張曉艷， 溫春燕， 呂玉華， 陳 豪， 佘菲菲

?

靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能驗(yàn)證

張曉艷， 溫春燕， 呂玉華， 陳 豪， 佘菲菲

目的 構(gòu)建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并驗(yàn)證其對(duì)AGS胃癌細(xì)胞增殖的影響。 方法 設(shè)計(jì)并合成5對(duì)針對(duì)人YWHAE基因的shRNA序列，分別克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，接著將重組的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒PHR、包膜質(zhì)粒VSVG一起采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，收集制備的慢病毒感染AGS細(xì)胞，用抗生素Puromycine進(jìn)行篩選。Western-blot檢測(cè)感染細(xì)胞YWHAE蛋白的表達(dá)。選取干擾效率最高的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，針對(duì)性設(shè)計(jì)siRNA的點(diǎn)突變引物，重疊延伸PCR法擴(kuò)增獲得點(diǎn)突變的YWHAE基因，克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體，構(gòu)建YWHAE點(diǎn)突變的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染YWHAE沉默效果最好的AGS細(xì)胞株，Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞YWHAE蛋白的回復(fù)表達(dá)。采用MTS法檢測(cè)YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 5對(duì)針對(duì)人YWHAE基因的shRNA序列構(gòu)建的慢病毒中，pLL3.7-siYWHAE-5包裝成的慢病毒抑制AGS細(xì)胞的YWHAE蛋白表達(dá)的效果最明顯，僅為對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包裝的慢病毒，其干擾效應(yīng)可經(jīng)由YWHAE點(diǎn)突變表達(dá)質(zhì)粒回復(fù)。與對(duì)照組比較，YWHAE-shRNA組AGS細(xì)胞增殖能力明顯下降。 結(jié)論 成功構(gòu)建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，獲得YWHAE基因表達(dá)顯著下調(diào)的AGS細(xì)胞株;探明YWHAE表達(dá)的下調(diào)可有效抑制AGS細(xì)胞的增殖，提示YWHAE在胃癌中的致癌潛能。

慢病毒屬； RNA干擾； 胃腫瘤； 細(xì)胞增殖

在全球高發(fā)腫瘤中，胃癌位居第4位，死亡率居癌癥死亡率的第2位，嚴(yán)重威脅人類的健康,探討胃癌的發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1]。酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白ε肽(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon, YWHAE)是14-3-3蛋白家族的ε亞型，是生物進(jìn)化中最保守的蛋白之一[2]。在胃癌的相關(guān)研究中，YWHAE扮演的角色目前尚存在爭(zhēng)議。幽門螺桿菌是公認(rèn)的致癌原，Nagappan等用該菌感染Gulo-/-(L-gulono-gamma-lactone oxidase基因缺失)小鼠，在胃組織中檢測(cè)到Y(jié)WHAE高表達(dá)[3-4]。Gong等通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，YWHAE在胃癌組織中高表達(dá)[5]。但Leal等發(fā)現(xiàn)，YWHAE蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織[6]。在胃癌組織中，YWHAE究竟是抑癌還是促癌，單純從蛋白的表達(dá)水平上判定存在一定的局限性。從實(shí)質(zhì)上探討YWHAE的功能作用以明確YWHAE與胃癌的關(guān)系，從而探明YWHAE在胃癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用，對(duì)胃癌的防治有重大的意義。本研究擬構(gòu)建靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，建立YWHAE表達(dá)下調(diào)的胃癌細(xì)胞模型，并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，為調(diào)控YWHAE在胃癌中的相關(guān)功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 pLentiLox3.7(pLL3.7)、PHR和VSVG(消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)；pcDNA3.1/myc-His(-)A、大腸桿菌Stable3和DH5α(美國(guó)Invitrogen公司)；人胃腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS(中國(guó)中科院上海細(xì)胞庫(kù))；293T細(xì)胞(美國(guó)ATCC公司)。

1.1.2 試劑 胎牛血清(FBS，德國(guó)PAN公司)；Ham’s-F12培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液和Puromycine(美國(guó)Gibco公司)；XhoI、HpaI、EcoR I、XbaI和KpnI(美國(guó)NEB公司)；高保真DNA聚合酶(美國(guó)Invitrogen公司)；Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA法定量試劑(中國(guó)Beyotime公司)；anti-14-3-3ε(T-16)(美國(guó)Santa Cruz公司)；Myc-Tag (9B11) Mouse mAb(美國(guó)CST公司)；goat anti-mouse IgG-AP(德國(guó)Merck公司)；anti-β-actin(美國(guó)Sigma公司)；FuGENE 6 Transfection Reagent和Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent(美國(guó)Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS培養(yǎng)于含10% FBS的Ham’s-F12培養(yǎng)液中，293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液中。二者均置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次。

