趙艷紅，呂 芳，潘孝青，鄧碧華，3，張金秋，3，盧 宇，3*，侯繼波，3*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心, 江蘇 南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

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鴨病毒性肝炎活疫苗的耐熱凍干工藝策略設(shè)計

趙艷紅1，呂 芳1，潘孝青2，鄧碧華1，3，張金秋1，3，盧 宇1，3*，侯繼波1，3*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心, 江蘇 南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

【目的】為了提高鴨病毒性肝炎弱毒(DHV)活疫苗的耐熱性能。【方法】選用蔗糖、普魯蘭糖、明膠、甘油、磷酸鹽等成分設(shè)計耐熱保護(hù)劑組方，根據(jù)配方的共晶點、塌陷溫度科學(xué)設(shè)計凍干程序，并比較了不同預(yù)凍方式對鴨病毒性肝炎活疫苗的效價影響?！窘Y(jié)果】耐熱保護(hù)劑配方A在37 ℃10 d、15 d病毒損失分別為0.35、0.61 Lg；對快凍、慢凍以及退火3種不同的凍干方式進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對鴨肝炎病毒耐熱損失由大到小依次為：退火>慢凍>快凍；疫苗長期保存期試驗結(jié)果表明，可在2～8 ℃可保存2年；采用10倍劑量免疫2日齡雛鴨均未出現(xiàn)死亡，且精神飲食體重增長均正常?！窘Y(jié)論】采用A配方與快速凍干凍方式的耐熱性能最好，延長保存期并且提高了耐熱性能，為動物疫苗耐熱新劑型的研發(fā)提供技術(shù)支撐。

鴨肝炎病毒；耐熱保護(hù)劑；凍干工藝；耐老化試驗

【研究意義】鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DHV)是由鴨肝炎病毒((Duck Viral Hepatitis，DHV；屬于小核糖核酸病毒)引起的雛鴨的一種以肝臟出血性炎癥為特征的急性、烈性、高度致死性傳染病。臨床表現(xiàn)為痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀，以肝臟腫脹、出血為特征性病變。雛鴨感染后的死亡率可達(dá)90 %～95 %，該病是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)DHV免疫鴨群爆發(fā)鴨肝炎的報道，嚴(yán)重制約了養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展[2]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE，1996)已將其劃為B類傳染病[1]。目前對該病的防控主要以疫苗接種為主[3]，但鴨肝炎病毒屬于小RNA病毒，無脂蛋白包膜，一般不耐受冷凍干燥[4]，所以鴨病毒性肝炎活疫苗在2～8 ℃條件下的保存期只有3～6個月，大多需要在-15 ℃以下保存[5]。疫苗耐熱性能差，使得免疫效果大大降低?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】長期以來，國內(nèi)的獸用活疫苗大多采用傳統(tǒng)的凍干工藝制備，國內(nèi)主要采用蔗糖、明膠、脫脂乳等簡單的組方，凍干的疫苗大多在-15 ℃以下儲存；國外采用低聚糖、多元醇、蛋白、抗氧化劑、緩沖劑、填充劑等復(fù)合組方配伍而成，制備的凍干疫苗2～8 ℃可保存2年[6]。近年來，國內(nèi)很多致力于疫苗制造技術(shù)的研究人員主要集中在耐熱保護(hù)劑配伍和篩選研究上，例如陳生雷[7]成功篩選出以PVP K30、山梨醇、乳酸鈣和硫脲為主要成分的耐熱保護(hù)劑，對雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(La Sota株+H120株)有較好的耐熱效果，37 ℃保存10 d病毒含量下降0.4個滴度；王穎[8]用響應(yīng)面法優(yōu)化豬偽狂犬病毒耐熱保護(hù)劑最優(yōu)配方為谷氨酸鈉2 %、L-精氨酸鹽酸鹽2 %、D-山梨醇2 %、酶解酪蛋白7.6 %、海藻糖1 %、明膠4 %、蔗糖15.2 %、牛血清白蛋白2 %。但是對于疫苗凍干工藝的研究鮮有報道。事實上，盡管凍干技術(shù)應(yīng)用廣泛歷史悠久，但在實際凍干中，仍然依賴于人員技術(shù)能力和經(jīng)驗[9]。耐熱保護(hù)劑和凍干程序是相互配套的工藝，預(yù)凍方式、預(yù)凍溫度和干燥溫度的不合理，容易導(dǎo)致凍干制品凍形不合格，例如塌陷、萎縮、熔融等，甚至大大降低凍干疫苗的效價[10]。在藥物制劑領(lǐng)域，早已有根據(jù)藥品的熱參數(shù)來確定預(yù)凍溫度和干燥溫度，再進(jìn)一步科學(xué)優(yōu)化凍干程序的策略?！颈狙芯壳腥朦c】因此，本研究針對目前國內(nèi)鴨肝炎活疫苗耐熱性能差的問題，以蔗糖、普魯蘭糖、明膠、甘油、磷酸鹽等成分設(shè)計耐熱保護(hù)劑組方，根據(jù)配方的共晶點、塌陷溫度科學(xué)設(shè)計凍干程序，以37 ℃加速耐老化試驗、殘余水分為篩選指標(biāo)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】獲得耐熱性能好的組方與凍干工藝，以期為動物疫苗耐熱新劑型的研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

