張麗萍+沈亞婷

摘 要 采用原位微區(qū)X射線熒光分析法（In-situ micro-X-ray fluorescence spectrometry， μ-XRF）和分步提取技術， 研究了苜蓿幼苗中Cu原位微區(qū)分布特征及其根莖葉中Cu的不同結合形態(tài)。結果表明， 苜蓿根部富集Cu濃度高達12.06 mg/g， 是莖的8倍， 葉的4.9倍。微區(qū)分布結果表明， 過量Cu暴露下的苜蓿根部是富集Cu的主要部位， 且在根莖交界處存在Cu的阻隔屏障， 以減輕過量Cu對地上部分的毒害作用。過量Cu（大于50 μmol/L時）還抑制了苜蓿對Zn和Ca的向上吸收， 增強了苜蓿對Fe的吸收， 但對K和Mn的吸收影響不明顯。亞細胞分步提取結果表明， 根細胞中主要通過形成難溶的殘渣態(tài)（41%）和細胞壁螯合態(tài)（20%）實現(xiàn)對過量Cu的固定； 而在莖中則以疏水蛋白質結合態(tài)、細胞壁結合態(tài)、殘渣態(tài)、水溶態(tài)等4種形式存在， 以進一步減少過量Cu向葉中輸送； 在葉中， 進入葉細胞的過量Cu主要以液泡區(qū)隔和難溶殘渣態(tài)形式存在， 以實現(xiàn)對Cu的耐受和解毒。

關鍵詞 紫花苜蓿； 銅； 植物分步提??； 原位微區(qū)X射線熒光分析法； 形態(tài)

1 引 言

我國銅礦儲量豐富， 隨著對Cu需求量日益增加， 銅礦的大規(guī)模開采使得我國很多地區(qū)土壤中的Cu含量超標[1，2]， 典型工業(yè)區(qū)Cu的超標率甚至高達97%[3]。Cu是生物體必需的微量元素， 是生命過程中許多酶的固有組成成分之一， 在生物體中多以有機復合物形式（如金屬蛋白等）存在， 參與催化生物系統(tǒng)中涉及氧的電子傳遞和氧化還原反應[4]。但過量的Cu會影響人類造血功能， 導致人體肝硬化、運動和知覺神經障礙等[5]。Cu進入土壤后的賦存狀態(tài)相對長期穩(wěn)定， 易通過食物鏈進入人體， 嚴重危害人類健康[6，7]， 因此， 使用綠色環(huán)保、成本低廉的植物重金屬修復技術， 降低污染土壤中的重金屬含量， 成為研究的熱點。

紫花苜蓿是一種分布廣泛的豆科牧草， 具有較好的Cu耐受性和富集性， 對Cu污染土壤具有較好的植物修復前景。眾多學者在Cu暴露下紫花苜蓿對Cu的積累量及其生理生化特征變化等方面已開展了大量研究[8～14]。丁克強等[10]發(fā)現(xiàn)， 100 μg/g Cu土培60天時苜蓿根中積累28.71 μg/g Cu， 是莖的3倍； 王文星等[11]的研究顯示， 400 μg/g Cu盆栽30天， 根部積累量為地上部的26倍。過量Cu顯著增加苜蓿體內ROS水平， 導致脂質過氧化[12]， 抑制苜蓿光合作用和呼吸作用[13]。在高濃度Cu脅迫下， 紫花苜蓿體內能產生復雜的耐受解毒機制。超過10 μmol/L Cu處理下就會引發(fā)苜蓿葉片中抗氧化機制， 在不同濃度的Cu脅迫下， 傅里葉變換紅外光譜分析顯示， 紫花苜蓿根中有機酸含量先降后升； 莖的生理生化特征變化不明顯； 高濃度處理時， 葉中的可溶性糖和可溶性蛋白濃度等先升后降[14]。關于Cu在苜蓿內的轉運及耐受機制方面的研究尚不全面， 細胞內小分子有機酸、氨基酸和金屬硫蛋白等物質螯合過量Cu形成低毒性物質， 或進行轉運區(qū)隔處理， 以減少細胞質中自由Cu2+濃度， 降低毒害作用。Wang等[15]對Cd應激下兩種紫花苜蓿提取， 發(fā)現(xiàn)都產生了MT2a-和MT2b-兩大類金屬硫蛋白。在高濃度Pb處理下， 進入苜蓿根表皮細胞中的Pb有63%儲存在液泡中[16]。Printz等[17]的研究表明， Cu在苜蓿莖中優(yōu)先與煙草胺結合以阻斷Cu的向上遷移。在30～100 μmol/L Cu處理時， 苜蓿中主要的生物巰基化合物（hGSH、Cys和GSH）總量下降， 但各物種比例維持不變， 未檢測到PC [9]； 對紫花苜蓿莖部的Cu進行微區(qū)定位， 發(fā)現(xiàn)Cu沉積在莖的形成層。紫花苜蓿對Cu的吸收、富集和解毒的機理尚需進一步探索。