1.2.2 重組慢病毒pLL3.7-YWHAE-shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的YWHAE(NM_006761.4)基因編碼序列，利用美國(guó)Invitrogen公司提供的在線RNA干擾序列設(shè)計(jì)軟件及BLOCK-iTTMInducible H1 Lentiviral RNA System手冊(cè)中提供的設(shè)計(jì)規(guī)則，按照正義鏈模板：5′-T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTT

TC-3′，反義鏈與正義鏈互補(bǔ)，并在其5′端加入XhoI酶切位點(diǎn)(TCGAG)，設(shè)計(jì)5對(duì)針對(duì)人YWHAE基因的shRNA序列引物，1對(duì)無(wú)義的陰性對(duì)照序列引物由上海Invitrogen生物公司合成，具體序列如下(F：正義鏈；R：反義鏈)。將合成的引物退火，形成雙鏈DNA oligo，克隆入經(jīng)XhoI和HpaI雙酶切后的pLL3.7慢病毒表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建重組的pLL3.7-YWHAE-shRNA表達(dá)質(zhì)粒和pLL3.7-NC-shRNA陰性對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Stable3，挑取重組陽(yáng)性菌落抽提質(zhì)粒行雙酶切及測(cè)序(福州鉑尚生物技術(shù)有限公司)鑒定。

siYWHAE-1：

F：5′-TGCTGAGCAGTTGTCCGCGTTTCAAGAGAACGCGGACAACTGCTCAGCTTTTTTC-3′

R：5′-TCGAGAAAAAAGCTGAGCAGTTGTCCGCGTTCTCTTGAAACGCGGACAACTGCTCAGCA-3′

siYWHAE-2：

F：5′-TGCAGTTGTCCGCGTGCGCATTCAAGAGATGCGCACGCGGACAACTGCTTTTTTC-3′

R：5′-TCGAGAAAAAAGCAGTTGTCCGCGTGCGCATCTCTTGAATGCGCACGCGGACAACTGCA-3′

siYWHAE-3：

F：5′-TGGAAGGAGGCTGCGGAGAATTCAAGAGATTCTCCGCAGCCTCCTTCCTTTTTTC-3′

R：5′-TCGAGAAAAAAGGAAGGAGGCTGCGGAGAATCTCTTGAATTCTCCGCAGCCTCCTTCCA-3′

siYWHAE-4：

F：5′-TGAAGAAAGCTATAAGGACTTTCAAGAGAAGTCCTTATAGCTTTCTTCTTTTTTC-3′

R：5′-TCGAGAAAAAAGAAGAAAGCTATAAGGACTTCTCTTGAAAGTCCTTATAGCTTTCTTCA-3′

siYWHAE-5：

F：5′-TGAGGAGAAGACAAGCTAAATTCAAGAGATTTAGCTTGTCTTCTCCTCTTTTTTC-3′

R：5′-TCGAGAAAAAAGAGGAGAAGACAAGCTAAATCTCTTGAATTTAGCTTGTCTTCTCCTCA-3′

siRNA-NC：

F：5′-TGTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGACTTTTTTC-3′

R：5′-TCGAGAAAAAAGTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGACA-3′

1.2.3 慢病毒的包裝 用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。具體步驟如下：轉(zhuǎn)染前1天，將293T細(xì)胞鋪于35 mm板中，當(dāng)密度達(dá)到匯合度60%～70%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前1 h，用新鮮無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞換液。按下列劑量配制轉(zhuǎn)染試劑體系：質(zhì)粒(pLL3.7 2 μg，PHR 1.5 μg，VSVG 1 μg)，2.5 mol/L的CaCl210 μL，補(bǔ)充水至100 μL，混勻，再加入2×HBS 100 μL，靜置20～30 min。將混合物混勻后均勻滴到293T細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 h。更換新鮮的完全培養(yǎng)液，并加NEAA(100×) 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h(從轉(zhuǎn)染時(shí)開(kāi)始計(jì)算時(shí)間)，收集上清分裝入EP管中，6 500 r/min離心5 min，吸取上清,用0.45 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液即病毒液。

