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小鼠11β-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用

2017-08-16 11:47:39辛婧葉磊楊可沈亞非鄧飛
關(guān)鍵詞:細(xì)胞株質(zhì)粒測(cè)序

辛婧,葉磊,楊可,沈亞非,鄧飛

[1.河南省漯河市中心醫(yī)院(漯河市醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院)內(nèi)分泌科,河南 漯河 462000;2.河南省漯河市召陵區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 漯河 462000]

辛婧1,葉磊2,楊可1,沈亞非1,鄧飛1

[1.河南省漯河市中心醫(yī)院(漯河市醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院)內(nèi)分泌科,河南 漯河 462000;2.河南省漯河市召陵區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河南 漯河 462000]

目的構(gòu)建小鼠11β-羥類(lèi)固醇脫氫酶基因的慢病毒真核表達(dá)載體PLJM1-11β-HSD1-GFP,建立小鼠前體脂肪細(xì)胞(3T3-L1)高表達(dá)基因的穩(wěn)定感染細(xì)胞株,為基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從小鼠肝臟cDNA中擴(kuò)增11β-HSD1開(kāi)放閱讀框ORF,構(gòu)建針對(duì)基因的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌株,抽提質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序鑒定。用測(cè)序成功的質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,產(chǎn)生慢病毒并轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞。根據(jù)綠色熒光效率挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株,通過(guò)Western blot鑒定PLJM1-11β-HSD1-GFP轉(zhuǎn)染成功。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序驗(yàn)證,PLJM1-11β-HSD1-GFP真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,并包裝慢病毒,綠色熒光效率90%以上,并利用其慢病毒懸液成功感染3T3-L1細(xì)胞,篩選出的穩(wěn)定感染細(xì)胞株的3T3-L1細(xì)胞成功高表達(dá)11β-HSD1蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建了基因的真核表達(dá)載體,并建立高表達(dá)的穩(wěn)定感染細(xì)胞株P(guān)LJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1,為進(jìn)一步研究基因的功能,特別是在肥胖中的研究奠定了基礎(chǔ)。

基因;真核表達(dá)載體;前體脂肪細(xì)胞;肥胖

11β-羥類(lèi)固醇脫氫酶(11beta-hydroxysteriod dehydrogenase,11β-HSD1)在體內(nèi)廣泛分布,表達(dá)于脂肪、肝臟、肌肉、性腺及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等,以脂肪組織和肝臟中的含量最高[1]。它是糖皮質(zhì)激素的代謝酶,有重要的生物學(xué)活性,有還原酶與氧化酶的雙重作用,但以還原酶作用為主,需要煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)參與,有活化糖皮質(zhì)激素的作用,可以使人體無(wú)活性的可的松(動(dòng)物的皮質(zhì)酮)轉(zhuǎn)化為有活性的氫化可的松(皮質(zhì)醇)[2]。資料顯示,11β-HSD1的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示內(nèi)臟脂肪組織肥厚;在代謝綜合征患者脂肪庫(kù)中細(xì)胞內(nèi)11β-HSD1的活性是普遍增加的[3]。這可能與糖皮質(zhì)激素能增加脂肪細(xì)胞內(nèi)合成代謝有關(guān),而11β-HSD1主要使糖皮質(zhì)激素活化,提示其可能與向心性肥胖、胰島素抵抗及糖尿病有關(guān)[4]。本研究擬構(gòu)建基因的真核表達(dá)載體,并建立高表達(dá)該基因的穩(wěn)定感染細(xì)胞株,以進(jìn)一步研究該基因與肥胖、胰島素抵抗及糖脂代謝相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

