,DARABI M,AKBARZADEH A,et al.PNIPAAm-MAA nanoparticles as delivery vehicles for curcumin against MCF-7 breast cancer cells[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol,2016,44(2):735-742.

[2]CARRERAS T C,GAY E C.Techniques for early diagnosis of oral squamous cell carcinoma:Systematic review[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2015,20(3):305-315.

[3]嚴梅娣,岑雪英.姜黃素對甲狀腺癌細胞SW579增殖和凋亡的影響[J].中華全科醫(yī)學(xué),2015,13(3):396-401.

[4]劉紅艷,王海燕,葉松,等.姜黃素藥理作用及其機制研究進展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012(6):48-51.

[5]陳教文,湯亞玲,劉紅,等.姜黃素對口腔舌癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移能力影響的實驗研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011(1):83-86.

[6]CHOUDHURI T,PAL S,AGWARWAL M L,et al.Curcumin induces apoptosis in human breast cancer cells through p53-dependent Bax induction[J].FEBS Lett,2002,512(1/3):334-340.

[7]LEI Z,DE S F.Curcumin inhibits oral squamous cell carcinoma proliferation and invasion via EGFR signaling pathways[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(10):6438-6446.

[8]FAN C C,WANG T Y,CHENG Y A,et al.Expression of E-cadherin,Twist,and p53 and their prognostic value in patients with oral squamous cell carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2013,139(10):1735-1744.

[9]WILKEN R,VEENA M S,WANG M B,et al.Curcumin:a review of anti-cancer properties and therapeutic activity in head and neck squamous cell carcinoma[J].Mol Cancer,2011(10):12.

[10]GAO W,CHAN J Y,WEI W I,et al.Anti-cancer effects of curcumin on head and neck cancers[J].Anticancer Agents Med Chem,2012,12(9):1110-1116.

[11]KIM N H,KIM H S,LI X Y,et al.A p53/miRNA-34 axis regulates Snail1-dependent cancer cell epithelial-mesenchymal transition[J].J Cell Biol,2011(195):417-433.

[12]WU D W,LEE M C,WANG J,et al.DDX3 loss by p53 inactivation promotes tumor malignancy via the MDM2/Slug/E-cadherin pathway and poor patient outcome in non-small-cell lung cancer[J].Oncogene,2014,33(12):1515-1526.

[13]BAHARUDDIN P,SATAR N,FAKIRUDDIN K S,et al.Curcumin improves the efficacy of cisplatin by targeting cancer stem-like cells through p21 and cyclin D1-mediated tumour cell inhibition in non-small cell lung cancer cell lines[J].Oncol Rep,2016,35(1):13-25.

（張西倩編輯）

Effect of curcumin on invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma HN4 cell line by EMT*

Jia Zhang1,Han Huang2,Bin Zhang2,Zhi-hong Wang1
(1.Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121001,China;2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou,Liaoning 121002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma HN4 cell line and the molecular mechanism.MethodsOral squamous cell carcinoma HN4 cells were cultured and treated with 0-60 μmol/L curcumin,and MTT was used to assess the cell viability after 24 hours.Wound scratch assay was performed to detect the invasion of the HN4 cells.Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry.The protein expression levels of p53,E-cadherin and Snail were detected by Western blot.ResultsMTT assay revealed that curcumin significantly inhibited the growth of the cancer cells at the experimental concentrations,the effect was more obvious at the concentration of 20 μmol/L.With the increase of curcumin concentration,the effect on cell apoptosis was getting more significant.The HN4 cells were arrested at G0/G1phase after treatment.With the increase of curcumin concentration,the expression of Snail protein decreased,and the expressions of p53 and E-cadherin increased.ConclusionsCurcumin can significantly inhibit the growth of oral squamous cell carcinoma HN4 cell line,and the mechanism may be up-regulation of p53 expression.

curcumin;oral squamous cell carcinoma;apoptosis

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.001

1005-8982（2017）16-0001-05

R739.81

A

2016-12-15

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金資助項目（No：2015020333）

黃漢，E-mail：kq2015525@163.com；Tel：0416-4197262