1.2.4 慢病毒感染AGS細(xì)胞 將AGS細(xì)胞以匯合度為50%～60%均勻鋪于35 mm板，培養(yǎng)14～16 h。將收集到的病毒液均勻滴加至AGS細(xì)胞中，輕輕搖勻，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后換新鮮完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞匯合度為80%～90%時(shí)，將細(xì)胞從35 mm板消化轉(zhuǎn)移至2個(gè)6 cm板(一板用于篩選細(xì)胞株，一板用于驗(yàn)證表達(dá)情況)，培養(yǎng)液分別補(bǔ)足至5 mL，加抗生素Puromycine，用最低致死量0.5 μg/mL篩選。待6 cm板細(xì)胞匯合度為80%～90%，轉(zhuǎn)移至10 cm板，繼續(xù)用最低致死量的Puromycine培養(yǎng)1周。1周后抗生素劑量減半，再篩選1周(時(shí)間從感染開(kāi)始計(jì)算)，收集細(xì)胞，凍存于-80 ℃。

1.2.5 YWHAE-shRNA 慢病毒干擾細(xì)胞蛋白表達(dá)功能的鑒定 Puromycine篩選結(jié)束后，各感染組收集部分細(xì)胞，用Western及IP細(xì)胞裂解液分別提取總蛋白，BCA法定量測(cè)定蛋白濃度后，取等量蛋白進(jìn)行Western-blot驗(yàn)證[一抗anti-14-3-3ε(T-16)，1∶200稀釋；二抗goat anti-mouse IgG-AP，1∶2 000稀釋；內(nèi)參anti-β-actin，1∶2 000稀釋]，觀察慢病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)AGS細(xì)胞YWHAE表達(dá)的沉默效果。用Image J 1.48軟件分析蛋白條帶的灰度，并以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算YWHAE蛋白的表達(dá)量。

AGS-siYWHAE細(xì)胞YWHAE蛋白相對(duì)表達(dá)水平=YWHAE表達(dá)量siYWHAE-5組/YWHAE表達(dá)量siNC組

1.2.6 YWHAE-shRNA慢病毒干擾細(xì)胞蛋白表達(dá)功能的回復(fù)驗(yàn)證 為了證明實(shí)驗(yàn)篩獲的YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)細(xì)胞YWHAE的干擾未出現(xiàn)off-target效應(yīng)(脫靶效應(yīng))，進(jìn)一步采用干擾回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6.1 YWHAE點(diǎn)突變質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-YWHAEm的構(gòu)建 根據(jù)GeneBank上公布的YWHAE基因(NM_006761.4)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增YWHAE基因(768 bp)的引物。

上游：

YWHAE-F：5′-CCGCTCGAGGCCACCATGGATGA

TCGAGAGGATCTG-3′(下劃線為XhoI位點(diǎn)，序列5′端加上GCCACC增強(qiáng)翻譯效率)

下游：

YWHAE-R：5′-CGGGGTACCCTGATTTTCGTCTTC

CA-3′(下劃線為KpnI位點(diǎn))

同時(shí)，設(shè)計(jì)含針對(duì)siYWHAE-5干擾序列的點(diǎn)突變(下劃線標(biāo)記)。

正向：

Fm：5′-GGCGGCGAGGATAAACTGAAGATGATTC

GGGAATATCGGCAAA-3′

反向：

Rm：5′-CTTCAGTTTATCCTCGCCGCCCTTGTTTT

CTTCTTTCTGTTC-3′

引物由福州鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。利用重疊延伸PCR法，以pGADT7-YWHAE(本實(shí)驗(yàn)室保存)作為模板，使用引物YWHAE-F和Rm以及Fm和YWHAE-R分別擴(kuò)增YWHAE基因上游及下游片段。擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸20 s(上游片段)或40 s(下游片段)，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以YWHAE基因上游及下游片段為模板，使用引物YWHAE-F和YWHAE-R擴(kuò)增YWHAE點(diǎn)突變基因的全長(zhǎng)(YWHAEm)。擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。進(jìn)而將YWHAEm克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體中，構(gòu)建pcDNA3.1-myc-YWHAEm表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取重組陽(yáng)性菌落抽提質(zhì)粒行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.2.6.2 pcDNA3.1-myc-YWHAEm蛋白表達(dá)驗(yàn)證及干擾回復(fù)驗(yàn)證 用FuGENE 6 Transfection Reagent將pcDNA3.1-myc-YWHAEm分別轉(zhuǎn)染入AGS野生株、AGS-siNC和AGS-siYWHAE細(xì)胞株。48 h后提取細(xì)胞蛋白，BCA定量，進(jìn)行Western-blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)[一抗Myc-Tag (9B11) Mouse mAb，1∶1 000稀釋和anti-14-3-3ε(T-16)；二抗goat anti-mouse IgG-AP；內(nèi)參anti-β-actin]，觀察在YWHAE-shRNA慢病毒干擾的AGS 細(xì)胞中YWHAE表達(dá)的回復(fù)效果。

