尹利方，陳澤斌,2*，夏體淵**，靳 松，李育川，任 禛，張瑜瑜，李靜雯

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650214)

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不同培養(yǎng)條件對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖生長的影響

尹利方1，陳澤斌1,2*，夏體淵1**，靳 松1，李育川1，任 禛1，張瑜瑜1，李靜雯1

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650214)

【目的】加快藍(lán)莓品種“康維爾”組培苗快繁速度。【方法】以“康維爾”莖段為外植體，研究了不同pH梯度、不同蔗糖濃度梯度以及3種結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞分裂素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖的影響?！窘Y(jié)果】pH 6.0時(shí)的鮮重和增殖系數(shù)都最高，說明藍(lán)莓品種“康維爾”最適宜的酸堿度為6.0；當(dāng)蔗糖濃度為25 g/L時(shí)，試管苗鮮重達(dá)到最大值，不再隨蔗糖濃度增加而增加，蔗糖濃度25～30 g/L的增殖系數(shù)和苗高都無顯著差異，因此出于成本的考慮，可選擇25 g/L作為生產(chǎn)上使用的蔗糖濃度；使用反玉米素核苷的試管苗無論是在鮮重、增殖系數(shù)和苗高都明顯高于反玉米素和玉米素，且使用反玉米素核苷的成本更低?！窘Y(jié)論】藍(lán)莓“康維爾”試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基：LM基本培養(yǎng)基 + 25 g/L蔗糖 + 1 mg/L反玉米素核苷，pH 6.0。

藍(lán)莓；組織培養(yǎng)；增殖

【研究意義】藍(lán)莓，又稱越桔或藍(lán)漿果，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)植物，多年生落葉或常綠灌木，原產(chǎn)于北美。全世界約400個(gè)種，中國藍(lán)莓栽培起步較晚，自20世紀(jì)80年代初，有關(guān)單位先后從國外引進(jìn)100多個(gè)藍(lán)莓品種，并進(jìn)行了栽培和育苗研究，分為兔眼藍(lán)莓、高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓3個(gè)類別，主要分布于東北和西南地區(qū)[1]。藍(lán)莓果中含有花色素苷、黃酮等多種多酚類生理活性物成分，聯(lián)合國糧農(nóng)組織將藍(lán)莓列為人類五大健康食品之一[2-3]。藍(lán)莓的常規(guī)繁殖方法較多，有種子育苗、綠枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等，但繁殖系數(shù)低，生長速度慢，品種易退化?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用組織培養(yǎng)的方法可以在短期內(nèi)大大提高繁殖系數(shù)，縮短繁殖時(shí)間，并且可以保持品種的優(yōu)良特性，現(xiàn)己成為近年來眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一[4-10]。目前藍(lán)莓離體快繁技術(shù)已較為成熟，但藍(lán)莓品種繁多且更新?lián)Q代較快，已發(fā)現(xiàn)不同基因型藍(lán)莓品種對(duì)培養(yǎng)條件的要求不同，培養(yǎng)條件不同，培養(yǎng)獲得的試管苗的健壯程度及增殖倍數(shù)有所不同[11-13]。饒寶蓉[11]研究發(fā)現(xiàn)改良WPM培養(yǎng)基 + ZT 1.25 mg/L + 蔗糖40 g/L + 卡拉膠6.5 g/L，pH 5.2的培養(yǎng)條件下，藍(lán)莓“夏普藍(lán)”組培苗叢生芽分化效果最佳；李麗容[12]研究發(fā)現(xiàn)兔眼藍(lán)莓增殖培養(yǎng)以WPM培養(yǎng)基 + ZT 1.0～1.5 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂6.8 g/L，pH 5.0～5.2的培養(yǎng)基效果較好；廉家盛[13]研究認(rèn)為B5培養(yǎng)基 + ZT 1.25 mg/L + 蔗糖30 g/L + 瓊脂7.0 g/L，pH 5.4時(shí)藍(lán)莓“美登”分化的芽數(shù)最多?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于結(jié)構(gòu)相似的分裂素在組培中的應(yīng)用效果研究鮮見報(bào)道，國內(nèi)唯有張力思[14]研究認(rèn)為，WPM培養(yǎng)基添加玉米素增殖效率略高，添加反玉米素居中，而添加反玉米素核苷相對(duì)較低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，藍(lán)莓品種間的差異較大，“塞艾羅”增殖系數(shù)較高，“喬治亞姆”較低?！翱稻S爾(Coville)”是昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院與北京農(nóng)學(xué)院合作開展藍(lán)莓試管苗工廠化生產(chǎn)的品種，關(guān)于該品種藍(lán)莓組培快繁體系的研究目前尚未見報(bào)告。前期已優(yōu)選出最佳培養(yǎng)基LM[15]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率，并降低生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)增殖培養(yǎng)藍(lán)莓品種“康維爾”試管苗的帶葉莖段，比較了不同pH梯度、不同蔗糖濃度梯度以及3種結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞分裂素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖的影響，試圖優(yōu)選出適于“康維爾”試管苗增殖的條件，推動(dòng)“康維爾”試管苗的大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究3種細(xì)胞分裂素的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藍(lán)莓品種及增殖培養(yǎng)基