原位微區(qū)X射線熒光分析法（Micro-X-ray fluorescence spectrometry， μ-XRF）可以獲得元素納米-微米尺度的空間分布特征和元素相關性數(shù)據(jù)， 揭示元素在樣品中的動態(tài)分布過程和生物代謝機理[18，19]。開展Cu在紫花苜蓿體內的原位無損微區(qū)分布和結合形態(tài)的特征研究是研究苜蓿對Cu轉運區(qū)隔的關鍵。本研究采用μ-XRF技術和分步提取方法， 揭示過量Cu暴露下紫花苜蓿中Cu在器官和組織水平的分布特征， 以及在不同器官和組織中Cu的形態(tài)特征， 從而進一步探究紫花苜蓿對Cu積累、轉運的微觀過程， 揭示其對Cu的耐受機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

原位微區(qū)X射線熒光光譜儀（μ-XRF， 國家地質實驗測試中心自主研發(fā)）； NexION 300型電感耦合等離子體質譜（ICP-MS， 美國Perkin Elmer公司）； LRH-GSI智能型人工氣候箱（韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司）； KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器； HR/T20M HR/T16M臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

北方六級苜蓿種子（上海春茵草坪技術有限公司）； CuSO4·5H2O（分析純， 天津市光復科技有限公司）； HNO3（BV-Ⅲ級）、HCl（優(yōu)級純）和H2O2（MOS級）均購自北京化學試劑研究所； 崩潰酶（Sigma公司）； 三羥甲基氨基甲烷（Tris， 優(yōu)級純， 北京化學試劑公司）； 十二烷基硫酸鈉 （SDS， 化學純， 國藥集團化學試劑有限公司）； CH3COONH4（分析純， 國藥集團化學試劑有限公司）； Hoagland培養(yǎng)液配制使用的溶質有：KH2PO4、ZnSO4·7H2O、Na2-EDTA、FeSO4·7H2O、Ca（NO3）2·4H2O和H2MoO4（分析純， 國藥集團化學試劑有限公司）； KNO3（分析純， 北京紅星化工廠）； MgSO4·7H2O、H3BO3和MnCl2·4H2O CuSO4·5H2O（分析純， 天津市光復科技有限公司）。

2.2 植物培養(yǎng)

選取顆粒大小一致的紫花苜蓿種子， 置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中， 并置于光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)（溫度25℃、相對濕度50%， 光照強度4000 Lx， 光照時間16 h）。待長出一對子葉時， 置于Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周左右。至長出第二片真葉時， 選取長勢一致的植株， 移苗至浮標上， 在不同濃度梯度的Cu溶液中暴露一周。每個濃度下設3組重復， 每組19棵苗。收獲的植株分為地下部分（根）和地上部分（莖葉）， 用水清洗多次后， 用去離子水和超純水分別清洗3次， 40 ℃干燥10 h后測干重， 分析Cu對苜蓿生長情況和生物量的影響。