1.2.7 MTS法檢測(cè)YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響 將YWHAE沉默效果最好的AGS細(xì)胞株(AGS-siYWHAE)和對(duì)照組細(xì)胞株(AGS-siNC)分別以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)5 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液和20 μL Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2環(huán)境下孵育1 h。在酶標(biāo)儀上用490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(OD)值，以空白孔調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。以O(shè)D值為縱軸、作用時(shí)間為橫軸繪制AGS細(xì)胞增殖曲線。

增殖抑制率=(1-ODsiYWHAE組/ODsiNC組)×100%

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒pLL3.7-YWHAE-shRNA表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 慢病毒載體pLL3.7含有限制性核酸內(nèi)切酶XhoI和HpaI的酶切位點(diǎn)，用于插入退火產(chǎn)物。5對(duì)針對(duì)人YWHAE基因的shRNA序列和1條無(wú)義的陰性對(duì)照序列的正義鏈和反義鏈，退火形成雙鏈DNA oligo，各自退火產(chǎn)物的兩端中均有一端為XhoI的粘性末端，另一端為平齊末端。故將退火產(chǎn)物克隆入pLL3.7載體中，獲得的重組質(zhì)粒pLL3.7-YWHAE(或NC)-shRNA中還保留XhoI位點(diǎn)，而HpaI位點(diǎn)已被破壞，借助這種特性可對(duì)初篩的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定：即重組構(gòu)建成功后，當(dāng)質(zhì)粒用EcoR I和XbaI酶切，可切開(kāi)得到約1 800 bp的片段；而用EcoR I和HpaI酶切則無(wú)法獲得雙酶切效果(圖1)。將經(jīng)雙酶切初篩的質(zhì)粒進(jìn)一步送測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了具有正確序列的重組質(zhì)粒，分別為pLL3.7-siYWHAE-1，pLL3.7-siYWHAE-2，pLL3.7-siYWHAE-3，pLL3.7-siYWHAE-4，pLL3.7-siYWHAE-5和pLL3.7-siNC。

1，2：pLL3.7-siYWHAE-1質(zhì)粒EcoR I/Hpa I及EcoR I/Xba I雙酶切；3，4：pLL3.7-siYWHAE-2質(zhì)粒EcoR I/Hpa I及EcoR I/Xba I雙酶切；5，6：pLL3.7-siYWHAE-3質(zhì)粒EcoR I/Hpa I及EcoR I/Xba I雙酶切；7，8：pLL3.7-siYWHAE-4質(zhì)粒EcoR I/Hpa I及EcoR I/Xba I雙酶切；9，10：pLL3.7-siYWHAE-5質(zhì)粒EcoR I/Hpa I及EcoR I/Xba I雙酶切；11，12：pLL3.7-siNC質(zhì)粒EcoR I/Hpa I及EcoR I/Xba I雙酶切；M：5 kb DNA Marker.圖1 重組質(zhì)粒pLL3.7-YWHAE-shRNA雙酶切鑒定Fig 1 Double digestion analysis of the recombinant plasmid pLL3.7-YWHAE-shRNA

2.2 YWHAE-shRNA 慢病毒干擾細(xì)胞蛋白表達(dá)功能的鑒定 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(pLL3.7-siYWHAE-1，pLL3.7-siYWHAE-2，pLL3.7-siYWHAE-3，pLL3.7-siYWHAE-4，pLL3.7-siYWHAE-5和pLL3.7-siRNA-NC)和包裝質(zhì)粒PHR、包膜質(zhì)粒VSVG轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，即可觀察到細(xì)胞病理現(xiàn)象。在轉(zhuǎn)染后48 h收集病毒感染AGS細(xì)胞，用含Puromycine的完全培養(yǎng)液篩選細(xì)胞。篩選結(jié)束后，提細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-blot驗(yàn)證。結(jié)果顯示，5對(duì)針對(duì)人YWHAE基因的shRNA序列構(gòu)建的慢病毒中，pLL3.7-siYWHAE-5包裝成的慢病毒抑制AGS細(xì)胞YWHAE蛋白表達(dá)的效果最明顯，僅為對(duì)照組表達(dá)量的(0.269±0.083)倍(圖2)，該穩(wěn)定細(xì)胞株命名為AGS-siYWHAE細(xì)胞。

