包 寒, 羅 靜, 時連鑫, 徐福建, 王樹濤

(1. 北京化工大學生物醫(yī)用材料北京實驗室, 北京 100029;2. 中國科學院理化技術研究所, 中國科學院仿生材料與界面科學重點實驗室, 北京 100190)

多糖及其衍生物作為一類天然高分子, 具有良好的生物相容性與可降解性能, 因此在生物材料領域具有廣泛的應用[1]. 海藻酸鈉、殼聚糖及纖維素等已被運用于藥物可控釋放[2]、組織工程骨架[3]或止血材料[4]等方面. 肝素(Heprin)由于具有高負電的特性[5], 可作為抗血栓藥物[6]; 透明質(zhì)酸(HA)作為高保水的多糖高分子, 在關節(jié)潤滑治療等方面具有一定的應用價值[7]. 因為富含羧基基團, 這兩種多糖易于化學改性及修飾其它功能單元, 可制備出具有特殊功能的多糖基材料. 例如, Xu等[8]通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)反應, 在肝素分子鏈上接枝陽離子聚合物, 負載基因后形成納米粒子用于腫瘤治療; Daveis等[9]通過席夫堿反應, 在透明質(zhì)酸上修飾藥物形成納米粒子, 實現(xiàn)酸響應藥物釋放; Tae等[10]通過在肝素上修飾巰基基團, 采用點擊化學反應制備水凝膠用于促進細胞生長; Ossipov等[11]在透明質(zhì)酸高分子上修飾雙膦酸鹽后用銀離子交聯(lián)制備了抗菌敷料. 對于介觀層面的微米級多糖凝膠, 一般采用乳液法[12,13]、注射法[14]及微流控法[15,16]制備, 但這些方法均存在所制備的微凝膠尺寸不均勻、難以形成非對稱形貌及制備效率低等問題. 因此, 如何制備尺寸均一且非球形的多糖凝膠微米顆粒是極大的挑戰(zhàn).

作為一種周期性重復的具有可控形狀的微結(jié)構(gòu), 微結(jié)構(gòu)陣列常被用作模板材料. 通過調(diào)控微結(jié)構(gòu)模板上的浸潤特性, 可以獲得多種形貌可控的陣列化器件. 近年來, 1D納米線陣列[17]、1D納米粒子組裝體[18]、陣列化晶體[19]及特殊形貌粒子[20]等微納體系的加工方式得到了廣泛的研究. 其中, 利用超疏水高黏附的微米級柱狀結(jié)構(gòu)基底黏附微液滴或產(chǎn)生液橋的方法[21～23], Jiang等[21,24]制備了尺寸可控的陣列化氯化鈉納米晶體及陣列化聚合物納米線等材料. 可見, 超疏水微米陣列模板法可為微米級多糖凝膠材料的制備提供新的機遇.

本文以超疏水微柱陣列硅基底為模板, 將巰基修飾后的肝素與透明質(zhì)酸的多糖預聚液滴加在微柱陣列基底表面, 使液滴在微柱頂端移動并黏附, 通過微液滴揮發(fā)和紫外交聯(lián), 制備了大面積尺寸均一的多糖基微凝膠(PsMH). 通過改變微柱直徑與凝膠預聚液濃度, 可以實現(xiàn)對微凝膠尺寸與形貌的調(diào)控. 采用不同材質(zhì)的微柱基底均得到了相同形貌的微凝膠, 表明該方法適用于多種基底, 具有較好的加工彈性. 這種形貌尺寸可控的微凝膠有望應用于藥物遞送及納米粒子載體等方面.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

肝素鈉, 分子量20000, 購于山東萬邦賽諾康生化制藥股份有限公司; 透明質(zhì)酸鈉, 分子量10000, 購于華熙福瑞達生物有限公司; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、半胱胺鹽酸鹽、二硫蘇糖醇(DTT)及2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(光引發(fā)劑Irgacure 2959), 購于安耐吉化學, 薩恩化學技術(上海)有限公司; 雙端丙烯酸酯基聚乙二醇(分子量3400, PEGDA3400)和1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷(PFOS)購于上海麥克林生化科技有限公司; 微米級柱狀結(jié)構(gòu)硅基底由北京大學微納中心制備.