藍(lán)莓品種“康維爾(Coville)”試管苗由云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。以帶葉莖段作為繼代培養(yǎng)的無性繁殖材料，LM基本培養(yǎng)基由昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院和北京農(nóng)學(xué)院共同研制[15]，成分見表1。

1.2 不同pH對(duì)試管苗增殖生長的影響

LM培養(yǎng)基配制好后添加玉米素(Zeatin)1 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂6.2 g/L，pH分別調(diào)至6.0、5.5、5.0、4.5，培養(yǎng)基在121 ℃、131 kPa的條件下滅菌20 min。

1.3 不同蔗糖濃度對(duì)試管苗增殖生長的影響

LM培養(yǎng)基配制好后添加玉米素(Zeatin)1 mg/L、蔗糖濃度分別添加至30、25、20、15 g/L、瓊脂6.2 g/L，pH調(diào)至5.5，按1.2方法滅菌。

1.4 不同細(xì)胞分裂素對(duì)試管苗增殖生長的影響

LM培養(yǎng)基配制好后分別添加玉米素(Zeatin)、反玉米素(Trans-Zeatin)、反玉米素核苷(Trans-zeatin Riboside)1 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂6.2 g/L，pH調(diào)至5.5，按1.2方法滅菌。

1.5 增殖培養(yǎng)

無菌條件下將同代生長情況整齊一致的“康維爾”組培苗叢生芽切成2 cm的帶葉莖段，分別接入1.2、1.3、1.4的培養(yǎng)基，每處理接種25瓶，每瓶接種6個(gè)莖段，每5瓶為1個(gè)重復(fù)，每處理重復(fù)5次。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強(qiáng)度3000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。在第30天時(shí)調(diào)查每處理的鮮重、增殖系數(shù)、苗高，并以單株為單位統(tǒng)計(jì)。增殖系數(shù)=新枝總數(shù)(≥2 cm)/接種莖段數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用WPS表格軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本整理，采用DPS 6.50統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對(duì)試管苗增殖生長的影響

由表2可見，在pH 4.5～6.0時(shí)，試管苗的鮮重及增殖系數(shù)都隨著pH的升高而升高，其中pH 6.0的鮮重和增殖系數(shù)都最高，但與pH 5.5的鮮重及增殖系數(shù)無顯著差異，pH 5.5與pH 5.0的鮮重及增殖系數(shù)無顯著差異，pH 4.5的鮮重及增殖系數(shù)最低，與其他pH相比差異顯著；苗高隨著pH的升高而升高，但處理間差異不顯著；說明在pH 4.5～6.0時(shí)，不同酸堿度的培養(yǎng)基對(duì)苗高的影響不大。