2.3 重組YWHAE點(diǎn)突變pcDNA3.1-myc-YWHAEm表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 以pGADT7-YWHAE為模板，利用重疊延伸PCR法擴(kuò)增定點(diǎn)突變的YWHAEm基因，并克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，可見(jiàn)約768 bp的DNA條帶(圖3)。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoI和KpnI雙酶切后，可見(jiàn)約5 500和768 bp2條DNA條帶，分別與載體質(zhì)粒和目的基因大小相符(圖3)，進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)YWHAEm基因正確插入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體中。

n=3. A：Western-blot鑒定YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞YWHAE蛋白表達(dá)的影響；B：AGS-siYWHAE細(xì)胞YWHAE蛋白相對(duì)表達(dá)水平. 與siNC組比較，☆：P<0.05.圖2 YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞YWHAE蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of YWHAE-shRNA lentivirus on the expression of YWHAE protein in AGS cells

1：pcDNA3.1/myc-His(-)A質(zhì)粒Xho I/Kpn I雙酶切；2：以pcDNA3.1-myc-YWHAEm為模板PCR擴(kuò)增點(diǎn)突變的YWHAE基因；3：pcDNA3.1-myc-YWHAEm質(zhì)粒Xho I/Kpn I雙酶切；M：5 kb DNA Marker.圖3 pcDNA3.1-myc-YWHAEm質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定Fig 3 PCR identification and double digestion analysis of the recombinant plasmid pcDNA3.1-myc-YWHAEm

2.4 pcDNA3.1-myc-YWHAEm對(duì)YWHAE- shRNA慢病毒干擾的回復(fù)驗(yàn)證 將pcDNA3.1-myc-YWHAEm和pcDNA3.1/myc-His(-)A(對(duì)照)分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，經(jīng)Western-blot顯示，pcDNA3.1-myc-YWHAEm轉(zhuǎn)染組用Myc-Tag (9B11) Mouse mAb可檢測(cè)到目的蛋白條帶，分子量大小與預(yù)期相符(約38 kDa)(圖4)；而對(duì)照組未見(jiàn)特異性條帶，即YWHAE點(diǎn)突變質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-YWHAEm可經(jīng)轉(zhuǎn)染在AGS細(xì)胞中表達(dá)YWHAE。將pcDNA3.1-myc-YWHAEm質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AGS-siYWHAE細(xì)胞，經(jīng)Western-blot顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc-His(-)A的AGS-siYWHAE細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染后AGS-siYWHAE細(xì)胞中YWHAE表達(dá)明顯上調(diào)，與AGS-siNC細(xì)胞內(nèi)源性YWHAE相近(圖5)。表明YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞表達(dá)YWHAE的干擾實(shí)驗(yàn)是成功的，未出現(xiàn)off-target效應(yīng)，細(xì)胞可經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-myc-YWHAEm重組質(zhì)?；貜?fù)干擾。

圖4 YWHAEm蛋白在AGS細(xì)胞中的表達(dá)Fig 4 YWHAEm protein expression in AGS cells

圖5 YWHAEm蛋白在AGS-siYWHAE細(xì)胞中的回復(fù)表達(dá)Fig 5 YWHAEm protein re-established expression in AGS-siYWHAE cells

2.5 YWHAE-shRNA 慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞增殖功能的影響 用MTS比色法檢測(cè)AGS-siYWHAE和AGS-siNC(對(duì)照)1～5 d的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，AGS-siYWHAE組與AGS-siNC組比較，從第2天開(kāi)始，細(xì)胞增殖就出現(xiàn)差異，第3～5天這種差異逐漸加大，增殖抑制率分別為23.6%，23.6%和20.8%，AGS-siYWHAE組的增殖受到顯著抑制(圖6)。表明YWHAE-shRNA慢病毒感染使AGS細(xì)胞YWHAE表達(dá)下調(diào)后，AGS細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。