FE20-K型梅特勒酸度計, 瑞士梅特勒托利多公司; UV-2600型紫外-可見(UV-Vis)分光光度計, 島津(香港)有限公司; HSX-UV型強紫外氙燈光源, 紫外光波長365 nm, 北京紐比特科技有限公司; SU8010型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM), 日立(中國)有限公司; Dimension Icon型原子力顯微鏡(AFM), 布魯克(北京)科技有限公司; OCA20型接觸角測試分析儀, 德國Dataphysics公司; DCAT11型表面張力儀, 德國Dataphysics公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 巰基修飾多糖高分子的制備 參照文獻[10,25]方法, 采用酰胺化方法制備巰基修飾的多糖(Ps-SH). 將600 mg肝素鈉和400 mg透明質(zhì)酸鈉作為多糖高分子(Ps)溶解于100 mL去離子水中(共含羧酸根2 mmol), 加入670 mg(3.5 mmol)EDC及472 mg(3.5 mmol)HOBt, 常溫攪拌30 min, 使HOBt充分溶解; 加入460 mg(4 mmol)半胱胺鹽酸鹽; 待溶液澄清透明后, 緩慢滴加0.1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液至pH= 6.8, 溶液澄清透明; 室溫攪拌約12 h后, 使用截留分子量為1000的透析袋, 在5 L去離子水中透析2 d, 每6 h換一次水; 透析結(jié)束后, 凍干得到粗產(chǎn)物. 將500 mg粗產(chǎn)物溶解于50 mL去離子水中, 加入600 mg DTT; 緩慢滴加0.01 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=7.5; 室溫反應3 h后使用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=3.5; 使用截留分子量1000的耐酸透析袋, 在5 L pH=3.5 的100 mmol/L的NaCl溶液中透析1 d, 每6 h更換透析液一次; 在pH= 3.5的鹽酸水溶液中透析1 d, 每6 h更換透析液一次; 透析結(jié)束后, 經(jīng)過冷凍干燥即得到巰基修飾的多糖高分子, 密封真空保存.

1.2.2 凝膠預聚液的配制 將Ps-SH和PEGDA3400按照巰基與雙鍵摩爾比1∶1溶解于光引發(fā)劑Irgacure 2959質(zhì)量分數(shù)為0.1%的去離子水中, 配制不同濃度凝膠預聚液. 以質(zhì)量分數(shù)為40%的凝膠預聚液為例, 將18 mg Ps-SH與22 mg PEGDA溶解于100 μL Irgacure 2959質(zhì)量分數(shù)為0.1%的去離子水中, 攪拌得到半透明偏白溶液; 隨著聚合物濃度降低, 溶液逐漸澄清透明.

1.2.3 超疏水微米陣列基底的構(gòu)建 參照文獻[16]方法制備超疏水微米陣列基底. 疏水微柱陣列硅基底由北京大學微納中心制備, 聚乙烯醇(PVA)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)基底則通過復型法制備[26], 微柱陣列基底的尺寸為1 cm2. 所有基底均通過氣相化學修飾方法, 使用PFOS對微柱陣列基底進行超疏水修飾, 將氧等離子處理后的微柱陣列基底和100 μL PFOS于80 ℃真空反應12 h, 得到超疏水微柱陣列基底. 用2 μL去離子水對微柱陣列進行接觸角測試, 并使用10 μL去離子水測試微柱陣列對水滴的黏附力.