2.2 不同蔗糖濃度對(duì)試管苗增殖生長的影響

由表3可見，在蔗糖濃度15～25 g/L時(shí)，鮮重隨著蔗糖濃度的增加而增加，當(dāng)蔗糖濃度為25 g/L時(shí)，鮮重達(dá)到最大值，不再隨蔗糖濃度增加而增加，且與蔗糖濃度30 g/L的鮮重?zé)o顯著差異；在蔗糖濃度15～30 g/L時(shí)，增殖系數(shù)隨著蔗糖濃度的升高而升高，但20、25、30 g/L之間的增殖系數(shù)無顯著差異，15 g/L的增殖系數(shù)最低，與其他蔗糖濃度的增殖系數(shù)差異顯著；苗高隨蔗糖濃度的升高而增加，25和30 g/L的苗高無顯著差異。

2.3 不同細(xì)胞分裂素對(duì)試管苗增殖生長的影響

由表4可知，使用反玉米素核苷的試管苗鮮重、增值系數(shù)和苗高都最大，與使用玉米素和反玉米素的試管苗相比差異顯著；使用玉米素的試管苗鮮重、增值系數(shù)和苗高都略低于反玉米素處理，兩處理間鮮重、增值系數(shù)和苗高無顯著差異。

表1 LM培養(yǎng)基配方

2.4 添加不同細(xì)胞分裂素的成本核算

不同細(xì)胞分裂素購于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，品牌都為Ruibio，級(jí)別都為高純級(jí)，由表5可看出雖然每25 mg反玉米素核苷的價(jià)格相對(duì)玉米素、反玉米素高了19.00元，但由于使用反玉米素核苷的試管苗增值系數(shù)高，所以每增殖培養(yǎng)1株的成本為0.0024元，比使用玉米素和反玉米素的成本都低。

表2 不同pH對(duì)試管苗鮮重、增殖系數(shù)和苗高的影響

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在α=0.05水平上差異顯著，下同。

Notes: Values followed by the different letter are significantly different (α= 0.05) on the basis of Duncan’s multiple range test. The same as below.

表3 不同蔗糖濃度對(duì)試管苗鮮重、增殖系數(shù)和苗高的影響

表4 不同細(xì)胞分裂素對(duì)試管苗鮮重、增殖系數(shù)和苗高的影響

表5 增殖培養(yǎng)基中添加不同細(xì)胞分裂素的成本

3 討 論

在植物離體快繁中，pH、蔗糖濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，以及培養(yǎng)基的組成都會(huì)影響組培苗的生長與分化。藍(lán)莓離體莖段發(fā)生的不定芽增殖率與培養(yǎng)基中添加的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度密切相關(guān)。從不同pH對(duì)試管苗增殖生長的影響來看，試管苗的鮮重及增殖系數(shù)都隨著pH的升高而升高，其中pH 6.0的鮮重和增殖系數(shù)都最高，說明pH 6.0是藍(lán)莓品種“康維爾”組培最適宜的酸堿度。

在植物組織培養(yǎng)中，糖類不僅為培養(yǎng)物提供能量，而且是培養(yǎng)物滲透環(huán)境的主要調(diào)節(jié)者。器官的發(fā)生是一個(gè)需要高能的過程。因此，在培養(yǎng)基中不斷提供糖源是不定芽形成所必需的。一般比較常用的作為碳源的糖種類主要有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等，其中蔗糖一直被廣泛應(yīng)用，作為標(biāo)準(zhǔn)碳源。過低或過高的糖濃度，都可能因?yàn)橥庵搀w失水對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生不良影響。因此，糖的種類不僅影響培養(yǎng)物的生長速度和生長量，而且影響代謝水平、次生代謝物合成、以及細(xì)胞的形態(tài)和發(fā)生，是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一。從不同蔗糖濃度對(duì)試管苗增殖生長的影響來看，當(dāng)蔗糖濃度為25 g/L時(shí)，鮮重達(dá)到最大值，不再隨蔗糖濃度增加而增加，說明在蔗糖濃度25～30 g/L時(shí)，蔗糖濃度的改變對(duì)鮮重的影響不顯著，而從增殖系數(shù)來看，蔗糖濃度25、30 g/L之間的增殖系數(shù)無顯著差異；從苗高來看，25和30 g/L的苗高無顯著差異，因此出于成本的考慮，可選擇25 g/L作為生產(chǎn)上使用的蔗糖濃度。