毒株：本實驗室鄧碧華自行分離并鑒定的鴨病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株(微生物保藏號：CGMCC NO. 8159)[11]。

鴨胚：用于本試驗的11～12日齡鴨胚和1～7日齡雛鴨來源于無鴨肝炎病史、DHV 抗體效價陰性的健康種鴨群，品種為櫻桃谷鴨。

蔗糖、普魯蘭糖、明膠、甘油、磷酸鹽等(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，DHV液由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心自行分離[8]；2日齡雛鴨來源于無鴨肝炎病史、DHV抗體效價陰性的健康種鴨群，品種為櫻桃鴨。

1.2 儀器

0.15 m2冷凍干燥機(jī)(美國VirTis，型號Advantage Plus)、DSC熱分析儀(美國PerKinElmer公司)、低溫凍干顯微鏡(型號FDCS196，英國林肯)、37 ℃恒溫干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、2～8 ℃冷藏冰箱(中國，Haier)、磁力攪拌器(金壇榮華儀器制造有限公司)。

1.3 鴨病毒性肝炎病毒液的制備

按照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行：取鴨病毒性肝炎病毒1型的病毒樣本，用滅菌生理鹽水做100倍稀釋，接種11～13日齡鴨胚，每胚0.2 mL，封孔后，37 ℃培養(yǎng)，棄去24 h內(nèi)死亡的鴨胚，培養(yǎng)96 h后，收取尿囊液和胚體。將胚體去除膽囊，均質(zhì)后與尿囊液混合，作為鴨病毒性肝炎病毒液。

1.4 鴨病毒性肝炎耐熱保護(hù)劑活疫苗具體制備方法

用蔗糖、普魯蘭糖、明膠、甘油和磷酸鹽等成分，按照不同比例組成3組保護(hù)劑A、B、C。其中，不耐熱成分采用過濾除菌方法，耐熱成分采用高溫高壓滅菌方法[10]。將3種保護(hù)劑與鴨病毒性肝炎病毒液按照體積比為1∶1混合，分裝至7 mL西林瓶中，1 mL/瓶，用丁基膠塞半加塞后，置入凍干機(jī)箱體內(nèi)并進(jìn)行冷凍干燥，通過凍形、色澤、質(zhì)地、水分含量、真空度、凍干前后病毒損失等指標(biāo)的比較進(jìn)行耐熱保護(hù)劑的初步篩選。

1.5 加速熱穩(wěn)定性試驗

將凍干品分別置37 ℃ 10、15 d，觀察其外形, 測定疫苗病毒效價ELD50以及疫苗殘余水分、真空度(具體方法參考文獻(xiàn)[13])，以病毒滴度下降差值≤1.0 Lg為判定標(biāo)準(zhǔn)篩選配方[14]。

1.6 耐熱配方熱參數(shù)的測定

將1.4方法中凍干的成品疫苗，經(jīng)1.5加速熱穩(wěn)定試驗進(jìn)行篩選，確定耐熱性能較好的一組配方，對其進(jìn)行共晶點、塌陷溫度的測定。共晶點采用電阻法，塌陷溫度采用低溫凍干顯微鏡測定，檢測條件為：Temp-40 ℃，Vac 20.0 Pa，Ramp Row 3 Rate 3 ℃/min，Limit -40 ℃。具體由山東新華醫(yī)療器械股份有限公司進(jìn)行檢測。

1.7 疫苗凍干程序的篩選

根據(jù)1.6測定的耐熱配方熱參數(shù)，確定預(yù)凍溫度以及主干燥溫度；并設(shè)計快速冷凍、慢速冷凍以及退火3種方式對鴨病毒性肝炎耐熱疫苗進(jìn)行凍干，采用1.5方法篩選最佳的凍干程序。