1.2.4 微凝膠的制備 按照質(zhì)量分數(shù)分別為10%, 20%, 30%和40%配制凝膠預聚液, 以經(jīng)過PFOS修飾的微柱基底作為模板, 滴加20 μL左右凝膠預聚液, 以注射針頭作為牽引, 帶動凝膠預聚液液滴在超疏水微柱陣列基底上進行涂覆; 涂覆完全后將凝膠預聚液液滴吸去, 并將涂覆后的微柱基底置于低溫高濕環(huán)境中, 在18 mW/cm2的紫外燈照射下固化10 min; 照射結(jié)束后取出微柱基底進行SEM測試, 觀察未剝離時微柱頂端干態(tài)微凝膠形貌規(guī)律; 然后將微柱基底浸沒于3 mL去離子水中, 超聲振蕩1 min, 以5000 r/min的速度離心水洗多次, 得到PsMH分散液.

1.2.5 微凝膠液下形貌測試 參照文獻[27]方法, 使用原子力顯微鏡以液下模式對PsMH水下形貌及高度進行測試. 使用無水乙醇將蓋玻片超聲洗凈后, 用N2氣吹干; 采用浸漬提拉法, 將蓋玻片放入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的PEI溶液中進行修飾, 取出后放于濾紙上自然風干; 在修飾后的載玻片上滴加50 μL PsMH分散液, 待水完全揮發(fā)后再次滴加, 重復3次后, 使用去離子水輕輕清洗載玻片, 洗去未黏附的PsMH及其它雜質(zhì); 在空氣中待載玻片完全干燥后, 進行水下AFM測試.

2 結(jié)果與討論

2.1 干態(tài)微凝膠的形貌

Scheme 1為微凝膠制備流程圖. 將配制好的凝膠預聚液涂覆在超疏水微柱陣列結(jié)構(gòu)硅基底上時, 一方面, 經(jīng)疏水修飾后微柱陣列的水接觸角約為150°, 呈現(xiàn)超疏水特性(圖S1, 見本文支持信息), 液滴可以在微柱陣列上任意移動; 另一方面, 修飾后的微柱陣列對水的黏附力約為100 μN, 液滴在遠離微柱陣列時產(chǎn)生形變(圖S2, 見本文支持信息), 微柱陣列呈現(xiàn)高黏附力特性, 故液滴在微柱陣列上移動時, 液滴運動末端同微柱頂端產(chǎn)生液橋, 液橋斷裂后在微柱頂端殘留微液滴[21,23]. 微柱頂部均勻鋪滿微液滴后, 將其置于低溫高濕環(huán)境中, 經(jīng)紫外光照, 引發(fā)巰基基團與乙烯基基團的邁克爾加成反應, 固化得到分布于微柱頂端的PsMH[9,28]. 以微柱直徑及凝膠預聚液濃度對PsMH進行命名, 如PsMH-310, 即代表在直徑為3 μm的微柱結(jié)構(gòu)基底上滴加質(zhì)量分數(shù)為10%的預聚液液滴制備的PsMH.

Scheme 1 Schematic diagram of fabricating polysaccharide micro-hydrogel(PsMH) on cylinder-structured Si substrate

為了研究微柱直徑對微凝膠尺寸、形貌的影響, 使用質(zhì)量分數(shù)為40%的凝膠預聚液, 以直徑分別為(3, 6, 9, 12, 15 μm)的超疏水微柱基底為模板制備PsMH. 由圖1(A～E)可見, PsMH均勻分布于微柱陣列頂端, 無明顯缺陷, 且直徑分布窄, PsMH尺寸隨微柱直徑增加而相應增加. 隨著微柱尺寸增大至12 μm, 所制備的PsMH邊緣略顯不規(guī)則. 由對應的放大圖可見, 處于干態(tài)的PsMH形狀完整, 表面存在褶皺結(jié)構(gòu), PsMH同微柱之間邊界明顯. 側(cè)視圖[圖1(F～J)]進一步驗證PsMH均勻分布在微柱頂端, 且尺寸均一. 當微柱尺寸較小時, PsMH呈圓形扁平狀結(jié)構(gòu); 隨著微柱直徑增加, PsMH高度與形貌也發(fā)生變化, 由扁平狀逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍蚬跔? 最終呈半球形. 這是由于隨著微柱直徑增大, 微柱頂端黏附的液滴體積迅速增大, 其中包含的聚合物總量也隨之迅速增大, 所以固化后PsMH在形貌上有巨大差別. 由上述結(jié)果可見, 在凝膠預聚液濃度為40%時, 通過改變微柱直徑, 可以調(diào)控PsMH的形貌, 在微柱結(jié)構(gòu)基底上制備出結(jié)構(gòu)規(guī)整、分布均勻、尺寸差異小的PsMH.