3 討 論

本研究成功構(gòu)建了YWHAE-shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。在構(gòu)建YWHAE-shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒前期，考慮到在目的基因上選擇不同起始位點(diǎn)的片段為模板所構(gòu)建的RNAi載體對(duì)目的基因的抑制率可能會(huì)不同，課題組分別針對(duì)人YWHAE基因的5′非編碼區(qū)(UTR5)和開(kāi)放讀碼框(ORF)設(shè)計(jì)了5個(gè)基因片段來(lái)構(gòu)建相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針對(duì)UTR5設(shè)計(jì)的2個(gè)片段干擾效果不明顯，推測(cè)可能UTR5存在豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些調(diào)控蛋白的結(jié)合可能影響到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)與mRNA的結(jié)合，從而影響了siRNA的干擾效果；針對(duì)ORF設(shè)計(jì)的3個(gè)片段均能達(dá)到一定的下調(diào)靶基因表達(dá)的作用，并且片段5的干擾抑制效率最高[YWHAE的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的(0.269±0.083)倍]。進(jìn)而課題組設(shè)計(jì)含針對(duì)siYWHAE-5干擾序列的點(diǎn)突變引物，構(gòu)建了YWHAE點(diǎn)突變(同義突變)表達(dá)質(zhì)粒，并將后者轉(zhuǎn)染篩獲的細(xì)胞株，順利回復(fù)了YWHAE的表達(dá)，表明課題組篩獲的YWHAE- shRNA慢病毒對(duì)細(xì)胞YWHAE的干擾未出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，成功構(gòu)建了由shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒介導(dǎo)的YWHAE表達(dá)下調(diào)的AGS胃癌細(xì)胞模型，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

n=5. YWHAE-shRNA慢病毒感染使AGS細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制. 與siNC組比較，☆：P<0.05.圖6 YWHAE-shRNA慢病毒對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響Fig 6 Effect of YWHAE-shRNA lentivirus on the proliferation of AGS cells

與Gong等采用shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選YWHAE表達(dá)下調(diào)的SGC7901細(xì)胞相比[5]，本研究采用慢病毒載體感染篩選YWHAE表達(dá)下調(diào)的AGS細(xì)胞具有自身的優(yōu)勢(shì):(1)慢病毒載體源于人類免疫缺陷病毒-1，能感染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞，宿主范圍廣；(2)病毒感染細(xì)胞的效率通常比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率高；(3)當(dāng)感染細(xì)胞時(shí)，病毒的基因可整合到宿主細(xì)胞的基因組中，隨細(xì)胞分裂傳給子代，表達(dá)穩(wěn)定；(4)病毒自身的致病基因已被剔除，難以重組野生病毒株，應(yīng)用較為安全。因此，本研究用慢病毒載體表達(dá)YWHAE-siRNA能在胃癌細(xì)胞中高效、安全、穩(wěn)定持久地發(fā)揮干擾下調(diào)YWHAE基因表達(dá)的作用，并且不僅可用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，還可用于動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究。此外，Gong等采用的shRNA質(zhì)粒為商品化的試劑，不僅成本高，而且具體序列未公布，使得干擾回復(fù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展受限[5]。

在YWHAE與胃癌的相關(guān)研究中，Yan等通過(guò)在SGC7901胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)YWHAE，發(fā)現(xiàn)YWHAE可激活ERK/MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[7]。Gong等在下調(diào)YWHAE表達(dá)的SGC7901細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象[5]。本課題組借助MTS法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)課題組構(gòu)建的YWHAE-shRNA慢病毒介導(dǎo)AGS細(xì)胞YWHAE表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞的增殖能力也明顯受到抑制。由此表明，YWHAE在胃癌細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，很可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展。但是關(guān)于YWHAE在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用目前仍觀點(diǎn)不一。例如，Leal團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，YWHAE蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯的低于癌旁組織，提示YWHAE可能是種抑癌蛋白[6]。遺憾的是，該團(tuán)隊(duì)并未進(jìn)一步探討YWHAE在胃癌細(xì)胞內(nèi)的功能機(jī)制。在胃癌的發(fā)生發(fā)展中不僅發(fā)生細(xì)胞增殖異常，而且在細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成等多方面都可能發(fā)生異常，YWHAE是促癌還是抑癌，則還有待更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的深入驗(yàn)證。

本研究成功構(gòu)建YWHAE-shRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，建立YWHAE表達(dá)下調(diào)的AGS胃癌細(xì)胞模型，探明YWHAE表達(dá)下調(diào)對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響，為調(diào)控YWHAE在胃癌細(xì)胞內(nèi)的功能研究和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。

[1] Van Cutsem E, Sagaert X, Topal B,etal. Gastric cancer[J].Lancet, 2016,388(10060):2654-2664.