PolyATtract_Series9600TMmRNA Isolation System試劑盒、末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)、逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)及Taq DNA聚合酶均購(gòu)自美國(guó)Promega公司,焦碳酸二乙酯(DEPC)及ExpandTMTemplate PCR System購(gòu)自日本TaKaRa公司,DH5α菌株及PLJM1-NRG1-GFP載體由南京醫(yī)科大學(xué)分子遺傳研究室李建民教授饋贈(zèng),Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株、293T細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所,DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清購(gòu)自南京生興公司,3-異丁基-1-甲基磺嘌呤(MIX)、胰島素及地塞米松購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,11β-HSD1兔源抗體購(gòu)自美國(guó)Research Genetics公司,二抗羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶及β-actin抗體購(gòu)自武漢生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank登錄號(hào)NM_008288 mRNA序列設(shè)計(jì)引物,由上海華大基因科技有限公司合成。正向引物:GGGGCTAGCGGATCCGCCACC ATGGCAGTTATGAAAAATTACC;反向引物:GGGG AATTCCTCGAGCCTAGTTACTTACAAACATGTCC。正向引物酶切位點(diǎn)為,反向引物酶切位點(diǎn)為擴(kuò)增目的片段大小881 bp。

1.2.2 小鼠肝臟總RNA的抽提用PolyAT-tract_Series9600TMmRNA Isolation System試劑盒提取BABL/C 8周的小鼠肝臟組織總RNA,提取2μl經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性,并用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定260 nm、280 nm波長(zhǎng)下的光密度(OD)值,并檢測(cè)總RNA的純度,其余RNA于-70℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增目的基因取2μg mRNA加入PrimeSriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中,42℃孵育90 min,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,結(jié)束后加入RNAase H內(nèi)切酶,37℃孵育30 min,降解RNA。以上述小鼠的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段。PCR的反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,94℃30 s,54℃30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72℃10 min,4℃2 min,獲取小鼠基因全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框ORF。

1.2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒PLJM-11β-HSD1-GFP制備以上述小鼠3T3-L1細(xì)胞的cDNA為模板,相應(yīng)引物擴(kuò)增11β-HSD1全長(zhǎng)ORF,用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit純化靶DNA片段。將純化后的PCR產(chǎn)物行雙酶切。對(duì)酶切后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠行電泳檢測(cè)。并在切膠儀上切下目的片段。用Ultra-Sep Gel Extraction Kit(OMEGA)純化切膠產(chǎn)物。將酶切純化后的目的片段11β-HSD1連接至PLJM1-NRG1(NheI/EcoRI)載體(10μl體系:目的片段2μl,載體1μl,2×Ligase buffer 5μl,T4連接酶1μl,ddH2O 1μl;條件22℃1 h)。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株,在氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的LB固體平板上生長(zhǎng)過(guò)夜(37°孵箱16~18 h)。在過(guò)夜后的固體平板上挑取5個(gè)單克隆,分別加至Amp抗性的5 ml LB培養(yǎng)基里搖菌過(guò)夜并做好標(biāo)記,次日以菌液為模板,以11β-HSD1-F/R為引物作PCR并行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對(duì)獲取的陽(yáng)性克隆進(jìn)行保種,同時(shí)經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,以CMV-F和11β-HSD1-R為測(cè)序引物并送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列分析應(yīng)用NCBI網(wǎng)站BLAST分析軟件,對(duì)上述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì),鑒定PLJM1-11β-HSD1-GFP載體多克隆位點(diǎn)區(qū)表達(dá)序列的可靠性和準(zhǔn)確性。

1.2.6 PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1慢病毒細(xì)胞株的構(gòu)建用中抽試劑盒抽取質(zhì)粒PLJM1-11β-HSD1-GFP及空載對(duì)照質(zhì)粒PLJM.1,保證OD值1.8~1.9,濃度在1 000μg/ml以上。轉(zhuǎn)染前24 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞鋪6 cm培養(yǎng)皿,2×106~4×106個(gè)/皿。轉(zhuǎn)染體系如下:質(zhì)粒PLJM1-11β-HSD1-GFP(或空載對(duì)照質(zhì)粒PLJM.1)4μg,包裝質(zhì)粒PVSVG 2μg,delta 8.91 3μg,與Lipofectamine 2000 20μl混合共同孵育形成復(fù)合物,然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h換液3 ml,并用熒光顯微鏡觀察拍照。轉(zhuǎn)染后48和72 h收集包裝產(chǎn)生的病毒上清,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后加入polybrene(Millipore),使終濃度為10μg/ml。感染前24 h將3T3-L1細(xì)胞接種至6 cm培養(yǎng)皿,使感染前細(xì)胞密度為10%~20%。24 h后棄去培養(yǎng)液,用上述病毒上清3 ml感染靶細(xì)胞,37℃培養(yǎng)6 h后換液加入3 ml完全培養(yǎng)液DMEM。感染48 h后觀察熒光表達(dá)情況。根據(jù)熒光效率挑單克隆篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,并進(jìn)行冷凍保存。