植物組織培養(yǎng)過程中所使用的培養(yǎng)基成分對(duì)外植體的影響較大，從理論上來說甚至決定了培養(yǎng)體系建立的成敗[16]，而培養(yǎng)基中所使用的激素種類及濃度是其關(guān)鍵因素。探討不同激素種類、不同濃度及其優(yōu)化組合仍然是植物組織培養(yǎng)工作者們關(guān)注的課題，這對(duì)相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究和生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。3種細(xì)胞分裂素的主要生理功能類似，在植物體內(nèi)的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官分化、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)側(cè)芽的生長等，從不同細(xì)胞分裂素對(duì)試管苗增殖生長的影響來看，使用反玉米素核苷的試管苗無論是在鮮重、增殖系數(shù)和苗高上都要明顯高于反玉米素和玉米素，且使用反玉米素核苷的成本更低，因此在生產(chǎn)上，可考慮使用反玉米素核苷代替玉米素或反玉米素。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)在前期已優(yōu)選出最佳培養(yǎng)基LM的基礎(chǔ)上，增殖培養(yǎng)藍(lán)莓品種“康維爾”試管苗的帶葉莖段，比較了不同pH梯度、不同蔗糖濃度梯度以及3種結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞分裂素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖的影響，認(rèn)為生產(chǎn)中，藍(lán)莓“康維爾”試管苗的最佳增殖培養(yǎng)基：LM基本培養(yǎng)基 + 25 g/L蔗糖 + 1 mg/L反玉米素核苷，pH 6.0。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Effect of Different Culture Conditions on Blueberry Shoot Propagation

YIN Li-fang1, CHEN Ze-bin1,2*, XIA Ti-yuan1**, JIN Song1, LI Yu-chuan1, REN Zhen1, ZHANG Yu-yu1, LI Jing-wen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Key Laboratory of Special Biological Resource Development and Utilization of Universities in Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China)

【Objective】 The objective of this study is to establish a high efficient rapid propagation of tissue culture seeding of blueberry ‘Coville’. 【Method】 The effects on proliferation of blueberry plantlet in vitro of different pH-gradients, different sucrose concentration and three structurally similar kinds of cytokinin were studied. 【Result】 The fresh weight and the proliferation coefficient of pH 6.0 were the highest, which meant the most suitable pH value of ‘Coville’ was 6.0. When the sucrose concentration was 25 g/L, the fresh weight reached a maximum which didn’t increase with the increase of sucrose concentration any more. The proliferation coefficient and the fresh weight had no significant differences when the sucrose concentration was between 25-30 g/L. Using trans-zeatin riboside could get higher proliferation coefficient, fresh weight and seedling height than using zeatin and trans-zeatin, and the cost of using trans-zeatin riboside was lower than the others.【Conclusion】The optimum medium for the multiplication of plantlet of blueberry ‘Coville’: LM basic medium + sucrose 25 g/L + trans-zeatin riboside 1 mg/L, pH 6.0.

Blueberry; Tissue culture; Propagation

1001-4829(2017)7-1642-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.030

2016-09-10

云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(TSNY0201)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2014Y390)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2013FD040)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(YJL14005)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)基金項(xiàng)目(YJL12010)；昆明學(xué)院校立重點(diǎn)基金項(xiàng)目(XJL12020)；昆明學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目(XJD16081)；云南中煙品牌省內(nèi)原料產(chǎn)地生態(tài)與主栽品種合理布局研究項(xiàng)目；云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項(xiàng)目資助(05000511311)；云南省特色生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(GXKJ201621)；昆明市農(nóng)業(yè)局滇池流域農(nóng)業(yè)面源污染綜合防控對(duì)策研究(2016JC01)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，碩士，講師，主要從事都市農(nóng)業(yè)的教學(xué)科研工作，E-mail: 563454379@qq.com,*為共同第一作者，E-mail: zbchenkmu@163.com,**為通訊作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

S663.9

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