[2] Aitken A. 14-3-3 proteins: a historic overview [J].SeminCancerBiol, 2006,16(3):162-172.

[3] Chen S Y, Zhang R G, Duan G C. Pathogenic mechanisms of the oncoprotein CagA inH.pylori-induced gastric cancer [J].OncolRep, 2016,36(6):3087-3094.

[4] Nagappan A, Park H S, Park K I,etal.Helicobacterpyloriinfection combined with DENA revealed altered expression of p53 and 14-3-3 isoforms in Gulo-/-mice [J].ChemBiolInteract, 2013,206(2):143-152.

[5] Gong X, Yan L, Gu H,etal. 14-3-3ε functions as an oncogene in SGC7901 gastric cancer cells through involvement of cyclin E and p27kip1[J].MolMedRep, 2014,10(6):3145-3150.

[6] Leal M F, Calcagno D Q, Demachki S,etal. Clinical implication of 14-3-3 epsilon expression in gastric cancer [J].WorldJGastroenterol, 2012,18(13):1531-1537.

[7] Yan L, Gu H, Li J,etal. RKIP and 14-3-3ε exert an opposite effect on human gastric cancer cells SGC7901 by regulating the ERK/MAPK pathway differently [J].DigDisSci, 2013,58(2):389-396.

(編輯：何佳鳳)

Construction and Function Identification of Short Hairpin RNA Lentiviral Expression Plasmid Targeting YWHAE

ZHANG Xiaoyan, WEN Chunyan, LYU Yuhua, CHEN Hao, SHE Feifei

Key Laboratory of Ministry of Education for Gastrointestinal Cancer, Fujian Key Laboratory of Tumor Microbiology, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China

Objective To construct a short hairpin RNA (shRNA) lentiviral expression plasmid targeting YWHAE (Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon) gene and then detect the effect of shRNA on the proliferation of AGS cells. Methods Five shRNA interference sequences targeting YWHAE gene were designed, synthesized and cloned into the pLentiLox3.7(pLL3.7) expression vector. Then the expression plasmids, PHR and VSVG were co-transfected into 293T cells using calcium phosphate to package virus. AGS cells were infected with the extracted virus, and screened with Puromycine. Silencing effect was verified via Western-blot. The lentiviral expression plasmid with the best silence of YWHAE was selected, then YWHAE gene with point mutation was constructed by overlap-extension PCR, and cloned into pcDNA3.1/myc-His(-)A vector. The pcDNA3.1-myc-YWHAEm was transfected into AGS cells with the best silence of YWHAE, then re-expression of YWHAE was detected by Western-blot. MTS assay was used to detect the proliferation of AGS cells. Results Among the five packaged lentivirus, the pLL3.7-siYWHAE-5 lentivirus were selected with the best effect. The relative level of YWHAE protein expression [(0.269±0.0 83)-fold] of AGS cells infected with the selected virus was significantly lower than that of AGS cells infected with the pLL3.7-siNC lentivirus. After pcDNA3.1-myc-YWHAEm was transfected into the AGS cells with the best silence of YWHAE, however YWHAE protein expression were re-established. Compared to negative control group (infected with NC-shRNA lentivirus), cell proliferation in YWHAE-shRNA group was significantly inhibited. Conclusion The recombinant shRNA lentivirus targeting the YWHAE gene was constructed successfully, and the AGS cells with knock-down of YWHAE were obtained. Knocking down YWHAE gene has noticeable effects on the proliferation inhibition of AGS cells, which implies YWHAE may be a putative oncoprotein in AGS cells.

lentivirus; RNA interference; stomach neoplasms; cell proliferation

2017-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271784)；福建省教育廳項(xiàng)目(JA12150)；福建醫(yī)科大學(xué)重大科研項(xiàng)目基金(09ZD018)；福建醫(yī)科大學(xué)苗圃科研基金(2010MP029)

福建醫(yī)科大學(xué) 消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省腫瘤微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122

張曉艷，女，講師，醫(yī)學(xué)博士

佘菲菲. Email: shefeifei@yeah.net

R394.2； R735.2

A

1672-4194(2017)03-0139-07