用同樣培養(yǎng)方法在1000 μmol/L Cu溶液中培養(yǎng)紫花苜蓿一周后收獲， 分根莖葉進行不同器官Cu濃度總量分析和Cu不同結合形態(tài)的分步提取實驗。另培養(yǎng)少數(shù)苜蓿， 發(fā)芽后立即用浮標移入Cu溶液（0、50和1000 μmol/L）中培養(yǎng)一周， 用于μ-XRF分析。

2.3 苜蓿根莖葉中Cu濃度測定

干燥后樣品使用密閉高壓釜在HNO3-H2O2體系中以150℃高溫消解10 h。消解液經定容、稀釋、過濾（0.45 μm濾膜）后， 采用ICP-MS測試Cu含量。使用的標準物質有GSB-1（大米）、GSB-3（玉米）和GSB-7（茶葉）。

2.4 苜蓿根莖葉中Cu的結合形態(tài)分布提取與分析

收獲的植物鮮樣干燥兩天后， 用液氮（

Symbolm@@ 196℃）打破細胞壁后， 研磨成均質粉末。取50 mg于離心管中， 逐步用1 mL萃取液在超聲池中（超聲功率100%， 頻率40 kHZ， 溫度22℃）按以下順序依次提取[20]：（1）10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）用于提取細胞質和液泡中水溶性的Cu； （2）含2%崩潰酶的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）用于提取細胞壁中的Cu； （3）含1% SDS（十二烷基硫酸鈉）的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）用于提取疏水蛋白質結合的Cu； （4）10 mmol/L CH3COONH4（pH 4.6）用于提取小分子有機酸結合的Cu； （5）過濾， 檢測濾后殘渣中的Cu。每步萃取時間1 h， 萃取液冰浴10 min后， 4℃、15000 r/min高速冷凍離心15 min， 取上清液在相同條件下再次離心。所得四步的提取液用0.45 μm濾膜過濾， 在4℃放置片刻消除泡沫后， 用ICP-MS測定提取液中的Cu含量， 最后一步所得殘渣經HNO3-H2O2消解后， 再用ICP-MS測定Cu含量。

2.5 苜蓿幼苗中Cu的原位微區(qū)分布測定

用原位微區(qū)X射線熒光光譜儀（μ-XRF）[21]分別對3種不同Cu濃度暴露下的苜蓿幼苗進行原位微區(qū)掃描， 通過毛細管聚焦技術將X射線聚焦成微束級別， 激發(fā)樣品后得到樣品中的元素特征X射線， 并使用Si漂移探測器探測熒光信號， 以實現(xiàn)對樣品微小區(qū)域的元素相對含量信息的分析[22]。儀器最小光斑可達18 μm， 用于譜峰識別的單點采譜時間為60 s。用于樣品微區(qū)掃描的參數(shù)設定為：電壓47.0 kV， 電流0.799 mA， 步長80 μm（1000 μmol/L Cu的幼苗采譜步長為50 μm）， 每點采譜時間為5 s。

3 結果與討論

3.1 Cu脅迫對苜蓿生長情況的影響

隨著Cu濃度遞增， 苜蓿生長受到的脅迫也逐漸增加。在50 μmol/L Cu培養(yǎng)下， 苜蓿開始出現(xiàn)部分植株矮小， 葉片萎黃， 側根減少等現(xiàn)象。植物葉片變黃是受重金屬脅迫下葉綠體被破壞、光催化反應受損的典型癥狀[23]。Printz等[17]發(fā)現(xiàn)， 0.30 ～3.0 μmol/L Cu是紫花苜蓿最佳生長條件， Cu濃度超過3.0 μmol/L， 苜蓿開始產生毒害效應； 10 μmol/L Cu暴露下就可觀察到葉片變黃的現(xiàn)象； 在1000 μmol/L Cu暴露下， 紫花苜蓿幾乎沒有側根發(fā)育， 且其主根較空白組變得細軟輕飄， 但并未致死， 表現(xiàn)出紫花苜蓿對Cu的良好耐性。