1.2.7 Western blot檢測(cè)分別提取正常3T3-L1細(xì)胞、高表達(dá)11β-HSD1的3T3-L1及轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的3T3-L1細(xì)胞的總蛋白質(zhì),用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,制備14.7%分離膠和5%濃縮膠,60 V穩(wěn)壓電泳;半干轉(zhuǎn)膜,封閉,按Western blot檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。一抗為11β-HSD1多克隆抗體(抗體濃度為1∶200),二抗為羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶,(抗體濃度為1∶800),用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法分別檢測(cè)3組細(xì)胞株的11β-HSD1蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所得的Western blot條帶經(jīng)Photoshop軟件處理,在Bandscan分析軟件中測(cè)得各自總度值,采用自身β-actin灰度值校正并進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel數(shù)據(jù)庫(kù)用Excel軟件進(jìn)行作圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理,計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用配對(duì)檢驗(yàn),<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠11β-HSD1 ORF片段擴(kuò)增及載體克隆

以小鼠肝臟cDNA為模板,用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到小鼠11β-HSD1 ORF片段,目的片段為881 bp(見(jiàn)圖1)。

2.2 PLJM1-11β-HSD1-GFP重組載體的鑒定

以正向引物與反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用Promega PCR純化試劑盒進(jìn)行純化,酶切產(chǎn)物(見(jiàn)圖2)行切膠純化,將純化后產(chǎn)物連接至PLJM1-NRG1-GFP載體。隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性克隆,行PCR鑒定(見(jiàn)圖3),獲取的陽(yáng)性克隆經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA測(cè)序(見(jiàn)圖4),測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析確認(rèn)無(wú)任何突變、插入等異常,慢病毒載體PLJM1-11β-HSD1-GFP構(gòu)建成功(見(jiàn)圖5)。

2.3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

圖1 小鼠11β-1基因ORF擴(kuò)增片段

圖2 小鼠11β-1基因PCR酶切產(chǎn)物

圖3 小鼠11β-基因ORF片段單克隆PCR結(jié)果

慢病毒載體PLJM1-11β-HSD1-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡拍照見(jiàn)圖6,綠色熒光效率90%以上。

2.4 收取病毒上清感染3T3-L1細(xì)胞

收取293T細(xì)胞病毒上清感染3T3-L1細(xì)胞,48 h后熒光顯微鏡拍照結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.53 T3-L1單克隆細(xì)胞株綠色熒光蛋白的表達(dá)

根據(jù)熒光情況挑單克隆并篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞株,3T3-L1單克隆細(xì)胞株綠色熒光蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖8。

圖4 PLJM1-11β-HSD1-GFP質(zhì)粒測(cè)序圖

圖5 PLJM1-11β-HSD1-GFP質(zhì)粒序列比對(duì)圖

圖6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)(熒光顯微鏡×100)

圖7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)(熒光顯微鏡×100)

2.6PLJM1-11β-HSD1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞蛋白水平驗(yàn)證

分別提取3T3-L1、PLJM1-3T3-L1及PLJM1-11β HSD1-GFP-3T3-L1細(xì)胞組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果提示PLJM1-11βHSD1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1組11β-HSD1蛋白表達(dá)水平明顯升高,見(jiàn)圖9。

圖83 T3-L1單克隆細(xì)胞株綠色熒光蛋白的表達(dá)(熒光顯微鏡×100)