1.8 鴨病毒性肝炎耐熱活疫苗的保存期測定

將耐老化實驗篩選得到的凍干疫苗制備3批次，將凍干疫苗于2～8 ℃、37 ℃條件下保存，在不同時間點取出測定其ELD50，以保存期內(nèi)病毒滴度下降1.0 Lg為判定終點，得到耐熱凍干保護(hù)劑疫苗在不同溫度下的保存期[14]。

1.9 鴨病毒性肝炎耐熱活疫苗安全性檢驗

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]所述方法進(jìn)行。選用2日齡雛鴨，實驗組取鴨病毒性肝炎耐熱活疫苗疫苗分別經(jīng)過滴鼻/點眼、肌肉注射2種途徑進(jìn)行免疫(10個使用劑量)，每組20只，對照組不免疫。接種后隔離觀察14 d，主要觀察疫苗接種后雛鴨的精神、采食、飲水、生長、增重等臨床情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHV耐熱保護(hù)劑篩選

2.1.1 3組配方的篩選 用含蔗糖、普魯蘭糖、明膠、甘油和磷酸鹽等成分配伍的3組耐熱保護(hù)劑配方A、B、C與鴨肝炎病毒混合凍干后，疫苗置于37 ℃進(jìn)行加速耐老化試驗，結(jié)果表明，A、B、C 3組配方制備的冷凍干燥疫苗在37 ℃保存10、15 d后，病毒滴度損失均小于1.0 Lg，但其中保護(hù)劑A滴度損失最小，10、15 d病毒損失分別為0.35、0.61 Lg。因此選定保護(hù)劑A為鴨病毒性肝炎活疫苗的耐熱保護(hù)劑進(jìn)行相關(guān)試驗(圖1)。

2.1.2 耐熱凍干保護(hù)劑最佳pH值篩選 試驗參照相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]考慮不同pH值對鴨肝炎病毒會產(chǎn)生影響，因此選取一定的pH值，對耐熱凍干保護(hù)劑A進(jìn)行適合DHV最佳pH值的篩選，ELD50測定結(jié)果見表1, 通過不同pH值的對比試驗結(jié)果顯示，當(dāng)保護(hù)劑pH為6.7時病毒的耐熱損失最低，為0.42 Lg，因此確定耐熱保護(hù)劑A的pH值6.7為最佳。

圖1 37 ℃保存期樣品耐老化損失Fig.1 The aging loss of the sample at 37 ℃ aging loss

2.2 耐熱配方熱參數(shù)測定

根據(jù)2.1中篩選出耐熱性能較好配方A，對其進(jìn)行熱參數(shù)測定。結(jié)果表明，配方A共晶點為-25.4 ℃，塌陷溫度-36.6 ℃(表2)。

2.3 疫苗凍干程序的設(shè)計和篩選

根據(jù)凍干程序設(shè)計原則[18]，提示在預(yù)凍時樣品溫度需低于共晶點以下8～10 ℃方能完全凍實，主干燥溫度不能超過塌陷溫度樣品才能保持良好的凍形，根據(jù)2.2測定的結(jié)果，設(shè)定預(yù)凍溫度為-42 ℃、主干燥溫度為-25 ℃。分別采用快速冷凍Cycle 1、慢速冷凍Cycle 2以及退火Cycle 3種方式對配方A進(jìn)行凍干(圖2)，凍干全程時長為40～42 h。

采用3種凍干程序凍干后，觀察疫苗外觀(圖3)，發(fā)現(xiàn)快凍和退火方式疫苗外觀為干燥的圓餅狀，而慢凍方式凍干后疫苗有皺縮。將疫苗置于37 ℃保存10 d進(jìn)行加速熱穩(wěn)定性評價(圖4)。結(jié)果表明，3種凍干方式后疫苗耐熱損失均小于1.0 Lg，其中快凍程序Cycle 1耐熱損失最小為0.35 Lg，而退火程序Cycle 3產(chǎn)生的耐熱損失最大為1.0 Lg；采用慢凍程序Cycle 2耐熱損失居中0.88 Lg。綜合疫苗外觀以及耐熱性能，選擇耐熱損失最小的快凍方式(Cycle 1)作為配方A的干燥程序。

表1 保護(hù)劑最佳pH值對比試驗結(jié)果

表2 配方A的熱參數(shù)

Cycle 1-快凍(隔板提前預(yù)冷至-42 ℃后樣品進(jìn)倉)；Cycle 2-慢凍(隔板預(yù)冷4 ℃，樣品進(jìn)倉后在150 min內(nèi)緩慢降溫至-42 ℃)；Cycle 3-退火(樣品快凍后升溫至-25 ℃維持60 min后再降溫至-42 ℃凍實)圖2 3種不同預(yù)凍方式的凍干曲線Fig.2 The cycles of three different freeze drying