Cu的脅迫不僅影響植物葉片生理狀態(tài)， 還影響植物的生物量（圖1）。苜蓿干重隨Cu濃度的增加呈先下降后升高隨后維持相對穩(wěn)定的特征。苜蓿地上部變化曲線與總量基本相同的現(xiàn)象與紫花苜蓿總生物量的變化主要受地上部生物量的變化影響的報道一致[24]。50 μmol/L Cu暴露下， 苜蓿整體生物量顯著下降了31.4%， 表明50 μmol/L Cu很大程度上抑制了苜蓿的生長和新陳代謝。但在50～1000 μmol/L Cu脅迫期間， 苜蓿干重呈回升趨勢， 并維持平穩(wěn)。由此推測， 可能在超過50 μmol/L Cu脅迫時苜蓿體內開始形成某種Cu的特殊耐受機制， 抵制了重金屬的進一步毒害作用， 以維持其相對正常的生長。

3.2 苜蓿對Cu的吸收富集能力

苜蓿對Cu有較強的積累能力， 其根部是積累富集Cu的主要場所， 減少了Cu對苜蓿地上部各器官的毒害[8]。由表1可見， 1000 μmol/L Cu中培養(yǎng)1周后的紫花苜蓿各器官中Cu積累量為根>葉>莖。結果顯示苜蓿根部是主要積累Cu的部位， 其積累量達到12.1 mg/g， 積累濃度是莖的8倍， 葉的4.9倍。苜蓿表現(xiàn)出對銅的高度富集能力。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)100 μmol/L Cu溶液培養(yǎng)7天后， 苜蓿中Cu含量即達到4.42 mg/g； Flores-Caceres[9]實驗發(fā)現(xiàn)半水培15天后的苜蓿在100 μmol/L Cu溶液培養(yǎng)7天后， 其根中Cu積累量為410 μg/g， 是嫩枝的19倍、空白組的5倍。以上實驗結論與本實驗相近， 都顯示紫花苜蓿具有高Cu耐受性， 且主要在根中積累解毒， 其次在葉和莖中少量積累以減少毒害效應。

3.3 苜蓿中Cu的原位微區(qū)分布

毒性元素侵害植物主要有葉、莖和根3條途徑， 其中根是最主要的途徑[25]。μ-XRF是研究元素微區(qū)分布特征的重要手段， 因此， 本研究采用μ-XRF研究苜蓿對Cu的吸收。剛發(fā)芽的紫花苜蓿幼苗用浮標分別移入3個不同濃度梯度的Cu暴露液中， 7天后植株的生長狀態(tài)如圖2所示， 50 μmol/L Cu中暴露7天的苜蓿幼苗與空白組均已生長出真葉， 1000 μmol/L Cu培養(yǎng)7天后明顯抑制了植物真葉的生長， 取樣時仍為無真葉的子葉狀態(tài)。

由于根中Cu含量最高， 故將50 μmol/L Cu暴露下的苜蓿根進行μ-XRF單點能譜分析， 確認感興趣區(qū)的圈定范圍及元素特征譜線識別， 由圖3可見， 苜蓿根中顯示了明顯的CuKα特征峰。

苜蓿中的微區(qū)分布信息（圖4）顯示， 過量Cu脅迫時， 苜蓿根部富集大量Cu?？瞻捉M反映了Cu作為紫花苜蓿必需營養(yǎng)元素吸收和輸送時的分布狀態(tài)， 即根莖葉中的Cu含量相當， 且存在明顯的Cu連續(xù)分布區(qū)域， 地上部子葉邊緣處Cu含量也較多。50和1000 μmol/L Cu暴露下的苜蓿均表現(xiàn)出根尖向上濃度逐漸增加， 在根與莖的交接處達到Cu積累峰值的特征， 而苜蓿莖葉中Cu含量相對較少。表明受Cu脅迫的苜蓿主要通過根部富集， 且在根與莖的交界處形成屏障， 實現(xiàn)抑制過量Cu向上運輸， 從而減輕了對地上部分的毒害。