Fig.1 SEM images of top view(A—E) and side view(F—J) and relevant amplified images(insets) of PsMH fabricated on cylinder array with diameters of 3 μm(A, F), 6 μm(B, G), 9 μm(C, H), 12 μm(D, H) and 15 μm(E, J), respectively Mass fraction of the polymer precursor: 40%.

2.2 微凝膠的形貌變化

Fig.2 Size(diameter) distribution of PsMH

Fig.3 SEM images of side view of PsMH-310(A), PsMH-910(B), PsMH-1510(C) and PsMH-1540(D)

為了研究凝膠預聚液濃度對微凝膠尺寸和形貌的影響, 使用不同濃度(10%, 20%, 30%)凝膠預聚液重復上述實驗. 由圖2和圖3可見, 當凝膠預聚液濃度與微柱直徑均較小時(PsMH-310, PsMH-320, PsMH-610), PsMH呈現(xiàn)出不規(guī)則形貌, 而其它參數(shù)下均能形成結(jié)構(gòu)完整的PsMH, 且具有較窄尺寸分布. 這是由于當微柱直徑較小時, 微柱陣列頂端粘附的凝膠預聚液液滴尺寸較小, 凝膠預聚液中聚合物濃度較低, 導致微液滴中溶劑揮發(fā)過快, 微液滴在固化前聚合物和溶劑已經(jīng)分相, 從而出現(xiàn)不完整凝膠形貌. 隨著凝膠預聚液濃度或微柱直徑增加, PsMH形貌趨于完整, 尺寸逐漸增加. 由圖3(A)可見, 當凝膠預聚液濃度為10%時, 采用直徑為3 μm的超疏水微柱陣列制備的凝膠存在凸起結(jié)構(gòu), 呈現(xiàn)非連續(xù)顆粒狀, 未形成完整的PsMH形貌; 采用直徑為9 μm超疏水微柱陣列制備的PsMH結(jié)構(gòu)完整, 表面呈褶皺狀, 但PsMH同微柱間邊界不清晰[圖3(B)]; 超疏水微柱陣列直徑增加至15 μm時[圖3(C)], PsMH表面褶皺減少, 與微柱間有清晰的邊界; 保持超疏水微柱陣列直徑不變, 增加凝膠預聚液濃度后, PsMH直徑與厚度明顯增大[圖3(D)]. 上述結(jié)果表明, 通過改變預聚液濃度及微柱直徑可以獲得不同形貌的PsMH, 當預聚液濃度較低時, PsMH呈扁平狀, 隨著預聚液濃度增加, PsMH厚度增加, 并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘肭驙? 可以看出, 使用超疏水微柱陣列硅基底為模板可以進行不同形貌及尺寸的多糖基微凝膠的制備.

為了研究微凝膠尺寸與微柱黏附液滴中聚合物含量的關系, 以經(jīng)疏水修飾的平整硅基底的水接觸角模擬單個微柱頂端的水接觸角. 由圖S3(見本文支持信息)可見, 此時接觸角為107°, 根據(jù)球缺體積公式估算黏附的微液滴體積. 不同直徑微柱對應的液滴體積、聚合物含量及PsMH直徑列于表1. 可見, 隨著超疏水微柱陣列直徑的增加, 其黏附微液滴的體積由11.5 μm3增加至1439.2 μm3, 聚合物含量亦由0.12 pg增加至57.57 pg, 微凝膠直徑由(1±0.1) μm增加至(8.9±0.5) μm; 當預聚液濃度與超疏水微柱陣列直徑均不相同時, 若黏附液滴中具有相似的聚合物含量, 也能制備出尺寸相似的PsMH. 這表明PsMH尺寸與形貌同微柱黏附液滴中聚合物含量相關.