圖9 各組細(xì)胞11β-HSD1蛋白表達(dá)情況

3 討論

11β-HSD1作為一種微線(xiàn)粒體酶,主要負(fù)責(zé)有活性與無(wú)活性的糖皮質(zhì)激素之間的互相轉(zhuǎn)化,通過(guò)控制底物即糖皮質(zhì)激素的利用率,從而調(diào)控組織特異性糖皮質(zhì)激素受體的活性[5-6]。11β-HSD有2種同工酶。其中11β-HSD2是輔酶Ⅰ(NAD)依賴(lài)性脫氫酶,主要使活性的可的松變?yōu)闊o(wú)活性的氫化可的松。主要作用于鹽皮質(zhì)激素敏感的靶組織如腎臟,結(jié)腸,唾液腺,胎盤(pán)等[7]。11β-HSD1直到最近才被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為是重要的生物酶,是還原型輔酶Ⅱ(NADPH)依賴(lài)性的還原酶,與11β-HSD2作用相反,主要負(fù)責(zé)將無(wú)活性的氫化可的松轉(zhuǎn)化為有活性的可的松[8]。它廣泛分布于各組織,主要分布于肝臟、脂肪、性腺、腦、脈管系統(tǒng)等,這些組織則以糖皮質(zhì)激素受體占優(yōu)勢(shì)。研究表明,11β-HSD1調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體與配體的結(jié)合,參與了庫(kù)欣綜合征相似的疾病的發(fā)生發(fā)展,如向心性肥胖、糖尿病、多囊卵巢綜合征以及癡呆[9-10]。

慢病毒(Lentivirus)載體是以人類(lèi)免疫缺陷病毒-1(HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體[11]。攜帶有目的基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒及細(xì)胞系的輔助下,經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒,通過(guò)感染細(xì)胞或組織,實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞中得到長(zhǎng)期而穩(wěn)定的表達(dá)[12]。經(jīng)過(guò)改建后的慢病毒載體能夠容納約10 kb左右的外源基因,因此大多數(shù)的cDNA都能夠被克隆入慢病毒載體。293T細(xì)胞由293細(xì)胞派生,屬人腎上皮細(xì)胞系,作為包裝細(xì)胞,在包裝后產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒,同時(shí)表達(dá)目的基因。

本文利用慢病毒載體技術(shù)成功構(gòu)建了帶有GFP目的基因HSD1的慢病毒載體PLJM1-HSD1-GFP,同時(shí)建立了3T3-L1穩(wěn)定感染細(xì)胞株P(guān)LJM1-HSD1-GFP-3T3-L1,為進(jìn)一步研究HSD1的生物學(xué)功能奠定了必要的基礎(chǔ)。

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(張蕾編輯)

Construction and role of mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid

Jing Xin1,Lei Ye2,Ke Yang1,Ya-fei Shen1,Fei Deng1
(1.Department of Endocrinology,Luohe Central Hospital,Luohe,Henan 462000,China;2.Department of Neurology,the People's Hospital of Shaoling District,Luohe,Henan 462000,China)

ObjectiveTo construct a lentiviral vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP and establish a stable cell line of 3T3-L1 with high expression of mousegene,and lay the foundation for the research ofgene.MethodsOpen reading frame(ORF)fragment of mouse tissues by RT-PCR,then inserted into the PLJM1-NRG1-GFP vector and transformed into competent DH5α strain ofThe plasmid was extracted and used for sequencing.The successfully-sequenced plasmid PLJM1-11β-HSD1-GFP and the packaging plasmid were transfected to 293T cell line to produce recombinant lentivirus.3T3-L1 cell line was transfected by recombinant virus and the stable cell line was isolated by selecting the single clone with GFP,and high expression of 11β-HSD1 was identified by Western blot.ResultsThe eukaryotic expression vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP was constructed and confirmed by DNA sequencing.The lentivirus vector ofnamed PLJM1-11β-HSD1-GFP was successfully constructed and the virus was packaged in 293T cells.3T3-L1 cells were transfected by recombinant virus and the stable cell line was selected by green fluorescence efficiency,which showed that the lentivirus vector transfection rate was over 90%.A dramatically elevated protein level of 11β-HSDl was expressed in the positive clones of 3T3-L1 cells compared with the control group.Conclusions Mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid has been successfully constructed.The 3T3-L1 cellsgene was amplified from mouse livertransfected by PLJM1-11β-HSD1-GFP could effectively elevate the expression ofgene,and can be used in the functional researches of mousegene,especially those related to obesity.

gene;eukaryotic expression vector;3T3-L1 cell;obesity

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.003

1005-8982(2017)16-0012-06

Q782

A

2016-11-28

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