2.4 耐熱凍干保護(hù)劑產(chǎn)品的相關(guān)理化檢驗結(jié)果

將篩選后的保護(hù)劑A(pH 6.7)與鴨肝炎病毒混勻后按照優(yōu)化最佳工藝Cycle 1重復(fù)凍干3批次，并檢驗3批次疫苗的物理性狀、真空度檢測、凍干剩余水測定結(jié)果均符合《中華人民共和國獸藥典》[19](表3)。

2.5 鴨病毒性肝炎耐熱活疫苗保存期測定

將2.4中重復(fù)凍干的3批次疫苗于2～8 ℃進(jìn)行長期保存，分別在保存第3、6、9、12、18、24個月測定疫苗效價(圖5)，并以病毒滴度損失1.0 Lg作為疫苗的保存終點。鴨病毒性肝炎活疫苗A 3批次在2～8 ℃保存24個月病毒含量損失為0.53～0.61 Lg，有效保護(hù)了鴨病毒性肝炎病毒的損失。

2.6 鴨病毒性肝炎耐熱活疫苗的安全性

取耐熱凍干保護(hù)劑疫苗A進(jìn)行安全性動物試驗:試驗共分為3組,免疫后，隔離觀察14 d,主要觀察疫苗接種后雛鴨的精神、采食、飲水、生長、增重等臨床情況, 如表4可見：大劑量(10倍推薦免疫劑量)分2種免疫途徑注射免疫后鴨只無死亡；對照組與免疫組相比，鴨只增重差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同凍干程序凍干后疫苗外觀Fig.3 The appearance after freeze drying by cycle 1-cycle 3

疫苗凍干批次Vaccinebatchlots物理性狀Physicalproperties殘余水份Remainingmoisture(﹤4%，n=4)真空度Thedegreeofvacuum批次1Batch11．66±0．08合格Compliance批次2Batch2疏松海綿狀，易于脫壁，加稀釋液后迅速溶解，溶解后呈淡粉紅色液體Loosespongy，easyoffthewall，plusDissolverapidlyafterdilution，dissolvedwaspalepinkliquid1．71±0．02合格Compliance批次3Batch31．56±0．06合格Compliance

表4 耐熱凍干保護(hù)劑的安全性動物試驗

注：“a”表示差異不顯著。

圖4 鴨肝炎疫苗不同預(yù)凍方式凍干后37 ℃10 d耐熱損失Fig.4 The DHV vaccine titer loss of different freeze drying cycles

圖5 鴨病毒性肝炎活疫苗2～8 ℃保存期測定Fig.5 Storage stability for DHV vaccine stored at 2-8 ℃

3 討 論

耐熱凍干保護(hù)劑比常規(guī)凍干保護(hù)劑更周到地考慮了具有生物活性的制品在較高溫度和較長保存時間的情況下，凍干物質(zhì)可能產(chǎn)生的物理和化學(xué)變化對活疫苗存活的影響。因此耐熱凍干保護(hù)劑的組成配方和比例與凍干曲線選擇對于凍干活疫苗的質(zhì)量相當(dāng)重要，根據(jù)凍干保護(hù)劑的種類和作用機(jī)制[20]，在保護(hù)劑篩選，選擇了蔗糖、普魯蘭糖、明膠、甘油等幾類物質(zhì)作為保護(hù)劑的主要成分。蔗糖、甘油在保護(hù)劑中作為防凍劑，主要是防止和減少冷凍過程結(jié)晶水的形成；普魯蘭糖具有較好的耐熱性能，選擇普魯蘭糖作為穩(wěn)定劑能夠較好的解決鴨肝炎病毒不耐熱的情況；明膠作為賦形劑，能防止有效物質(zhì)隨水蒸氣一起升華，賦予產(chǎn)品一定外型；雖然試驗中保護(hù)劑的最佳pH值為6.7時病毒滴度損失最低,但對凍干過程的影響還需進(jìn)一步的深入研究。