過量Cu不僅影響植物本身的Cu輸送和代謝平衡， 還影響了植物對其它元素的吸收。本研究表明， Cu過量明顯抑制苜蓿對Zn和Ca的向上輸送， 但增加了植株對Fe的吸收， 而對K和Mn的吸收的影響不明顯。 不同植物物種對Fe和Zn的吸收受Cu脅迫的影響并不一致， 但過量Cu會破壞Ca2+從植物根向莖的傳輸[26]。K+由于在植物中以離子態(tài)存在且具有較強移動性[27]， 因而受Cu脅迫的影響不大。

3.4 紫花苜蓿細胞中Cu的結合形態(tài)特征

苜蓿各器官中Cu的結合形態(tài)是了解其耐受和解毒機理的關鍵。根莖葉分步提取結果（圖5）表明， 苜蓿根部顯著富集大量的Cu， 抑制其向地上部遷移， 減緩了重金屬對地上部的毒害作用， 這與前面的結論一致。 在各個器官中Cu結合形態(tài)存在差異， 根中Cu在殘渣態(tài)中含量最高， 細胞壁結合態(tài)、水溶態(tài)和蛋白質結合態(tài)次之， 且含量相當； 莖中Cu在4種結合態(tài)中的含量差異不大； 葉中Cu在水溶態(tài)和殘渣態(tài)中含量最高， 其次分別是細胞壁結合態(tài)和蛋白質結合態(tài)。根莖葉中有機酸結合態(tài)的Cu含量均為最少， 說明小分子有機酸在紫花苜蓿對Cu耐性作用中不發(fā)揮主要作用。

植物根中細胞壁以及胞間層是吸收重金屬的主要場所[17]， 細胞質[28]、細胞質膜和根中小囊泡[29]能區(qū)隔存儲重金屬。實驗數(shù)據(jù)顯示根部主要的解毒方式為將Cu轉化為殘渣態(tài)， 從而與生命代謝過程相對隔離； 莖里主要為細胞間質和液泡中儲存的水溶態(tài)Cu， 多余的Cu也可以在莖中形成細胞壁結合態(tài)； 葉中過量的Cu部分主要存在于細胞間質和液泡中， 另一部分形成難溶的沉淀與生命代謝過程相對隔離。有研究者對Cd脅迫下的模式植物擬南芥用同樣方法進行分步提取[20]發(fā)現(xiàn)， 根中水溶態(tài)Cd比例最高（46%）， 葉中水溶態(tài)Cd含量最高（58%）， 這也顯示了不同植物種屬對元素的耐受性和解毒行為的差異。植物中Cu結合形態(tài)的分步提取技術提供了Cu在苜蓿各器官內的分布信息， 為揭示苜蓿對Cu吸收轉運機制提供了重要信息。

4 結 論

不同Cu濃度脅迫下苜蓿生長情況的實驗表明， 過量Cu會抑制植物生長， 但并不致死， 苜蓿表現(xiàn)出一定的重金屬Cu耐受性。原位微區(qū)和消解測定苜蓿各器官Cu濃度的實驗表明， 苜蓿主要在根部積累大量Cu， 減少向上運輸， 從而抵制Cu脅迫帶來危害。根部主要通過形成難溶的殘渣態(tài)和細胞壁螯合態(tài)實現(xiàn)對過量Cu的固定， 且大量儲存于根莖分界點處； 部分可以通過植株根莖分界處進入向上輸送過程的Cu， 在莖中進一步通過與細胞壁或疏水蛋白質結合， 形成殘渣態(tài)， 以水溶態(tài)形式停留于液泡， 降低向上輸送量； 葉中Cu主要區(qū)隔在液泡中， 形成難溶殘渣態(tài)儲存， 以降低毒性。過量的Cu明顯抑制了植物對Zn和Ca的向上吸收， 增強了Fe的吸收， 對K和Mn等元素的吸收影響較小。未來還需要借助多種形態(tài)分析手段深入探究Cu在苜蓿體內具體的結合形態(tài)、在根莖葉亞細胞中的分布及含量。

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