Table 1 Estimated micro-droplets volumes and polymer mass adhered to

*d: The diameters of cylinder array;V: the estimated volumes of micro-droplets;m10%—m40%: the estimated mass of polymer contained in the micro-droplets adhered to micro-cylinder with the concentration of 10%—40%;d10%—d40%: the diameter of PsMH fabricated with relevant concentration.

為了研究不同基底對PsMH制備的影響, 采用超疏水六邊形微柱陣列基底、PVA超疏水微柱陣列基底及PDMS超疏水微柱陣列分別進行了微凝膠的制備. 首先改變超疏水微柱陣列的形狀, 研究超疏水微柱陣列形狀對PsMH形貌的影響, 使用經(jīng)PFOS修飾的超疏水六邊形微柱陣列基底進行PsMH制備, 凝膠預聚液質(zhì)量分數(shù)為40%, 其它條件相同. 由圖4(A)可見, 在超疏水六邊形微柱陣列頂端, PsMH仍呈現(xiàn)出半球形形貌. 本文還研究了基底材料對PsMH制備的影響. 通過復型法制備了微柱直徑為5 μm的PVA基底(PVA制備過程中收縮)和6 μm的PDMS基底, 經(jīng)過PFOS修飾后, 得到不同材質(zhì)的超疏水微柱陣列基底. 由圖4(B)和(C)可見, 在PVA和PDMS超疏水微柱陣列基底上, 均能得到尺寸分布均一、均勻分布于超疏水微柱陣列頂端的半球形PsMH. 上述現(xiàn)象表明, 該制備方法不受微柱形貌的限制, 且適用于多種材料的基底, 具有一定的普適性.

Fig.4 SEM images and relevant amplified images(insets) of PsMH fabricated on hexagonal pillar-structured Si substrate(A), cylinder-structured PVA(B) and PDMS substrate(C)

2.3 濕態(tài)微凝膠的形貌

Fig.5 SEM images of the top view of PsMH-940(A) and the side view of PsMH-640(B) after being peeled off Insets are relevant amplified images.

Fig.6 Size distribution of the peeled PsMH a. PsMH-340; b. PsMH-640; c. PsMH-940; d. PsMH-1240.

為研究剝離對PsMH形貌與尺寸的影響, 得到PsMH分散液后將其脫水干燥進行SEM測試. 由圖5(A)和(B)可以看出, 剝離后的PsMH仍呈現(xiàn)半球形形貌, 結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化. 經(jīng)統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn), 微凝膠尺寸同未剝離時相差較小, 但尺寸分布變寬(圖6), 表明劇烈的超聲剝離過程對PsMH的尺寸均一性有一定影響.

Fig.7 AFM images of PsMH-340(A), PsMH-40(B), PsMH-940(C), PsMH-1240(D) under water

Fig.8 Height maps of PsMH-340(A), PsMH-40(B), PsMH-940(C), PsMH-1240(D) under water

3 結(jié) 論

提出了一種基于超疏水高黏附微柱陣列制備微米級凝膠的方法. 通過改變微柱尺寸及預聚液濃度, 制備出了一系列具有不同尺寸及不同形貌的PsMH. 研究發(fā)現(xiàn), 隨著微柱直徑與預聚液濃度增大, PsMH的直徑增大, 厚度增加. 經(jīng)過超聲水洗后, PsMH仍可保持完整形貌, 證明了該方法具有可控、有效及適用廣泛的特點. 在今后的研究中, 有望在不同材料的基底表面實現(xiàn)多種高分子預聚液的大面積快速制備, 并有望通過功能分子的負載, 使多糖基微凝膠在藥物遞送、納米粒子載體、細胞示蹤及單細胞精準給藥等領域得到廣泛應用.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20200193.