凍干工藝往往是獸用疫苗中容易忽略的環(huán)節(jié)。在制定凍干曲線時，應(yīng)充分考慮耐熱疫苗的共晶點、塌陷溫度等熱參數(shù)，然后進(jìn)行科學(xué)合理的設(shè)計凍干程序。此外，預(yù)凍方式不同、冰晶顆粒的大小對微生物的機(jī)械性損傷程度也不同，快速冷凍會形成細(xì)小的冰晶顆粒，慢速冷凍形成大冰晶，退火則會使制品二次結(jié)晶并提高凍干制品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[21]。因此，本研究通過測定配方的熱參數(shù)進(jìn)行科學(xué)設(shè)計凍干曲線，同時考慮不同的預(yù)凍方式對病毒產(chǎn)生的不同影響，嘗試了快凍、慢凍和退火3種凍干工藝，采用快凍凍干的疫苗耐熱性能最好，而慢凍以及退火的疫苗耐熱性能均較大，其原因可能是快速冷凍產(chǎn)生的冰晶顆粒小，對病毒的機(jī)械性損傷小，而慢凍形成的大冰晶對病毒的損傷大，退火過程中由于二次結(jié)晶導(dǎo)致熔融，對病毒的機(jī)械性損傷更大。

鴨病毒性肝炎活疫苗3批次凍干產(chǎn)品于2～8 ℃保存不同時間并測定其物理性狀、真空度、剩余水分以及病毒損失，結(jié)果表明，在2～8 ℃條件下可以保存24個月且病毒損失僅在0.53～0.61 Lg，重復(fù)性好；37 ℃保存15 d加速耐老化試驗表明，病毒損失僅0.61 Lg；通過滴鼻/點眼、肌肉注射對2日齡雛鴨接種10個劑量疫苗后14 d鴨只均安全。本研究較好地解決了鴨肝炎病毒耐熱保護(hù)劑以及配套的凍干工藝科學(xué)設(shè)計的問題，優(yōu)化了預(yù)凍方式，為獸用耐熱活疫苗冷凍干燥工藝的科學(xué)設(shè)計提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

本研究通過配方篩選、緩沖液不同pH值對比確定保護(hù)劑A與快速凍干方式為鴨病毒性肝炎病毒的最佳保護(hù)與凍干工藝；能使鴨病毒性肝炎活疫苗在2～8 ℃條件下可以保存24個月；且37 ℃保存15 d病毒損失僅在0.53～0.61 Lg；較好地解決了鴨肝炎病毒耐熱保護(hù)劑以及配套的凍干工藝科學(xué)設(shè)計的問題，優(yōu)化了預(yù)凍方式，為獸用耐熱活疫苗冷凍干燥工藝的科學(xué)設(shè)計提供了重要的數(shù)據(jù)支持。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Heat Resistant Formulation Screening and Freeze-drying ProcessStrategy Design of Duck Virus Hepatitis Vaccine

ZHAO Yan-hong1, LV Fang1,PAN Xiao-qing2,DENG Bi-hua1，3, ZHANG Jin-qiu1，3,LU Yu1，3*, HOU Ji-bo1，3*

(1. National Research Center of Veterinary Biologicals Engineering and Technology, Jiangsu academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Nanjing 210014，China; 2. Livestock Research Institute ,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Nanjing 210014，China; 3.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Jiangsu Yangzhou 225009，China)

【Objective】In order to improve the heat resistance of attenuated DHV (DHV) live vaccine.【Method】Selection sucrose, pullulan, gelatin, glycerin, phosphates and other ingredients designed heat-protective agent prescriptions, according to the eutectic point formula, the collapse temperature of the scientific design lyophilization process, and compared the potency of the effects of different ways of pre-frozen duck hepatitis vaccine live.【Result】A better heat protection formulations heat resistance, 37 ℃ 10d, 15 d, respectively, for the viral loss 0.35Lg, 0.61Lg; For quick freezing, slow freezing and freeze-drying annealing three different ways to compare, find the heat loss duck hepatitis virus descending order: Annealing> slow freezing> Fast freeze; Vaccine trial results showed that long-term storage, can be stored at 2-8 ℃ 2 years; 10-fold dose of 2-day-old ducklings were not immune of death, and spiritual diet weight gain were normal, living proof of duck hepatitis heat ducklings safe vaccine, no side effects. 【Conclusion】The use of A formula and the rapid freeze-drying method of the best heat resistance, extend the shelf life and improve the heat resistance for animal vaccine heat the development of new formulations to provide technical support.

DHV; Heat-protective agent; Freeze-drying；Aging test

1001-4829(2017)7-1680-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.038

2016-08-17

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[cx(14)2085]；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303046)

趙艷紅(1987-)，女，碩士研究生，研究方向獸用疫苗耐熱新劑型, E-mail：18260080269@163.com，*為通訊作者：盧 宇，E-mail：luyu@jaas.ac.cn。

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